亚细胞定位之烟草转化方法
烟草转化及CoIP方法
CoIP protocol From Guo Siyi烟草转化体系将含有正确构建质粒的阳性农杆菌克隆在YEB 液体培养基中培养过夜，到OD600 约 1.5 左右（大约20h），同时摇菌P19，它能有效抑制植物对外源导入载体表达的沉默效应，提高表达量。
然后收集菌体，5000 rpm 5min 常温离心，将菌体用侵染缓冲液（10 mM MES，100 μM AS-乙酰丁香酮，50 mM MgCl2）重悬，用紫外分光光度仪测定OD600 值；根据实验要求将含有不同载体组合的菌液混合，同时在每一个组合中也加入P19，最终使得每种菌液成分的OD600 在0.8 左右；然后将混合的菌液在28 ℃下以200 rpm 的转速再培养至少3 h，然后注射合适大小的烟草叶片。
尽可能多的注射烟草叶片，并标记下注射的叶片及对应区域；之后用保鲜膜封闭，在暗中培养2 d，然后再转入光下培养2-3 d，并取材在荧光显微镜下观察GFP 的荧光已确定烟草叶片中外源载体的表达情况，视情况取材做后续的实验。
免疫共沉淀（CoIP）将VER2，TaGRP2 与不同的标签蛋白融合如FLAG-VER2，TaGRP2-GFP，将该载体转化农杆菌获得阳性克隆，然后共同用农杆菌侵染的方法转化烟草。
至少设定两组样品：即FLAG-VER2/TaGRP2-GFP 以及FLAG-VER2/GFP。
检测目的蛋白是否表达：用Bradford 法测定提取蛋白的浓度，然后用SDS-PAGE 分离蛋白（15-30 μg protein/lane）做Western Blot 用（WB）标签抗体FLAG，GFP 检测融合蛋白是否在烟草中表达。
并根据WB 的结果估算实验组（FLAG-VER2/TaGRP2-GFP）与对照组（FLAG-VER2/GFP）的蛋白相对表达量。
Pre-clear：（所有步骤尽量在冰上进行）取两份30 μL protein A/G beads 到EP 管中放于冰上，用600 μL 的蛋白提取buffer 重悬beads，4 ℃离心1000 g 1 min。
烟草转化及CoIP方法
CoIP protocol From Guo Siyi烟草转化体系将含有正确构建质粒的阳性农杆菌克隆在YEB 液体培养基中培养过夜，到OD600 约 1.5 左右（大约20h），同时摇菌P19，它能有效抑制植物对外源导入载体表达的沉默效应，提高表达量。
然后收集菌体，5000 rpm 5min 常温离心，将菌体用侵染缓冲液（10 mM MES，100 μM AS-乙酰丁香酮，50 mM MgCl2）重悬，用紫外分光光度仪测定OD600 值；根据实验要求将含有不同载体组合的菌液混合，同时在每一个组合中也加入P19，最终使得每种菌液成分的OD600 在0.8 左右；然后将混合的菌液在28 ℃下以200 rpm 的转速再培养至少3 h，然后注射合适大小的烟草叶片。
尽可能多的注射烟草叶片，并标记下注射的叶片及对应区域；之后用保鲜膜封闭，在暗中培养2 d，然后再转入光下培养2-3 d，并取材在荧光显微镜下观察GFP 的荧光已确定烟草叶片中外源载体的表达情况，视情况取材做后续的实验。
免疫共沉淀（CoIP）将VER2，TaGRP2 与不同的标签蛋白融合如FLAG-VER2，TaGRP2-GFP，将该载体转化农杆菌获得阳性克隆，然后共同用农杆菌侵染的方法转化烟草。
至少设定两组样品：即FLAG-VER2/TaGRP2-GFP 以及FLAG-VER2/GFP。
检测目的蛋白是否表达：用Bradford 法测定提取蛋白的浓度，然后用SDS-PAGE 分离蛋白（15-30 μg protein/lane）做Western Blot 用（WB）标签抗体FLAG，GFP 检测融合蛋白是否在烟草中表达。
并根据WB 的结果估算实验组（FLAG-VER2/TaGRP2-GFP）与对照组（FLAG-VER2/GFP）的蛋白相对表达量。
Pre-clear：（所有步骤尽量在冰上进行）取两份30 μL protein A/G beads 到EP 管中放于冰上，用600 μL 的蛋白提取buffer 重悬beads，4 ℃离心1000 g 1 min。
烟草瞬时表达步骤 电子版
亚细胞定位准备(用烟草ck)MS无抗培养基倒平皿，铺二层滤纸于培养基上；吸水纸（卫生纸一卷），小滤纸，用10ml 离心管代替打孔器，50ml离心管；小三角瓶（均需要灭菌，115℃，30min）1.将保存的农杆菌划线（kan+rif）,第三天中午挑菌于（kan+rif）LB培养基中28-30℃，摇床20h至第四天早上；2.以1:25比例（1ml接种于25ml）接菌液于25mlLB(含kan+rif，50nmAS)28-30℃，摇床培养至OD=0.6-0.8，约5h。
3.用50mL离心管收集菌体，常温，5000rpm，离心5min,弃上清；4.用以下溶液重悬菌体等体积25ml(10mM MgCL2，10mM MES, 150nM AS)放入小三角瓶，室温下静置活化2h，（铺滤纸于已凝的无抗MS培养基）；5.将叶片打孔，圆状的叶片浸泡在菌液中，真空渗透30min-1h（0.85Mpa）。
6.用灭菌的吸水纸吸干表面的菌液，平铺放置于MS培养基上，光照培养48h。
7.观察。
GUS定量分析所用试剂：1、0.1M磷酸缓冲液）（pH7.0）1M Na2PO4 11.54ml1M NaH2PO4 8.46mlAdd ddH2O TO 200ml2、GUS 蛋白提取液 (现用现配)0.1M磷酸缓冲液（pH7.0） 100ml10% SDS 2ml0.5M EDTA(Ph8.0) 4mlTritonx-100 200ulβ-巯基乙醇 200uladd ddH2O TO 200ml121℃灭菌室温保存3、gus蛋白分析buffer每100ml的蛋白提取液加入4-MUG 70.46mg,-20℃保存，现配现用。
4、0.2M Na2CO3 buffer。
Gus蛋白提取方法（全过程于冰上操作）•取适量烟草叶片，加入适量PVP,加液氮研磨成粉末，取约0.6g装入15ml离心管中•预先加入500ml蛋白提取液，摇匀，在冰上放置置沉淀•4℃，13000prm离心15min.•吸取上清到另一管中进行下一步实验，（未及时做放-20℃）Gus活性测定•取20ul蛋白加入37℃预热的180ulgus 蛋白分析buffer中，37℃温浴。
烟草亚细胞定位
烟草亚细胞定位亚细胞定位是现代生物学研究的重要领域之一。
它通过对细胞内各种分子的运动和分布进行观察和分析，揭示了细胞内分子交互作用的复杂性和多样性。
烟草作为一种常见的植物，也是亚细胞定位研究的重要对象之一。
本文将从烟草亚细胞结构、亚细胞定位技术以及烟草亚细胞定位的研究进展等方面进行探讨。
一、烟草亚细胞结构烟草细胞是一种典型的植物细胞，由细胞质、细胞核、质膜、细胞壁、线粒体、叶绿体、高尔基体、内质网、核糖体和微管等多个不同的结构组成。
其中，细胞核是细胞的重要组成部分，包含着遗传信息和调控机制。
质膜是细胞的外层结构，维持着细胞内外环境的稳定。
细胞壁是细胞的支撑结构，保护细胞不受外界环境的侵害。
线粒体是细胞内能量的主要来源，参与细胞的呼吸作用。
叶绿体是植物细胞的特征性结构，参与光合作用。
高尔基体和内质网是细胞内蛋白质合成和转运的重要场所。
核糖体是细胞内蛋白质合成的基本单位。
微管是细胞内的一种细胞骨架，参与细胞的形态维持和运动。
二、亚细胞定位技术亚细胞定位技术是研究细胞内分子运动和分布的重要手段。
目前常用的亚细胞定位技术主要包括荧光显微镜技术、电子显微镜技术、蛋白质标记技术和基因工程技术等。
其中，荧光显微镜技术是最常用的亚细胞定位技术之一。
它利用荧光染料或荧光蛋白对细胞内分子进行标记，通过荧光显微镜观察细胞内分子的运动和分布。
电子显微镜技术则可以观察到更高分辨率的细胞结构和分子分布。
蛋白质标记技术和基因工程技术则可以对分子进行精确的定位和操作，提高亚细胞定位的精度和可靠性。
三、烟草亚细胞定位研究进展烟草作为一种常见的植物，其亚细胞定位研究也有着广泛的应用和深入的研究。
近年来，烟草亚细胞定位研究主要集中在以下几个方面：1.烟草亚细胞蛋白质定位烟草中有大量的蛋白质参与细胞的生长和发育过程。
通过荧光蛋白标记技术和基因工程技术，可以对这些蛋白质进行定位和操作。
研究表明，烟草细胞质内的微管蛋白可以定位在微管上，参与细胞的形态维持和运动。
烟草转化方法及各类培养基配方
表1 烟草转化中使用培养基Table.1 List of the culture mediums in genetic transformation of tobacco培养基Culture medium 成分ingredientspH值pH继代培养基Subculture medium MS 5.8 共生培养基（To）Symbiotic culture medium MS+2.25mg/L6-BA+0.3mg/LNAA 5.8 筛选培养基（To＋）Sifting medium MS+2.25mg/L6-BA+0.3mg/LNAA+400mg/Lcef+100mg/Lkam 5.8 壮芽培养基（P8＋）Budding selection medium MS+0.1mg/L6-BA+0.01mg/LNAA+400mg/Lcef+100mg/Lkam 5.8 生根培养基（1/2MS＋）Rooting medium 1/2MS+400mg/Lcef+100mg/Lkam 5.8 注：cef：头孢霉素，kam：卡那霉素； Note: cef: cefotaxime；kan: KanamycinMS基础培养基配方：（1L的配方）1/2 MS基础培养基配方：（1L的配方）MS 大量：50ml MS 大量：25mlMS 微量：5ml MS 微量：2.5mlMS 铁盐：5ml MS 铁盐：5mlMS 有机：5ml MS 有机：5ml糖：30g 糖：30g琼脂：7.5g 琼脂：7.5g6-BA母液浓度：0.5mg/mlNAA母液浓度： 0.5mg/mlCef（头孢霉素）母液浓度：200mg/mlKam（卡那霉素）母液浓度：100mg/ml注意：高温会导致Cef（头孢霉素）和Kam（卡那霉素）分解，因此需要在培养基灭菌冷却后再在超净工作台内加入。
LB培养液配方：（1L的配方）NaCl 10g （10g/L）胰蛋白胨（TRYPTONE）10g （10g/L）酵母提取物（YEAST EXTRACT）5g （5g/L）LB固体培养基在液体配方的基础上1L加13g琼脂粉。
农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤 (2)
农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤整理人：早熟组赵凤利一、准备试剂：1.加有三抗的YEB或LB液体培养基，用于摇菌；2.渗透液(50ml)：250mg D-glucose，5ml MES 原液，5ml Na3PO4·12H2O 原液，5ul 1M 乙酰丁香酮原液，加dH2O至50ml。
1). 500 mM MES (Sigma)：4.88 g溶于50ml dH2O，保存于4℃2). 20 mM Na3PO4·12H2O (BDH)：0.38 g 溶于50ml dH2O，保存于4℃3). 1M 乙酰丁香酮：0.196 g，加DMSO至1 ml，可分装成小剂量，存于-20℃。
二、实验步骤：1.将检测成功的农杆菌菌液过夜扩摇，28℃,200rpm；2.取1-1.5 ml 菌液，加到灭菌的1.5ml离心管中；3.1000 g，10 min，沉淀菌体(室温)，去上清，加1 ml 渗透液，悬浮菌体；4.重复步骤3，进一步除去少量的抗生素；5.取少量悬浮菌液稀释10倍，测定OD600值，并乘以10，作为悬浮菌液的OD600值；注：如果悬浮菌液的OD600值在1.5-2.0之间，说明有大量的死菌细胞，将降低转化的效率。
6.确定悬浮菌液对渗透液的滴定度，计算稀释系数，使最终悬浮菌液(用于侵染)为0.5-5.0 ml，OD600为0.01-0.1，通常0.5-1.0 ml的最终悬浮菌液就能满足侵染了；如：需要OD600=0.1的500 ul最终悬浮菌液，而测定的悬浮菌液的OD600=0.4，则最终悬浮菌液中，悬浮菌液的用量为(0.1*500)/0.4=125 ul，则需要渗透液为375 ul。
7.在1.5ml离心管中，配好最终悬浮菌液，准备侵染；8.侵染前，将烟草放于白色荧光灯下1 h，使其气孔打开；9.选择倒三叶和倒四叶，用于侵染(于两叶脉之间侵染)，一株选两叶，侵染一种菌液；10.用去掉针头的注射器，轻柔地摩擦待转叶片的背部(0.5 cm2)，或用小针头刺穿，以去除其蜡质层；11.侵染前，用记号笔标记待转区域；12.将第7步中的最终悬浮菌液吸入1ml去针头的注射器中13.将注射器对着叶片背面的待转区域，一手按着叶片上面，另一手轻轻推动活塞，直到看到液体扩散，再侵染其他部位，侵染后，用记号笔圈定侵染区域；14.将侵染后的烟草放回培养室15.2-3天后：1). 亚细胞定位实验：切掉侵染区域，制片，荧光显微镜观察；2). 启动子GUS活性：GUS染色，75%酒精脱色，观察结果。
烟草瞬时表达步骤 电子版
亚细胞定位准备(用烟草ck)MS无抗培养基倒平皿，铺二层滤纸于培养基上；吸水纸（卫生纸一卷），小滤纸，用10ml 离心管代替打孔器，50ml离心管；小三角瓶（均需要灭菌，115℃，30min）1.将保存的农杆菌划线（kan+rif）,第三天中午挑菌于（kan+rif）LB培养基中28-30℃，摇床20h至第四天早上；2.以1:25比例（1ml接种于25ml）接菌液于25mlLB(含kan+rif，50nmAS)28-30℃，摇床培养至OD=0.6-0.8，约5h。
3.用50mL离心管收集菌体，常温，5000rpm，离心5min,弃上清；4.用以下溶液重悬菌体等体积25ml(10mM MgCL2，10mM MES, 150nM AS)放入小三角瓶，室温下静置活化2h，（铺滤纸于已凝的无抗MS培养基）；5.将叶片打孔，圆状的叶片浸泡在菌液中，真空渗透30min-1h（0.85Mpa）。
6.用灭菌的吸水纸吸干表面的菌液，平铺放置于MS培养基上，光照培养48h。
7.观察。
GUS定量分析所用试剂：1、0.1M磷酸缓冲液）（pH7.0）1M Na2PO4 11.54ml1M NaH2PO4 8.46mlAdd ddH2O TO 200ml2、GUS 蛋白提取液 (现用现配)0.1M磷酸缓冲液（pH7.0） 100ml10% SDS 2ml0.5M EDTA(Ph8.0) 4mlTritonx-100 200ulβ-巯基乙醇 200uladd ddH2O TO 200ml121℃灭菌室温保存3、gus蛋白分析buffer每100ml的蛋白提取液加入4-MUG 70.46mg,-20℃保存，现配现用。
4、0.2M Na2CO3 buffer。
Gus蛋白提取方法（全过程于冰上操作）•取适量烟草叶片，加入适量PVP,加液氮研磨成粉末，取约0.6g装入15ml离心管中•预先加入500ml蛋白提取液，摇匀，在冰上放置置沉淀•4℃，13000prm离心15min.•吸取上清到另一管中进行下一步实验，（未及时做放-20℃）Gus活性测定•取20ul蛋白加入37℃预热的180ulgus 蛋白分析buffer中，37℃温浴。
亚细胞定位的实验报告
一、实验背景亚细胞定位是指某种生物大分子物质或脂类在细胞内存在的具体位置。
了解蛋白的亚细胞定位对于研究基因的功能、蛋白互作及其作用机理具有重要意义。
本实验旨在利用荧光蛋白原位鉴定法，观察目标蛋白在细胞内的具体位置，从而了解其亚细胞定位。
二、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）烟草种子；（2）农杆菌（GV3101、EHA105、LB4404等）；（3）构建好的载体质粒；（4）亚细胞定位培养基；（5）10ml YEB液体培养基；（6）10mM MgCl2悬浮液；（7）1ml注射器；（8）激光共聚焦显微镜。
2. 实验仪器：（1）电子显微镜；（2）PCR仪；（3）电泳仪；（4）凝胶成像系统；（5）激光共聚焦显微镜。
三、实验方法1. 烟草培养：播种烟草种子，12h光照培养，培养一个月后用于实验。
2. 农杆菌培养：将构建好的载体质粒电转化法转入农杆菌，30℃培养2天。
3. 悬浮农杆菌：用接种环将农杆菌从固体培养皿上刮下，接于10ml YEB液体培养基中，170rpm/min培养1h。
4. 收集菌体：4000rpm/min，离心4min，去上清。
5. 重悬：用10mM MgCl2（含120uM AS）悬浮液重悬菌体，调OD600至0.6左右。
6. 注射：挑选生长状况良好的烟草植株，用去枪头的1ml注射器从烟草叶片下表皮注射，并做好标注。
7. 培养：将注射完成的烟草植株弱光培养2天，即可观察。
8. 观察：取标记的农杆菌注射的烟草叶片，制作成玻片，在激光共聚焦显微镜下观察，并拍照。
四、实验结果与分析1. 叶绿体荧光信号：叶绿体荧光信号激发波长为640nm，发射波长为675nm。
2. GFP信号：绿色荧光蛋白GFP，激发光波长为488nm，发射光波长为510nm。
根据实验结果，可以观察到目标蛋白在烟草叶片细胞内的具体位置，从而了解其亚细胞定位。
五、实验结论通过本实验，我们成功利用荧光蛋白原位鉴定法，观察了目标蛋白在细胞内的具体位置，实现了对其亚细胞定位的研究。
亚细胞定位实验报告(3篇)
第1篇实验目的：本研究旨在通过亚细胞定位技术，确定目标蛋白质在细胞内的具体分布位置，为进一步研究该蛋白质的生物学功能提供实验依据。
实验材料：1. 目标蛋白质表达质粒2. 表达载体（如pEGFP-N1）3. 农杆菌（如GV3101）4. 烟草植株5. 激光共聚焦显微镜6. 其他实验试剂和仪器实验方法：1. 构建表达载体：将目标蛋白质基因与表达载体（如pEGFP-N1）连接，构建融合表达质粒。
2. 农杆菌转化：将构建好的融合表达质粒电转化农杆菌，获得转化子。
3. 农杆菌培养：将转化子接种于YEB液体培养基中，在170rpm/min的条件下培养1小时。
4. 农杆菌悬浮：用接种环将农杆菌从固体培养皿上刮下，接于10ml YEB液体培养基中，悬浮农杆菌。
5. 收集菌体： 4000rpm/min，离心4分钟，去除上清。
6. 重悬菌体：用10mM MgCl2（含120uM AS）悬浮液重悬菌体，调整OD600至0.6左右。
7. 注射烟草：挑选生长状况良好的烟草植株，用去枪头的1ml注射器从烟草叶片下表皮注射，并做好标注。
8. 培养烟草：将注射完成的烟草植株弱光培养2天。
9. 观察与拍照：取标记的农杆菌注射的烟草叶片，制作成玻片，在激光共聚焦显微镜下观察，并拍照。
实验结果：通过激光共聚焦显微镜观察，发现融合表达质粒中的绿色荧光蛋白（GFP）信号在烟草叶片中呈现明显的细胞内分布。
根据GFP信号的位置，可以初步判断目标蛋白质在细胞内的分布情况。
结果分析：1. 细胞核定位：若GFP信号主要分布在细胞核区域，则表明目标蛋白质定位于细胞核。
2. 细胞质定位：若GFP信号主要分布在细胞质区域，则表明目标蛋白质定位于细胞质。
3. 细胞膜定位：若GFP信号主要分布在细胞膜区域，则表明目标蛋白质定位于细胞膜。
根据实验结果，可以初步判断目标蛋白质在烟草细胞中的定位情况，为进一步研究其生物学功能提供实验依据。
讨论：1. 亚细胞定位实验是研究蛋白质生物学功能的重要手段之一。
亚细胞定位之烟草转化方法
亚细胞定位之烟草转化方法烟草是常见的植物模型，被广泛应用于植物生物学研究中。
研究人员通常通过烟草转化方法，将外源基因导入烟草中，实现对基因的功能研究或产生转基因烟草植株。
烟草转化方法通常包括两个步骤：外源基因构建和烟草转化。
首先，需要构建一个携带外源基因的转化载体。
这个载体通常包含一个启动子、外源基因和终止子。
启动子可以驱动外源基因的转录，终止子可使转录终止。
外源基因可以是一个编码蛋白质的序列，也可以是一个编码RNA或其他功能分子的序列。
构建好转化载体后，接下来可以通过烟草转化方法将其导入烟草中。
烟草转化方法有多种，包括农杆菌介导转化、基因枪法等。
其中，农杆菌介导转化是最常用的方法之一、农杆菌介导转化是利用农杆菌的特性，将外源基因导入烟草细胞中。
首先，需要将转化载体与农杆菌进行共转化，形成转化菌。
接着，将转化菌与烟草叶片进行共同培养，利用农杆菌T-DNA的转移机制，将外源基因导入烟草细胞中。
经过一段时间的培养，将转化的烟草细胞分离培养，最终获得转基因烟草植株。
利用亚细胞定位技术，可以进一步研究转基因烟草植株中外源基因的定位。
常用的方法包括荧光蛋白标记技术和抗体标记技术。
荧光蛋白标记技术可以通过将外源基因与荧光蛋白基因进行融合，使转基因植株产生荧光蛋白标记，从而观察外源基因在细胞内的定位。
抗体标记技术则是将外源基因编码的蛋白质与特异性抗体结合，通过免疫荧光染色等方法观察外源基因的定位。
通过亚细胞定位技术，可以了解转基因烟草植株中外源基因在不同亚细胞位置的分布。
这对于研究外源基因的功能以及其与其他生物分子的相互作用方式非常重要。
此外，亚细胞定位研究也可以为转基因烟草的功能性研究提供重要线索。
总结起来，烟草转化方法是利用烟草作为植物模型，将外源基因导入烟草中的方法。
通过亚细胞定位技术，可以了解外源基因在转基因烟草植株中的定位，进一步研究外源基因的功能和相互作用方式。
烟草转化方法为研究转基因植物提供了重要的工具和方法。
烟草亚细胞定位
烟草亚细胞定位烟草是一种广泛栽培的经济作物，也是一种重要的研究材料。
在过去的几十年中，人们对烟草的生物学特性进行了广泛的研究，其中包括烟草细胞的亚细胞定位。
烟草细胞的亚细胞定位是指确定细胞内特定分子的位置和功能的过程。
通过这种方式，我们可以更好地理解烟草细胞的生物学特性，进而为研究其他生物提供有益的参考。
烟草细胞的结构在研究烟草细胞的亚细胞定位之前，我们需要先了解烟草细胞的基本结构。
烟草细胞是一种真核细胞，其结构包括细胞膜、细胞质、细胞核、线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体等。
其中，细胞膜是细胞的外层保护层，细胞质是细胞内部的液体环境，细胞核是细胞内的遗传物质和控制中心，线粒体是细胞内的能量中心，内质网是细胞内的蛋白质合成和质膜合成中心，高尔基体是细胞内的物质分泌中心，溶酶体则是细胞内的垃圾处理中心。
这些结构之间相互作用，共同维持烟草细胞的正常生理功能。
烟草细胞的亚细胞定位技术烟草细胞的亚细胞定位技术是通过染色、免疫共沉淀、免疫荧光等方法来确定细胞内特定分子的位置和功能。
其中，染色技术是最早被使用的技术之一，通过染色剂将细胞内不同的结构染色，从而确定它们的位置和功能。
例如，用荧光染料DAPI染色可以清晰地观察到烟草细胞核的位置和形态。
免疫共沉淀技术是一种通过抗体识别特定蛋白质并将其与其他相关蛋白质共同沉淀下来的技术。
这种技术可以用来确定蛋白质之间的相互作用关系，从而进一步了解它们在细胞内的功能。
例如，通过免疫共沉淀技术可以确定烟草细胞质中的一些关键蛋白质与细胞分裂和细胞骨架形成的关系。
免疫荧光技术是一种通过抗体与荧光染料结合的方式来定位特定蛋白质的技术。
这种技术可以用来确定蛋白质在细胞内的位置和运动方式，从而进一步了解它们在细胞内的功能。
例如，通过免疫荧光技术可以确定烟草细胞质中的一些关键蛋白质与细胞分裂和细胞骨架形成的关系。
烟草细胞的亚细胞定位研究进展在过去的几十年中，人们对烟草细胞的亚细胞定位进行了广泛的研究。
烟草转化方案
利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达的方法[精华提要]通常，我们可以利用烟草的瞬时表达系统来观察感兴趣蛋白的亚细胞定位（通过与绿色荧光蛋白构成融合蛋白）。
同时，还可以检测蛋白的表达量。
这一个过程是通过农杆菌作为一个工具将目的基因整合到到烟草的细胞内的。
材料与试剂1. 携带表达载体的农杆菌菌株（通常表达载体由35S启动子驱动）2. 2-4周的烟草植株3. LB培养基4. 乙酰丁香酮5. 2-(N-吗啉代) 乙磺酸6. 抗生素7. 注射器工具1. 50ml离心管2. 光谱仪3. 紫外灯4. 荧光显微镜步骤：1. 挑取单克隆于5mlLB液体培养中，28-30°C震荡培养。
通常，LB中加入100ug/ml 庆大霉素（农杆菌株GV3101携带抗性），50ug/ml大观霉素（载体携带）。
2. 将1ml过夜培养的农杆菌转接到25mlLB液体培养基中（加有与1相同的抗生素，另外加入高压灭菌的乙酰丁香酮）。
3. 检测过夜培养的菌液OD600的值。
4. 5000g，15分钟集菌，用重悬液重悬菌体，最终OD600为0.4。
5. 室温放置2-3h后注射烟草。
6. 将侵染液装入5ml注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内（勿使用子叶）。
注射后，烟草叶片会出现湿润的现象。
7. 注射后2-5天，在便携式长波长紫外灯下检测GFP荧光信号（只适用于荧光很强的叶片）。
8. 通过荧光显微镜或者激光共聚交荧光显微镜检测GFP信号。
同时，可以提取蛋白，检测蛋白的含量。
配方1. 加有相应抗生素的LB液体培养基（一种抗生素是菌株携带，一种为载体携带）。
2. 乙酰丁香酮（100mM 溶于乙醇，-20°C储存）。
3. 1M MgCl24. 重悬液(10mM MgCl2,10mM 2-(N-吗啉代) 乙磺酸(pH5.6)高温高压灭菌15分钟，100uM 乙酰丁香酮，高温高压灭菌)。
5. 乙酰丁香酮（来自Aldrich）：又名3’,5’-二甲基-4’-羟基苯乙酮，或4’-羟基-3’,5’-二甲基苯乙酮。
农杆菌渗透法转化烟草条件的优化
农杆菌渗透法转化烟草条件的优化作者：李晓君王绍梅谢艳兰和敏来源：《江苏农业科学》2014年第09期摘要：植物瞬时表达系统常用于研究基因表达产物的亚细胞定位和蛋白间的互作，将GFP-GUS融合蛋白植物表达载体导入农杆菌EHA105，获得工程菌，制备不同浓度的农杆菌浸染液，用注射法对烟草叶片进行转化，荧光显微镜检测烟草叶片原生质体和下表皮中GFP 的表达情况。
结果表明，浸染注射液的D600 nm 在0.3～0.7之间均具有较高的转化效率，注射后第4天至第6天为较佳观察时间。
关键词：植物瞬时表达系统；渗透法；转化；农杆菌渗透注射；烟草；绿色荧光蛋白（GFP）中图分类号： S572.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0045-03收稿日期：2013-11-25基金项目：临沧师范高等专科学校高层次人才引进科研启动项目（编号：LXJ2012）；临沧师范高等专科学校校级课题（编号：LCSZL2013001 ）。
作者简介：李晓君（1985—），女，云南临沧人，博士，讲师，主要从事植物生物技术与种质创新研究。
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植物瞬时表达系统常用于基因产物的亚细胞定位、蛋白间互作、转录因子与启动子之间的互作、启动子分析等方面的研究[1-2]。
植物瞬时表达系统中外源基因的导入方法有植物病毒介导法、PEG法、电击法、基因枪法和农杆菌渗透法[2]。
农杆菌渗透法是一种比较简便的方法，通过将植物表达载体导入农杆菌，用真空法或注射法将农杆菌导入植物细胞，使得农杆菌Ti质粒上的T-DNA区整合到植物基因组中，T-DNA 区的目标基因培养几天后即可得到表达[3]。
较其他方法而言，农杆菌渗透法具有转化效率高、基因表达在完整活体内进行、可携带较大片段的目的基因等优点[2]。
原生质体是观察基因瞬时表达情况的优选材料，传统的原生质体转化方法首先要制备高浓度、高质量的质粒，经过从植物活体材料中分离纯化原生质体，在PEG的介导下将质粒DNA导入原生质体，进行原生质体培养后再检测目标基因的表达情况[4]。
烟草基因相互作用实验步骤
瞬时表达本实验室一般采用瞬时表达的方法研究两个基因是否有相互作用（如转录因子是否能够诱导相应基因的表达）。
1.培养室中种植小叶烟草（Nicotiana Ben？，俗称本氏烟草？），一般约一周后萌发，约一个半月后可以用于瞬时表达实验。
注意：小叶烟草的生长状态非常重要，直接决定了烟草瞬时表达实验的效果。
需要选取浓绿、厚实的叶片进行实验。
2.将需要检测的质粒分别转化农杆菌GV3101（庆大霉素抗性，50ug/ml；菌株不同，所对应的抗性也不同），在双抗板上生长两天后可以看到农杆菌菌落。
挑选单克隆，转接至0.5-2ml加有合适浓度双抗的LB液体培养基（离心管或者试管），28℃培养过夜，菌液PCR鉴定；转接生长良好的菌液至新的双抗LB液体培养基（试管或者锥形瓶），培养至OD600约0.6-0.8左右。
3.配制烟草瞬时表达的注射缓冲液，配方如下：0.5M MES 1ml20mM Na3PO4 1mlD-葡萄糖50mg1M 乙酰丁香酮1ul水（一般情况下最先加入）补齐至10ml注意：MES与Na3PO4溶液容易染菌，染菌后需要重新配制母液。
乙酰丁香酮需要用N-N-二甲基甲酰胺溶解后分装，尽可能避免反复冻融。
注射缓冲液需要现配现用。
4.将农杆菌菌液用EP管分装后3000rpm离心10分钟（4℃或者室温均可），去上清（尽可能清除干净）；利用注射缓冲液重悬后3000rpm离心10分钟，去上清，重复共两次。
注射缓冲液重悬。
5.利用步骤4中的农杆菌重悬液，配制不同的农杆菌组合，使农杆菌菌液的最终浓度达到OD600 0.1-0.5之间。
利用一次性注射器，将农杆菌菌液注射至小叶烟草叶肉，吸水纸吸去叶片表面多余的菌液，做好标记。
注意：（1）若需要观测蛋白的亚细胞定位，农杆菌菌液的浓度OD600在0.1左右会更好，浓度过高会导致背景信号强或者假象；检测样本与对照间的浓度要保持统一，比如35S::TF-A+ProB::GUS组合与ProB::GUS进行比较，两种注射液中ProB::GUS的浓度要相同；农杆菌OD600过高会导致叶片萎蔫死亡；（2）由于农杆菌菌液对叶片造成伤害，所以注射后一天内，叶片会较为萎蔫，再经过一段时间后会逐渐恢复正常。
棉花GbRvd的亚细胞定位及其超表达烟草抗病性分析
棉花GbRvd的亚细胞定位及其超表达烟草抗病性分析杨占武;杨君;张艳;吴金华;李志坤;王省芬;吴立强;张桂寅;马峙英【期刊名称】《中国农业科学》【年(卷),期】2016(049)021【摘要】[目的]研究棉花NB-LRR家族基因GbRvd的亚细胞定位及超表达烟草的黄萎病抗性,为解析GbRvd介导的植物抗黄萎病机制提供依据.[方法]对真核表达载体pJCV52进行改造,在SpeⅠ酶切位点插入gfp,使其兼具亚细胞定位的功能,命名为GPJCV52.应用Gateway技术构建GbRvd的亚细胞定位和超表达载体,并分别转化农杆菌GV3101.利用生物信息学和农杆菌介导的烟草瞬时表达技术对GbRvd 分别进行亚细胞定位预测与观察.采用农杆菌介导法转化烟草,并通过组织培养技术获得转基因植株.运用PCR对超表达GbRvd的烟草进行阳性植株筛选,且利用半定量RT-PCR对阳性转基因植株进行表达检测.制备棉花黄萎病菌孢子悬浮液,通过灌根法对T3代转基因烟草株系进行接种,利用5级标准统计发病情况并计算病情指数.[结果]利用在线分析软件ProtComp预测GbRvd为一种胞外(分泌)蛋白;GbRvd的跨膜预测结果显示其包含3个跨膜域;在线分析软件WoLF PS0RT预测结果显示GbRvd在细胞膜、内质网及叶绿体的预测分值分别为7、3和1,表明GbRvd主要存在于植物细胞膜上.利用农杆菌介导的烟草瞬时表达技术进一步对GbRvd的亚细胞定位进行观察,结果显示在单独表达GFP蛋白的烟草细胞中,荧光信号在细胞核、细胞质和细胞膜均有分布;而GbRvd与GFP融合表达后的荧光信号主要分布于烟草表皮细胞质和细胞膜.综合生物信息学分析和亚细胞定位观察结果,表明细胞膜和细胞质是GbRvd的主要分布位置.利用农杆菌介导和组织培养获得了转基因烟草植株,通过对转基因烟草植株的PCR检测显示,阳性转基因烟草植株能够通过PCR扩增出与预期大小一致的目的条带,而野生型植株未出现相应条带;阳性转基因烟草植株半定量RT-PCR同样能够检测出与预期大小一致的目的条带,由此表明GbRvd成功整合于烟草基因组并能够进行正常转录.对3个T3代超表达烟草株系的黄萎病抗性进行分析,结果显示超表达GbRvd的烟草植株病情指数显著低于野生型对照植株,表明过表达GbRvd可有效提高植株对黄萎病的抗性.[结论]GbRvd主要存在于植物细胞质和细胞膜,其超表达可显著提高烟草对黄萎病的抗性.【总页数】9页(P4065-4073)【作者】杨占武;杨君;张艳;吴金华;李志坤;王省芬;吴立强;张桂寅;马峙英【作者单位】河北农业大学农学院/教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室,河北保定071001;河北农业大学农学院/教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室,河北保定071001;河北农业大学农学院/教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室,河北保定071001;河北农业大学农学院/教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室,河北保定071001;河北农业大学农学院/教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室,河北保定071001;河北农业大学农学院/教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室,河北保定071001;河北农业大学农学院/教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室,河北保定071001;河北农业大学农学院/教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室,河北保定071001;河北农业大学农学院/教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室,河北保定071001【正文语种】中文【相关文献】1.烟草NtGGPPS 3基因的亚细胞定位和组织表达分析 [J], 孙建生;夏玉珍;李正风;蔡联合;陈千思;王燃;魏春阳;杨军;李锋2.烟草氧化胁迫相关基因NtOSA1的克隆表达及亚细胞定位分析 [J], 刘继恺;高永峰;吴婵娟;张林;陈彩霞3.华南象草PpCAD基因的亚细胞定位及其在转基因烟草中的异源表达 [J], 唐然;张博雅;彭小群;张向前;江院;解新明4.普通烟草CESA基因家族成员的鉴定、亚细胞定位及表达分析 [J], 徐宗昌;孔英珍5.马尾松PmMYB169基因亚细胞定位及其超表达烟草低磷抗性分析 [J], 李慧平;王庆竹;汤纬玮;文晓鹏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法：
一、农杆菌介导的烟草瞬时转化：
A、实验步骤：
1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。
2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。
*估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。
3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。
4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。
5、重复步骤4。
6、所得沉淀用1ml Induction medium重悬。
7、室温放置1~4小时
8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。
9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。
*使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。
B、试剂：
Induction medium：
MES-KOH PH 5.710mM
MgCl210mM
AS 200uM
推荐提前配制母液
1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
1M MgCl2过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。
用高压灭菌的超纯水稀释。
C、关于表达时间：
烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。
严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。
D、关于侵染液浓度：
推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。
过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。