y10091370007大肠杆菌PCR特异引物设计和细菌血标本DNA提取
实验一大肠杆菌DNA的提取（写写帮推荐）
实验一大肠杆菌DNA的提取（写写帮推荐）第一篇：实验一大肠杆菌DNA的提取（写写帮推荐）大肠杆菌总DNA的提取实验原理：本实验利用溶菌酶和碱裂解液SDS使细胞壁破坏，利用氯仿抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA溶液利用乙醇将DNA沉淀下来。
实验目的：1.掌握DNA提取的原理和方法；2.掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法实验材料：1.实验菌株：大肠杆菌2.试剂：TE溶液：Tris•HCl 10 mM，EDTA 1 mM，pH 8.0，20% SDS：溶菌酶（50mg/ml）5M NaCl氯仿：异戊醇（24：1 v/v）无水乙醇0.8%琼脂糖TAE电泳缓冲液仪器：离心机，电泳仪实验步骤：1)取1.5ml培养好的大肠杆菌培养液与离心管中，7,000 rpm离心5 min，弃上清； 2)加入500ul TE溶液洗涤菌体7,000 rpm离心5 min，弃上清；3)用360ul TE溶液悬浮菌体，加入20ul 溶菌酶（50mg/ml），37°C保温30min； 4)加入40ul 20 %SDS使其终浓度为2 %，60°C 水浴30min。
5)加入110ul 5 M 高氯酸钠使其终浓度为1 M，充分混匀；6)加入等体积氯仿：异戊醇（24：1 v/v），充分混匀，4°C 12,000 rpm 离心15min，吸取上清于一新离心管中；7)加入2倍体积的无水乙醇，混匀后12000rpm 离心10min； 8)弃上清，离心管在空气中自然晾干； 9)加入30-40ul TE溶解DNA；10)取3-5ul DNA溶液，琼脂糖电泳检测。
第二篇：实验四植物DNA的提取[定稿]实验四植物DNA的提取一、实验目的掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。
采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析。
二、实验原理1、核酸提取的基本原理核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。
实验分子生物学实验大肠杆菌基因组DNA的提取
大肠杆菌基因组DNA的提取生技基地实验目的与要求以大肠杆菌培养物为材料，学习基因组DNA提取的一般方法。
实验原理基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。
利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。
加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。
在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。
一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。
而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下），并可保证包含PCR 所扩增的片段（一般2kb以下）。
不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。
在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。
尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR 反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。
常规实验中从细菌基因组上PCR扩增目的基因时，一般所用的DNA量较少，可以采用较简单的沸水浴裂解法制备少量的DNA。
在短时间的热脉冲下，细胞膜表面会出现一些孔洞，此时就会有少量的染色体DNA从中渗透出来，然后离心去除菌体碎片，上清中所含的基因组DNA即可用于PCR模板。
而对于大量的基因组DNA制备（如Southern Blotting，需大量基因组），可采用试剂盒抽提。
大肠杆菌质粒DNA的提取
大肠杆菌质粒DNA的提取一、大肠杆菌质粒DNA的提取质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法:碱裂解法:此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下:1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37?振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1,葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1, SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0?静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70,乙醇0(5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0(05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4?下12000,离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4?下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
[注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。
2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。
细菌DNA提取方法
细菌DNA提取方法细菌dna提取方案细菌DNA提取方案细菌DNA提取方案：革兰氏阴性菌，如E.coli，一般有三种可以选择的方法。
一、水煮模板法——主要用于PCR反应1、接种单菌落于LB或脑心平板，连续画线，37摄氏度培养18－24小时。
2、刮取1～2接种环菌苔加入150微升三蒸水中，混匀，100摄氏度煮沸10分钟。
3、12000转/分钟离心10分钟，取上清，－20摄氏度保存备用。
操作最简便，对试剂条件要求低。
缺点是纯度不够高，可能会含有RNA、蛋白等杂质。
但是作为一般检测目的的PCR反应模板已经足够了。
有人称扩增4kb以下片段都可用此种方法制取模版，编者用此类模板PCR可以扩增到3500bp的片段。
编者建议：此法得到的模版保存时间短，强烈建议每月重新制作一次。
二、CTAB/NaCl 法1、接种一单菌落于5mlLB中,30℃培养过夜,2、取1ml种子培养液接入100ml2%LB中,37℃、220r/min培养16小时;3、5000r/min离心10分钟,弃去上清。
4、加入10mlTE离心洗涤后,用10mlTE溶解菌体,混匀,-20℃保存备用。
5、取3.5ml菌悬液,加入184μl10%SDS,混匀,加入37μl10mg/ml蛋白酶K,混匀,37℃温育1小时6、加入740μl5mol/LNaCl,再加入512μlCTAB/NaCl,混匀,65℃温育10分钟。
7、加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。
8、上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。
9、加入0.6倍的异丙醇,混匀,10000r/min离心5分钟,收集DNA沉淀,用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀。
10、用1mlTE溶解DNA,加入终浓度为20μg/mlRNaseA,4℃保存。
CTAB/NaCl法提取的DNA纯度较高，蛋白杂质较少，保存时间长，编者更喜欢把终浓度为20μg/ml RnaseA加在第5步温育的时候，这样最后没有RnaseA污染。
细菌基因组DNA的提取
菌体培养
37 ℃、16— 18h
菌体收集
200μL裂解缓冲液
12000r/min、 30s
弃上清液
12000r/min，10加Tris饱和苯 酚
混匀
12000rmin，3min
取水层加氯仿
混匀12000r/min、3min 取上层清液加 12000r/min、3min 无水乙醇
沉淀加400μL
弃上清 70%乙醇
洗两次
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真空干燥 溶解 DNA
-20 ℃ 冰箱
五、实验注意事项
1、材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少 ，纯度低。
2、采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动 作要轻柔。
3、离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。
4、沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等 。
灭菌
6、将DNA分装保存于缓冲液中，避免
反复冻融
10 10
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七、问题与讨论
1、简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因。
酚氯仿抽提DNA后，会使溶液分层，上层为水相，含有
DNA；中间为蛋白（有时看不到）；下层为有机相。原因是 酚
氯仿可以使蛋白质变性，从而从溶液中析出，但是蛋白密度 会小于酚氯仿，所以离心后它分布在中间；而DNA溶于水而不
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（5）1%SDS（十二烷基硫酸钠）：1gSDS溶于100ml
蒸馏水，灭菌后-4℃保存
（6）mol/LNaCl：称取292.5gNaCl，溶于1000ml蒸馏 水，灭 菌后-4℃保存。
（7）无水乙醇及70%乙醇
（8）超纯水
（9）TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl， 1mmol/LEDTA-Na2（pH：8.0）
大肠杆菌提取DNA
中文摘要目的：用试剂盒法和碱法提取p16重组质粒的比较。
方法：1.5ml菌液移入50mlLB液体培养基中培养12h，将试剂盒法和碱法各分3组，每组加入3.0ml菌液，每种方法中有两组是对照试验；紫外分光光度计法测OD值；酶切；琼脂糖凝胶电泳。
结果：碱裂法的OD值分别为：1.583；1.575；1.735，质粒DNA的浓度为：3.060；3.150；2.370。
试剂盒法的OD（260/280）值为：1.614；1.605；1.656。
质粒DNA的浓度为：；0.390；0.420；0.600。
结论：碱法与试剂盒法用统计学分析没有显著差异。
试剂盒法简单、快捷，DNA纯度高，但质粒DNA的浓度低，提取质粒DNA的量少，并且试剂盒价格昂贵，碱法价格低廉，质粒DNA的浓度高，提取质粒DNA的量多，所以具有较强的实用性，适用于一般实验室研究工作。
关键词：质粒；试剂盒法；碱法；AbstractPurpose : Draw the comparison that p16 recombinated the plasmid with the reagent box law and alkali law. Method : 1. 5ml fungus liquid move in 50mlLB liquid culture train 12h, reagent box law and alkali law all 3 group, every group joins 3. The fungus liquid of 0ml, there are two groups that are tested by the contrast in each kind of method; The law of purple other spectrophotometer examines OD value; The enzyme is cut; Agar-agar candy gel electrophoresis. Result: It split alkali OD the law one including: 1. 583; 1. 575; 1. 735, the density of plasmid DNA is: 3. 060; 3. 150; 2. 370. Whether reagent OD (260/280), box of law value is. 1. 614; 1. 605; 1. 656. The density of plasmid DNA is: ; 0. 390; 0. 420; 0. 600. Conclusion: Alkali law and reagent box law analyse with statistics that there is not remarkable difference. The reagent box law is simple , swift, DNA is high in purity , but the density of plasmid DNA is low, there is little quantity of drawing plasmid DNA, and the reagent box costs an arm and a leg, the alkali law is cheap, the density of plasmid DNA is high, there is much quantity of drawing plasmid DNA, so have stronger practicability, suitable for the research work of general laboratory .Keyword: Plasmid; Reagent box law; Alkali law;前言P16基因又叫MTS(multiple tumor suppressor 1)基因，是1994年美国冷泉港实验室Kamb等发现的新抗癌基因，这是一种细胞周期中的基本基因，直接参予细胞周期的调控，负调节细胞增殖及分裂，在人类50%肿瘤细胞株发现有纯合子缺失、突变，认为P16是比P53更重要的一种新型抗癌基因，有人把它比作细胞周期中的刹车装置，一旦失灵则会导致细胞恶性增殖，导致恶性肿瘤发生。
大肠杆菌质粒提取
一、大肠杆菌质粒DNA的提取质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中二、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。
(1)琼脂糖凝胶电泳装置由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去15年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。
对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。
使用最普遍的装置是Walter Schaffner发明的水平板凝胶。
水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。
在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平台上。
凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。
凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。
（2）琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。
大肠杆菌基因组DNA的提取方式
大肠杆菌基因组DNA的提取方式一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。
1、实验原理提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。
在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白和DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。
用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，最后用无水乙醇沉淀DNA。
为获得高纯度DNA，操作过程中常加入RNaseA除去RNA。
CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定的程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖物质分开。
最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
2、实验试剂与仪器1）实验材料：大肠杆菌2）实验试剂：LB液体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/LNaCl，CTAB/NaCl 溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇3）实验仪器：恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅3、溶液配制1）LB液体培养基：细菌培养用胶化蛋白胨10g/L，细菌培养用酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，去离子水。
(搅拌溶解后，用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容100ml，用20/50ml摇瓶分装5瓶，包扎好，在121℃，1.034×105pa高压下蒸汽灭菌20min.)2）TE缓冲液：1MTris溶液（取Tris242.2g，加ddH2O至1600ml，加热溶解）1Mtris-HClpH8.0溶液（取1MTris溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8.0（需浓盐酸约8.5ml），加ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用）TE缓冲液（10mMTris-HCl1MmEDTApH=8.0，1MTris-HClBufferPH=8.05ml0.5MEDTAPH=8.01ml向烧杯中加入约400mlddH2O均匀混合;将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌，室温保存）3）蛋白酶K：（20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水，-20℃备用）4）CTAB/NaCl溶液：（5%w/v，5gCTAB溶于100ml0.5MNaCl溶液中，需加热到65℃使之溶解，然后室温保存）4、实验方法步骤1、将大肠杆菌接种到灭菌好的LB培养基中，一级培养过夜，以10%的接种量进行二级培养，培养至对数期（4-6h）。
DNA提取及PCR扩增实验报告
PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳之袁州冬雪创作刘琳1131428 环境迷信一、实验目标1．学习并掌握PCR扩增的基来历根基理与实验技术.2．对扩增后的DNA停止琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应成果.二、实验原理1. PCR扩增多聚酶链反应（PCR）技术的原理近似于DNA的天然复制过程.在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐热Taq聚合酶及两个合成DNA的引物，而后加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段.降低溶液温度，使合成引物在低温（55℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段.溶液反应温度升至中温（72℃），在Tap酶作用下，用四种dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段.如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环，使产品DNA重复合成，并在重复过程中，前一循环的产品DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产品DNA的量按指数方式扩增.颠末30～40个循环，DNA扩增即可完成.2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动.在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子自己的大小和构型是主要的影响因素.DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比.分歧构型的DNA分子的迁移速度分歧.该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，操纵DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目标.三、实验资料仪器：PCR扩增仪、0.2ul薄壁管、1.5ml离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪.试剂：TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、两种引物、16S 全长DNA样本、无菌ddH2O、模板DNA、TBE、琼脂糖、EB、显色剂.四、实验步调1. PCR扩增本次试验选择细菌16S rDNA V3区片段停止扩增.1.1根据计算，首先取1.5ml离心管依照2.5ul 10×2O的比例配置足量的PCR反应体系.1.2 分别向9个薄壁管中分别加入24 ul的反应体系，并分别添加8种分歧的模版，并于第9个薄壁管中加入无菌ddH2O作为阴性对照.1.3 将薄壁管放入PCR扩增仪中，依照预定程序停止PCR 扩增.其中循环过程需要达到30~40次.程序如下：预变性：94℃3min循环：94℃变性30s55℃退火30s72℃延伸30s末次延伸：72℃ 5min1.4 PCR扩增完成后，将样品取出并保管于15℃环境中.2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验称取琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，加入适量的0.5×TBE 电泳缓冲液.然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明.摇匀，待冷却至60℃左右，在胶液内加入适量的EB.2.2 取有机玻璃制胶板槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液，使之形成平均水平的胶面. 2.3 待胶凝结后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内.在槽内加入0.5×TBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面.取1μl缓冲液和5μl待测DNA样品混合后，用移液枪滴加至凝胶的加样孔中.2.5 接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超出5V/cm，开端电泳.点样端放阴极端.根据经历调节电压使分带清晰.2.6 观察溴酚兰的带（蓝色）的移动.当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停止电泳.2.7 在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面.关上样品室外门，打开紫外灯，通过观察孔停止观察.五、实验成果与讨论如图所示：从左至右，分别是模版1-8号，第9列为阴性对照.前8列均有分明的条带出现，而阴性对照无显示，说明扩增整体效果很好.图中有上下两条线，上面一条线所覆盖的条带基本可以代表扩增的发生的片段位置，参照图可以看出扩增片段在200bp左右.在第9个阴性对照的第二条线处可以看到较为恍惚的条带，并不是是出现假阴性，而是由于二聚物而发生的条带.通过该条带与最右侧的marker对比可知该片段出现在100bp左右，并不是由于实验操纵等问题而发生的污染.实验的照片显示实验成果有拖尾现象，但是其实不影响后续实验.在实验过程中由于有些试剂加到了管壁上面，并没有完全加入，能够会出现一些误差.别的在第1列条带中出现了其他的亮带，能够是由于在前期的扩增实验中滴加试剂时由于量过少而停止的摇匀和融合等操纵发生了非特异性扩增，也有能够是因为胶板制作过程中梳子的位置分歧适或者胶板制作时边沿处不敷平均导致发生污染.但总体而言，实验成果较为称心.六、实验注意事项1.由于PCR技术非常敏感，可以使一个DNA分子得以扩增，装有PCR试剂的离心管打开之前，应先在微量离心机上作瞬间离心使液体沉积于管底.PCR扩增反应的条件，要节制好温度、时间和循环次数.2.最好在加完所有其它反应成分后才加模板DNA.3.配琼脂糖时应使其完全溶化后方可制胶.4.EB具有致癌作用，配制及使用时应带一次性手套.并在专门的实验室内使用.七、实验收获1.通过本次实验学习并掌握了PCR反应的基来历根基理、实验过程及技术.2.通过本次实验掌握了电泳实验分离DNA的原理和方法.八、思考题1、如果你的研究中要扩增大肠杆菌某个酶的基因，你如何停止相关实验？通过PCR扩增出想要的片段，然后通过凝胶电泳实验停止回收，并与合适的载体毗连，转化进感受态细胞.颠末培养提取质粒，停止酶切或PCR验证，测序最终验证，保管菌种2.一对引物序列为5‘-GACTCCAGTCGAATCTACCA-3’和5‘-AACCGTGGCGACACCGCTAA请计算它们的Tm值及选择合适的退火温度，如果按你算的退火温度做PCR时没有得到相应的产品，你怎么处理？5‘-GACTCCAGTCGAATCTACCA-3’Tm值=4（G+C）+2(A+T)-(5～10℃)=4（3+7）+2（6+4）-(5～10℃)=60℃-(5～10℃)=50~55℃5‘-AACCGTGGCGACACCGCTAA’Tm值=4（G+C）+2(A+T) -(5～10℃)=4(5+7)+2(6+2) -(5～10℃)=64℃-(5～10℃)=54~59℃因此退火温度可以选择在55℃可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性.开端低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度.较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产品的形成.为获得最佳成果，两个引物应具有近似的Tm值.引物对的Tm差别如果超出5℃，就会令引物在循环中使用较低的退火温度而表示出分明的错误起始.如果两个引物Tm分歧，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先停止5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度停止剩余的循环.这使得在较为严紧的条件下可以获得目标模板的部分拷贝.。
检测大肠杆菌细胞DNA的引物及方法[发明专利]
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(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510130787.8(22)申请日 2015.03.24C12Q 1/68(2006.01)C12Q 1/04(2006.01)C12N 15/11(2006.01)C12R 1/19(2006.01)(71)申请人中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心地址313000 浙江省湖州市红丰路1366号湖州南太湖科技创新中心5楼申请人湖州申科生物技术有限公司(72)发明人杨志行 吴婉欣 宗伟英 王滔文明 俞燕 张乐(74)专利代理机构上海一平知识产权代理有限公司 31266代理人崔佳佳 马莉华(54)发明名称检测大肠杆菌细胞DNA 的引物及方法(57)摘要本发明提供了检测大肠杆菌细胞基因组DNA的引物对、包含本发明引物对的检测试剂或试剂盒以及利用所述引物对检测大肠杆菌细胞基因组DNA的方法，所述引物对特异性结合于SEQ ID NO ：1所示序列。
利用所述引物对的PCR 检测方法操作简便快捷、灵敏度高、能区分CHO 细胞、毕赤酵母或人类等干扰性DNA，还能用于对食品或保健品作溯源，从而所检测的食品或保健品是天然来源的。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书13页序列表3页 附图9页CN 106148483 A 2016.11.23C N 106148483A1.一种检测大肠杆菌(E.Coli)细胞基因组DNA的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物和反向引物结合于大肠杆菌细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列。
2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:3所示；或者所述正向引物如SEQ ID NO:6所示，所述反向引物如SEQ ID NO:7所示。
3.一种检测试剂，所述检测试剂包含权利要求1或2所述的引物对。
大肠杆菌质粒DNA提取方法的优选
大肠杆菌质粒DNA提取方法的优选一般认为,判定DNA纯度的方法可依据OD260/OD280大小判定:OD260/OD280≈1.8纯度较好(﹥1.9,表明有RNA污染;﹤1.6,表明有蛋白质、酚等污染)。
从OD260/OD280来看,酚/氯仿抽提法为1.52,含量小于1.6,说明有蛋白质、酚污染;异丙醇提取法和微波炉法分别为1.77和1.73,含量在1.6到1.9之间,说明质粒纯度很好;煮沸法为 1.99,含量大于 1.9,说明提取的质粒DNA中可能含有RNA杂质。
从上表中可以看出各种方法提取质粒DNA的浓度顺序为:异丙醇提取法(195μg/mL)﹥酚/氯仿提取法(175μg/mL)﹥煮沸法(155μg/mL)﹥微波炉法(130μg/mL);由此可见,异丙醇法提取的质粒DNA纯度和浓度都是最高的。
酚/氯仿提取法即为常规提取方法,在提取时分别按规定添加各溶液逐步使细菌溶解,然后加入酚/氯仿进行抽提,所得质粒DNA具有较高浓度,且纯度也可以,具有较高可行性,是常用的方法。
但该方法的缺点在于酚/氯仿提取法中,用苯酚和氯仿进行抽提常常需要离心多次,使质粒DNA损失较大,产率低,操作步骤繁琐[7～8],而饱和酚和氯仿均有很大毒性和挥发性气味,带来诸多危险和不便。
异丙醇提取法延续了常规的酚/氯仿提取法的优点,并用异丙醇代替酚/氯仿进行抽提,尽管异丙醇对蛋白质的变性能力低于苯酚和氯仿,但它能降低分子表面张力,减少抽提过程中所产生的泡沫同时有助于分相,使离心后的上层水相,中层变性蛋白及下层有机溶剂相维持稳定,可以较高地去除质粒DNA中的RNA和杂蛋白[9]。
试验证明此方法快速、有效、便捷而且试验成本低,所提取的质粒DNA纯度和浓度都比较高,所提取的质粒DNA可以直接应用于转化细菌、细胞转染、PCR扩增、酶切分析和DNA重组等试验,并且结果稳定性好又经济,对试验设备要求不高,很大程度上节约了经费,同时去除了酚、氯仿,使试验本身对操作者的危害得以降低,非常适合大多数试验室使用。
DNA提取及PCR扩增实验报告
PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳刘琳1131428 环境科学一、实验目的1．学习并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。
2．对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。
二、实验原理1. PCR扩增多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。
在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐热Taq聚合酶及两个合成DNA的引物，而后加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。
降低溶液温度，使合成引物在低温（55℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。
溶液反应温度升至中温（72℃），在Tap酶作用下，用四种dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。
如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA的量按指数方式扩增。
经过30～40个循环，DNA扩增即可完成。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。
DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
不同构型的DNA分子的迁移速度不同。
该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。
三、实验材料仪器：PCR扩增仪、0.2ul薄壁管、1.5ml离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。
试剂：TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、两种引物、16S全长DNA样本、无菌ddH2O、模板DNA 、TBE、琼脂糖、EB、显色剂。
四、实验步骤1. PCR扩增本次试验选择细菌16S rDNA V3区片段进行扩增。
用PCR技术检测直接从粪便中提取真菌DNA的实验研究
用PCR技术检测直接从粪便中提取真菌DNA的实验研究吴浩;陈珍晶
【期刊名称】《实验与检验医学》
【年(卷),期】2010(028)003
【摘要】目的用PCR技术评价从粪便标本中直接抽提病源真菌DNA的方法 .方法用玻璃珠击打法+QIAamp(R)粪便DNA试剂盒(玻珠法+QIA)和酚-氯仿+锆珠法分别直接抽提在沙氏培养基上培养为阴性的5份肝硬化失代偿患者的粪便标本,然后用真菌通用引物进行PCR扩增比较.结果 QIA+玻珠法直接抽提粪便真菌DNA优于酚-氯仿+锆珠法,且从标本处理到报告结果仅需6～7h.结论用玻珠法+QIA法简单、快速、灵敏,可从粪便标本中直接抽提病原真菌DNA,进行PCR检测,有助于对真菌的快速诊断.
【总页数】3页(P249-250,256)
【作者】吴浩;陈珍晶
【作者单位】武宁县人民医院检验科,江西,武宁,332300;武宁县人民医院检验科,江西,武宁,332300
【正文语种】中文
【中图分类】R379;R446.13
【相关文献】
1.采用实时荧光定量PCR技术比较提取土壤真菌DNA方法的差异
2.粪便基因组DNA提取方法比较及在沙门菌定量PCR检测中的应用
3.用PCR技术直接检测致
病真菌的实验研究4.用PCR技术直接检测白色念珠菌DNA的实验研究5.用错配PCR技术直接检测母系遗传性非综合征型聋相关线粒体DNA C1494T突变
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