脉冲场凝胶电泳技术_PFGE_在分子分型中的应用现状_王丽丽

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但 是 Davis 等[21]认 为 , 不 同 的 限 制 性 内 切 酶 可 能对菌株产生矛盾的聚类结果。所以如果必须根 据 PFGE 数 据 推 测 菌 株 间 的 流 行 病 学 关 系 , 需 要 6 种或以上的限制性内切酶以对它们的遗传学关系 提供合理的估计。
Tenover 等[22]提 出 了 有 关 菌 株 同 源 性 的 判 别 标 准, 按其电泳条带可分为: 无差异, 说明为相同菌 株 ; 有 1~3 条 带 的 差 异 说 明 菌 株 间 有 相 近 关 系 , 且 只 有 单 基 因 的 改 变 ; 4~6 条 带 的 差 异 说 明 菌 株 间 可能有相近关系, 表示出有两个独立基因的差异; 如菌株间有 6 条带或更多条带差异, 说明有三个 或 更 多 基 因 的 变 化 , 被 视 为 无 相 关 性 。该 标 准 只 适 合于小量的局部性基因的变化研究, 有一定的局 限 性 。因 为 细 菌 的 高 变 异 性 , 判 断 是 否 是 同 一 菌 株 时 允 许 一 定 的 变 异 存 在 。Fred[23]在 解 释 PFGE 结 果 时 提 出 将 具 有 85%以 上 相 同 条 带 的 菌 株 认 为 是 相 同 的 菌 株 , 50%以 上 的 条 带 不 相 同 时 , 菌 株 被 认 为 流行病学不相关。
【文 献 标 识 码 】B
【文 章 编 号 】 1003- 996(1 2006)05- 0276- 04
近 年 来 , 以 脉 冲 场 凝 胶 电 泳 ( Pulsed field gel electrophoresis, PFGE) 为 代 表 的 分 子 生 物 学 分 型 方 法日渐受到青睐, 其原理为通过一定的方法, 直接 或 间 接 反 映 病 原 体 变 异 分 化 的 本 质 即 DNA 序 列 的 改 变 , 从 而 做 到 微 观 变 化 的 宏 观 显 示 。电 泳 结 果 通常是条带图谱。该方法的发展成熟为监测控制 细菌的流行提供了广阔的前景。通过分型可以鉴 定比较菌株是否一致, 对于细菌性传染病监测 [1, 2]、传 染 源 追 踪 、传 播 途 径 调 查 和 识 别 等 暴 发 调 查 有 着 非 常 重 要 的 意 义[3, 4]。
参 考 European Study Group on Epidemiological Markers (ESGEM) 指 出 的 评 价 流 行 病 学 分 型 系 统 时要考虑的几个标准, 对于分子流行病学分型方 法的选择, 我们认为应该以下列标准来衡量: 1 分 型 力 ( typeablity) 指 对 被 分 析 的 每 一 菌 株 能够获得明确的、不似是而非的、阳性结果的能 力。不可分型菌株是指那些没有结果或者结果不 可解释的菌株。 2 可 重 复 性 ( reproducibility) 指 用 一 种 技 术 对 同一菌株反复测试能够获得相同结果。技术因素 和生物因素都可以影响可重复性。技术因素是指 对同一菌株进行多次重复性实验而出现不同试验 间的差异。生物因素是指细菌的某种测试特性存 在生物学变异, 代表同一菌株的不同菌落的检测 结果会有不同。 3 分 辨 力 ( discriminatory power) 指 区 分 不 相 关 菌株的能力。
目前对病原细菌常用的分子生物学分型方法 有 : 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 ( RFLP) , 特 定 片 段 PCR, 随 机 扩 增 多 态 性 DNA 片 段 ( RAPD) , 基 因 外 重 复 回 文 序 列 PCR ( Rep- PCR) , 裂 解 酶 片 段 长 度 多 态 性 ( CFLP) , 扩 增 片 段 长 度 多 态 性 ( AFLP) , DNA 测 序 以 及 脉 冲 场 凝 胶 电 泳 ( PFGE) , 新 的 分 型 方 法 还 有 Multiple - locus variable - number tandem- repeats analysis (MLVA) 以 及 Multiple - locus se- quence typing (MLST)多 位 点 序 列 分 析 等 。 脉 冲 场 凝胶电泳是目前国内外流行病学研究广泛接受的 方 法 之 一 , 与 其 他 方 法 相 比 , 具 有 重 复 性 好 、分 辨 率 高[7- 9]、结 果 稳 定 、易 于 标 准 化 的 优 点 , 能 在 细 菌 基因组很庞大的情况下, 尽可能反映较多的变异 信 息 , 其 周 期 长 的 缺 点 已 逐 渐 为 一 种 快 速 PFGE 方 法 ( 24~48 h) 所 克 服 。
目 前 PFGE 图 像 应 用 BioNumerics(Version 4.0) 数 据 库 软 件 进 行 处 理 , 识 别 图 像 条 带 。聚 类 图 类 型 选 择 UPGMA (Unweighted Pair group Method using Arithmetic averages)方 法 , 条 带 位 置 差 异 容 许 度 选 择 1.0%, 优 化 值 选 择 0.5%。脉 冲 场 凝 胶 电 泳 分 析 通 常 使 用 Band based/Dice 方 法 计 算 相 似 性 系 数 , 即 Dice 系 数 (F ×100% , F value ×100% ) 来 衡 量 PFGE 带 型 之 间 的 相 似 度 。F﹦2nxy/(nx﹢ny),nx 是 菌 株 x 的 总 的 片 段 数 , ny 是 菌 株 y 的 总 的 片 段 数 , nxy 是 菌 株 x 和 菌 株 y 的 相 同 的 片 段 数[24], F 值 反 映 的 是 不 同 菌 株 电 泳 条 带 的 相 似 性 程 度 , 范 围 在 0~1 之 间 , 0 代 表 完 全 不 相 关 , 1 代 表 完 全 相 同[25]。
当今传染病暴发流行的性质发生了改变, 即: 暴发流行不再局限于某一地区, 一段相对集中的 时间里, 由同一污染源引起的暴发流行, 而是由多 个传染源, 在较长的时间段内, 跨越省市甚至是国 家的暴发流行。脉冲场凝胶电泳方法由于其自身 优势而被广泛应用于追踪监测细菌传染性疾病的 暴 发 流 行 , [12,13] 还 有 助 于 识 别 散 发 病 例 的 传 染 源 。 3 可用于对已确认的爆发疫情进行传染源的追 踪 , 从 而 有 效 预 防 疫 情 的 再 次 发 生[14]。 4 除了帮助流行病学调查外, 细菌分型还能对病 人的诊断和治疗提供线索, 对连续继发性感染患 者 分 离 菌 株 进 行 PFGE 分 析 可 以 区 分 是 复 发 ( 单 一 菌 株 型 ) 还 是 新 的 菌 株 引 发 的 再 感 染[15]。 5 PFGE 也 用 于 抗 生 素 敏 感 株 和 多 重 耐 药 菌 株 的 分 子 分 型 , 如 耐 苯 唑 西 林 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 [16]和 耐 甲 氧 苯 青 霉 素 金 黄 色 葡 萄 球 菌(MRSA)。 6 对生活环境中分离的菌株和病人中分离菌株 进 行 相 关 性 分 析 。 [17,18] 7 PFGE 还 可 用 于 其 他 领 域 , 如 百 日 咳 抗 原 性 变 异 和 PFGE 的 相 关 性[19]。
一 PFGE 方法原理
PFGE 以 其 重 复 性 好 , 分 辨 力 强 而 被 誉 为 细 菌 分子生物学分型技术的"金标准"。它可以用于大 分 子 DNA 的 分 离 , 其 分 辨 范 围 达 到 10 Mb。 而 普 通 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 仅 能 分 离 小 于 50 0 kb 的 DNA 分 子 。PFGE 的 基 本 原 理 是 通 过 电 场 的 不 断 改 变 , 使 包 埋 在 琼 脂 糖 凝 胶 中 的 DNA 分 子 的 泳 动 方 向 做 相 应 改 变 , 小 的 DNA 分 子 比 大 的 变 化 快 ,
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疾病监测 2006 年 5 月 31 日第 21 卷第 5 期 Disease Surveillance, May.31,2006, Vol.21, No.5
·综 述·
脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)在分子分型中的应用现状
王丽丽, 徐建国
关键词: 脉冲场凝胶电泳; 分子分型; 应用
【中 图 分 类 号 】R- 331
统计学上就可以应用了。对于那些评估多种特性 的技术来说, 如噬菌体分型和电泳分型技术, 当可 重 复 性 降 低 时 , 分 辨 力 通 常 下 降 。这 是 因 为 要 可 靠 地进行区分, 不相关的菌株必须在许多特性方面 不同。 4 流 行 病 学 相 关 性 ( epidemiololgic concordance) 指分子分型的结果与流行病学资料相符, 易于解 释 , 得 到 的 结 果 逻 辑 性 强 、客 观 , 解 释 更 加 可 靠 。 5 可 比 性 ( typing system concordance) 指 不 同 操 作人员, 尤其不同实验室之间分型结果的可比性。 6 灵敏性 是指所选的分型方法能尽可能反映 较多的变化( 差异) 信息, 反映有意义的变异信息。 7 分型方法 快速、费用低、技术简单、易于操作。
二 PFGE 在分子生物学中的应用
PFGE 是 一 种 非 常 有 效 的 分 子 分 型 方 法 , 在 国 外被广泛应用于很多菌种的分子流行病学研究 中 。能 够 用 于 分 析 菌 株 之 间 的 相 关 性 , 协 助 追 踪 感 染 来 源 , 在 疫 情 控 制 方 面 可 发 挥 重 要 的 作 用 。具 体 表现在以下几个方面: 1 研 究 菌 株 之 间 的 遗 传 差 异 。 [10,11] 2 在表面上散在分布的病例中寻找可能的联系, 通过监测及时发现暴发。
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故小分子泳动的快, 从而在凝胶上按染色体大小 而呈现出电泳带型。脉冲场凝胶电泳的具体操作 包 括 将 细 菌 染 色 体 DNA 包 埋 在 胶 块 中 , 经 蛋 白 酶 水解, 稀有酶切位点的内切酶对细菌染色体组 DNA 进 行 消 化 , 脉 冲 场 电 泳 , 从 而 细 菌 DNA 大 片 段 得 以 有 效 分 离 。DNA 带 的 密 度 在 一 定 程 度 上 反 映 了 细 菌 内 DNA 的 含 量 以 及 DNA 分 子 的 大 小 , 最终达到分型的目的。
同一种菌可以用多种内切酶来消化, 每一种 酶 得 到 的 PFGE 条 带 可 能 不 同 , 但 是 最 终 聚 类 的 结 果 相 似 。Jaime Martinez- Urtaza 等[20]的 实 验 表 明 : 副 溶 血 性 弧 菌 使 用 内 切 酶 Not I 和 Sfi I 的 PFGE 分型结果相似。
理想的情况是, 每一个不相关菌株的结果都 是 独 特 的 。 可 通 过 Hunter - Gaston Discrimination Index(D)[5, 6]计 算 两 个 不 相 关 菌 株 被 正 确 分 为 不 同 型 别 的 概 率 来 测 量 分 辨 率 。在 实 际 应 用 中 , 当 最 常 见的型别代表群体的比例小于 5%时, 此种方法在
[作者单位]传 染 病 预 防 控 制 国 家 重 点 实 验 室 中 国 疾 病 预 防 控 制 中
心 传 染 病 预 防 控 制 所 102206 [作 者 简 介 ]王 丽 丽 , ( 1979- ) , 女 , 辽 宁 省 康 平 县 人 , 硕 士 , 主 要 从
事微生物学研究工作 [通 讯 作 者]王 丽 丽 , Email:wangll4585@163.com
三 PFGE 结果的解释
目 前 PFGE 已 用 于 常 见 的 细 菌 病 原 体 分 析 。 同时, 计算机凝胶扫描和软件分析有助于创建病 原 菌 PFGE 图 谱 数 据 库 , 通 过 与 数 据 库 中 的 病 原 菌 PFGE 图 谱 比 较 , 来 判 断 被 测 菌 株 与 相 同 菌 属 间 的 染 色 体 DNA 相 似 程 度 。
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