3-生物分子相互作用研究的重要工具-SPR Sensor

酶促反应检测
免疫学领域
乙肝表面抗原测定
HBsAg样品的SPR 光谱图
不同浓度的HBsAg溶液的响应曲线
免疫传感的放大检测
等离子体
等离子体通常是指由密度相当高的自 由 正、负电荷组成的气体，其中正、负带 电 粒子数目几乎相等，内部不形成空间电 荷。金属可以看成等离子体,由于电磁振荡 形成等离子波
光以大于临界角入射在光疏介质和光 密介质表面时，会形成衰逝波进入到光疏 介质中，而在介质（假设为金属介质）中 又存在一定的本征等离子波。当物质的本 征波遇到外界波的时候可能会发生什么？
Surface plasmon resonance (SPR)
The underlying physical principles of SPR are complex . Fortunately, an adequate working knowledge of the technique does not require a detailed theoretical understanding. It suffices to know that SPR-based instruments use an optical method to measure the refractive index near (within ~300 nm) a sensor surface.
蛋白间相互作用方面的研究
利用ＢＩＡ-ＭＳ可以筛选和鉴定感兴趣 的蛋白及与 结合的对象,这是ＢＩＡ-ＭＳ 的一个主要应用领域。例如采用ＢＩＡ与 基因标签技术进行蛋白质的鉴定。实验将 表达标签基因融合入未知基因中,通过标签 基因的表达来检测痕量表达的靶蛋白。靶 蛋白的分子量由ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ在传感 器芯片表面直接测定,并经序列资料库的搜 寻核实、鉴定
生物分子作为分析物可与传感芯片上固 相化的特定的配位体进行生物特异性相互作 用，例如传感芯片SA结合生物素化的配位 体可与肽类、蛋白质类及DNA等分析物结 合。传感芯片NTA通过金属络合捕获配位 体可与组氨酸标记蛋白质类分析物结合。传 感芯片HPA的疏水性表面涂以规定使用的 脂质体类，造成亲水性表面与分析物结合
当入射波以某一角度或某一波长入射， 近场波矢K和SPW的波矢相等，发生谐振， 入射光能量耦合到SPW的波，反射光强度 出现一个凹陷。此时的入射光角度称为 SPR角。SPR角随金表面折射率的变化而 变化，而折射率的变化又与金表面结合的 分子质量成正比。
在表面等离子共振仪中，最核心的结构是芯 片，芯片的结构见图。在玻璃表面附有一层 金箔，一种待检分子（ligand）连在金箔上， 入射光在金和玻璃表面发生全反射，并产生 SPR，这时的入射角为I。当有另一种分子 （analyte）与ligand相互作用时，使金箔 的折射率发生变化，这时以原来的入射角 （I）入射就不能发生SPR，而以入射角 （II）入射才能发生SPR。用楔形的入射光 入射保证了入射角在一定范围能，并能实时 检测
共振角
当入射光波长固定时， 反射光强度是入射角的 函数，其中反射光强度 最低时所对应的入射角 称为共振角
SPR检测原理
SPR 对附着在金属薄膜表面的介质折射率非常敏感 , 当表面 介质的属性改变或者附着量改变时，共振角将不同。因此， SPR谱（共振角的变化vs时间）能够反映与金属膜表面接触 的体系的变化。
分子生物学领域
•DNA复制
•转录调控
•蛋白质间相互作用
•核酸之间、核酸与蛋白质间的相互作用
•酶促反应检测
•生物小分子检测
SPR技术在蛋白质组学中的作用
生物分子相互作用分析质谱质谱(ＢＩＡ-Ｍ Ｓ)是ＳＰＲ-ＢＩＡ技术与传统的蛋白鉴定 技术ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ(基质辅助的 激光解吸离子化时间飞行质谱)有机结合形 成的一种新的研究手段
snell定律可知： θ2=90° θc=sin-1(n2/n1) 当n2<n1时，全反射就可能发生。从几何 光学的角度来看，当光发生全反射时，光 会在介质1界面上完全反射而不进入介质2 中。实际上，由于波动效应，有一部分光 的能量会穿过界面渗透到介质2中，平行于 界面传播。这部分光场就是所谓的隐失波
chip)上配位体与分析物作用的一种新技术
内容
• 概述 • 原理 • 研究相互作用的一般过程及应用 • 发展前景
表面等离子共振（SPR）传感器
• 光学传感器 • 瑞典科学家Liedberg 等于80 年代首次将SPR传感器技术运用于IgG抗 体与其抗原相互作用的测定 • 1990 年,瑞典的Biacore AB 公司开发出世界上第一台商业化的SPR 生 物传感器BiacoreTM,随后不断有专业化的商用SPR 生物传感器平台 • 广泛应用于从蛋白、寡核苷酸、寡糖、脂类到小分子、噬菌体、病毒 颗粒、细胞等各种生物体系。 • 从根本上改变了生物分子识别科学,成为生命科学和制药研究上的标准 工具
这表示沿X轴方向传播而振幅衰减的一个波， 这就是衰逝波。衰逝波最后仍返回第一介 质，总的来说光的能量没有进第二介质。
一般情况下隐失波在折射率小的介质中传播一段距 离，再回到折射率大的介质，使光的全部能量都 回到第一介质中。如果隐失波的频率与金属表面 振荡的自由电子（即等离子）频率一致，则金属 表面的等离子就吸收光能发生共振（surface plasmon resonance，SPR），使反射光强度 减弱，这时的入射角为共振角（SPR角）。糖蛋 白和脂蛋白引起的特异性折射率增高较其他蛋白 低。而核酸引起的特异性折射率增高比蛋白质稍 高。
• 当入射波以某一角度或某一波长入射，近 场波矢
SPR基本原理
它利用P偏振光在 玻璃与金属薄膜 界面处发生全内 反射时渗透到金 属薄膜内的消失 波,引发金属中的 自由电子产生表 面等离子体子, 当表面等离子体 与消失波的频率 相等时,二者将发 生共振,界面处的 全反射条件将被 破坏, 呈现衰减全 反射现象，入射 光 被 金属表面电 子吸收,使反射光 能量急剧下降
ＢＩＡ-ＭＳ分为两步: 第一步,ＳＰＲ检测自身环境中的生物分子; 第二步,ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ鉴定结合 在ＳＰＲ传感器表面的分析物。这种方法 综合了ＳＰＲ-ＢＩＡ和ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ -ＭＳ两种技术的优势,实现了定量与定性的 结合
ＢＩＡ-ＭＳ在研究蛋白质复合物组分 间相互作用的动力学参数、利用结合位点 结构的研究筛选功能性的突变、通过依次 结合事件的分析揭示重要的生理分子级联 反应机制、研究任何蛋白质间的相互作用 等方面具有广泛的用途,是蛋白质组学中研 究的有力工具
生物分子相互作用研究 的重要工具-SPR Sensor
表面等离子共振技术 (Surface Plasmon Resonance, SPR)
表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance technology， SPR)是20世纪90年代发展起来的，应用 SPR原理检测生物传感芯片(biosensor
Karlsson等应用自动的BIA系统进行了单克隆抗 体－抗原相互作用的动力学反应研究，并且通过
数学推导和动力学分析计算出 HIV-1核心蛋白质
P24在3×104～7。4×105L.mol*S -1范围 的解离速率常数。 1992 年， Fagerstam 等应 用 BIA 进行了胰岛素样生长因子－ 1 动力学分析， 结合位点及浓度分析
Fra Baidu bibliotek
蛋白结构与功能关系的分析
ＢＩＡ在实时检测分子间相互作用时 可提供动力学信息。同一蛋白质中不同氨 基酸残基与其他分子相互作用时的动力学 改变不同,因此可推测出该蛋白内部存在的 不同功能基团、蛋白在翻译后发生的不同 修饰。
将脂蛋白B100固定于传感器芯片上， 依次注入不同的单克隆抗体，由于不同的 抗体与脂蛋白B100相互作用的能力不同， 所以可以精确鉴定脂蛋白B100上的不同结 构域。其余的用途可以筛选蛋白的遗传多 态性，检测人类遗传突变，并且可以区别 正常和突变的靶DNA
SPR响应
Science 2002, 295:2103-2105
SPR仪的结构示意图及工作原理
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Biacore3000的工作单元 温度控制 LED状态指示器 SPR仪的传感芯片（sensor chip）
SPR生物传感器的基本结构
1. 光波导耦合器件 2. Sensor chip 金属膜 分子敏感膜
Biacore3000的液体流路简图
光波导耦合器件
Krestschmann 棱镜型
金属膜 分子敏感膜
金属膜
反射率高 化学稳定性好
Au 膜和Ag 膜是SPR 中最常用的两种金属薄膜
膜的厚度：50-100nm
分子敏感膜
成膜方法： 1. 金属膜直接吸附法 2. 共价连接法（生物素-亲和素、葡聚糖凝胶、水 凝胶、高分子膜、多肽等） 3. 单分子复合膜法 4. 分子印膜技术
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Biacore3000的工作单元 温度控制 LED状态指示器 SPR仪的传感芯片（sensor chip）
Biacore3000的工作单元
两个液体传送泵：其中一个泵负责保持稳定流速的液体流过传 感芯片表面，另一个泵负责自动进样装置中的样品传送。 自动上样装置( autosampler)：负责样品的混合、注射和回 收。 一体化U型射流器（Integrated u-Fluidic Cartridge, IFC）：包含液体传送通道，样品环和阀门。 检测单元：包括能够产生和测量SPR信号的光电组分。 四个可探测的液体池(flow cell)：该液体池通过将IFC靠在传 感芯片上而形成。 微处理装置(microprocessors)：它能控制泵，自动上样装 置，和IFC的阀门并且能对SPR信号作基本的处理。
Biacore SPR sensor chips
• Chip name Dextran Modification Application • CM5 100 nm 100% carboxylation general • CM4 / B1 100 nm 30% carboxylation cell extracts / serum and membranes • CM3 / F1 30 nm 100% carboxylation cell extracts / serum and membranes • C1 none 100% carboxylation phage binding • NTA 100 nm NTA capturing poly HIS-groups • HPA none hydrophobic lipid capturing • L1 100 nm lipophilic substancesbilayers to mimic membranes • SA 100 nm streptavidin capturing of biotin • AU / J1 none none user defined surface chemistry • SIA none none surface interaction analysis in material science
共 振!
一、表面等离子共振技术的原理
全内反射是一种普遍存在的光学现象。 一束平面光波从介质1表面进入到介质2中。入射 光在介质1表面上一部分发生反射，另一部分则透 射进介质2。 入射角和透射角之间满足关系式： n1sinθ1=n2sinθ2 (n1:介质1的折射率，n2:介质2的折射率) 当入射角增大，增大到临界角θc 时,这时的透射 角为90°；当入射角继续增大到大于临界角时， 光不再透射进介质2，也就是发生了全反射。
配体（生物分子）与表面基质的偶联方法
配体与传感芯片的偶联方法
（1）氨基偶联法
（2）配体巯基偶连
（3）醛基偶连法
几种芯片
CM5传感芯片
CM4传感芯片
CM3传感芯片
SA传感芯片
NTA传感芯片
L1传感芯片
生物学应用
分子生物学领域 免疫学领域 微生物领域 药物领域 食品工业领域 临床医学领域分子生物学领域微生物领域免 疫学领域