第二章 (用)分子克隆工具酶
基因工程复习资料
第二章分子克隆工具酶基因工程工具酶⏹限制性内切酶——主要用于DNA分子的特异切割⏹DNA甲基化酶——用于DNA分子的甲基化⏹核酸酶——用于DNA和RNA的非特异性切割⏹核酸聚合酶——用于DNA和RNA的合成⏹核酸连接酶——用于DNA和RNA的连接⏹核酸末端修饰酶——用于DNA和RNA的末端修饰⏹其它酶类——用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。
第一节限制性核酸内切酶(restriction enzyme)一、限制性内切酶的发现历史核酸酶：催化核酸酯键的水解核酸外切酶：作用于核酸链的末端(3′或5 ′),逐个水解核苷酸。
核酸内切酶：从核酸分子内部切断3′，5′磷酸二酯键。
限制性核酸内切酶：在细菌细胞内存在的一类能识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶。
1、细菌的限制——修饰现象细菌的限制——修饰作用发现细菌的限制（restriction）现象：寄主控制的专一性phageλKR-M 系统的作用:R-M 系统是细菌安内御外的积极措施。
保护自身的DNA不受制；破坏外源DNA使之迅速降解细菌R-M 系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA 的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA 则会被降解。
个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。
限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。
由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。
2、限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶(restriction endonuelease)是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。
它是可以将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。
第二章：分子克隆的工具酶
加几个和加哪几个的问题
/techinfo/re/restrdigpcrii.htm
比如设计引物5'端导入酶切位点的时候, 一般导入3–4 个;导入的碱基, 最好是A/G/C/T比较平均,并能部分平衡 整个引物的GC%和Tm;G/C为主,可以使引物5'形成所谓GC Clamp(有的软件,认为这样好). 别的就没什么了.
1. 现象
* 1975 EcoRI切割 phage (Lambda)中的5个 位点，并不是随机的，靠近右端的位点， 比分子中间的位点切割快10倍。
* 有4个 SacII位点 三个在中央 一个在右臂（Right-terminus）
at 40,386 中央三个快50倍
NEB检测了许多限制酶，有许多酶 的差异在10倍的范围上，但有许多 酶有较大的差异, 如
三、限制酶产生的末端种类 1.粘性末端
１）３’-端突起， ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
2. 平末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
5’-CCC 3’-GGG
GGG-3’ CCC-5’
在对称轴上同时切割DNA的两条链
HaeIII
GG↓CC
EcoRV GAT↓ATC
双酶切 PCR产物
AccI HindIII
EcoRI
CCGGTCGACCGG
2hr 20hr 00
CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG
00 00 10% 75%
GGAATTCC
>90 >90
PstI
GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA
AACTGCAG(N) 14 CTGCAG(N) 20
基因工程主要知识点整理
第一章基因克隆基因工程的基本技术有哪些？答：对核算分子的分离、纯化、回收、分析和检测、切割、连接和修饰，以及序列测定、诱变、扩增和转移等基因操作技术。
构建基因文库一般使用什么作为载体？答：一般使用大肠杆菌作为载体克隆与亚克隆？答：克隆在一等程度上等同于基因的分离。
亚克隆是将目的基因所对应的小段的DNA片段找出来。
PCR对基因克隆有什么作用？答：现在基因克隆可以不用通过构建基因文库来实现，可以通过理性设计和PCR扩增获得大多数所需要的基因。
但是尽管如此，在不知道基因序列的情况下，如相互作用的基因，表达调控因子，新基因等，还需要构建基因文库来进行基因克隆。
第二章分子克隆工具酶限制与修饰系统？答：限制系统可以排除外来DNA。
限制的作用实际就是降解外源DNA，维护宿主稳定的保护机制。
甲基化是常见的修饰作用，宿主通过甲基化来达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用。
并且能够保证自身的DNA不被降解。
使用最广泛的限制酶？答：EcoR I是应用最广泛的限制性内切酶限制性内切酶的命名？答：宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号+序列号。
如：HindIII限制与修饰系统分类？答：至少可分为3类。
II类所占比例最大，其酶分子为内切酶与甲基化分子不在一起，识别位点为4-6bp的回文序列，切割位点为识别位点中或者靠近识别位点。
其限制反应与甲基化反应是分开的反应。
不需要ATP的参与。
限制酶识别的序列长度？结构？答：一般为4-6个bp，即每256和每4096个碱基中存在一个识别位点。
回文序列，不对称序列，多种不同序列，间断对称序列限制酶产生的末端？答：1、黏末端2、平末端3、非对称突出末端什么是同裂酶？分类？答：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。
但他们的切割位点有可能不同。
分为：1、同位同切酶2、同位异切酶3、同工多位酶4、其他限制性内切酶的作用是什么？它的反酶是什么？答：什么是同尾酶？答：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相通的，切实对称的，即他们可产生相同的黏性突出末端。
7(2011)第7讲 分子克隆工具酶9.13
二
其他分子克隆工具酶
（一）DNA聚合酶(DNA polymerase)
1、大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段（Klenow片段） （1）大肠杆菌DNA聚合酶I 特性：具有3种酶活性
聚合酶功能 3’
5’ 5’ 外切功能
3’外切功能
a.5’3’DNA聚合酶活性 底物：单链DNA模板及带3’羟基的DNA引物
MboⅠ▼ GATC
• 【同尾酶】
(isocaudarner):不同来 源的限制性核酸内切酶 识别与切割的核苷酸靶 序列各不相同，但都产
生相同的粘性末端，这
类酶称为同尾酶。 BamHI(GGATCC))和 BglⅡ(AGATCT)。
当一种限制性内切酶在一个特异性的碱 基序列处切断DNA时，就可在切口处留 下几个未配对的核苷酸片段，即5’突出。 这些片断可以通过重叠的5‘末端形成的氢 键相连，或者通过分子内反应环化。因 此称这些片断具有粘性，叫做粘性末端
2.大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow fragment) （1）Klenow酶的基本性质：
• 【Klenow酶】大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋
白酶处理,获得N端三分之二的大肽段,即Klenow酶。
• Klenow酶仍拥有5`→3`的DNA聚合酶活性和3`→5` 的核酸外切酶活性，但失去了5`→ 3`的核酸外切酶 活性。
3.限制性核酸内切酶的分类 • 据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及 是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ辅助因子 识别序列
Ⅰ型
多功能 异源三聚体 ATP Mg2+ SAM 距识别序列1kb处
Ⅱ型
单功能 同源三聚体 Mg2+ 4-6bp回文序列
Ⅲ型
双功能 异源二聚体 ATP Mg2+ 距识别序列下游 24-26bp处 随机性切割
第二章 分子克隆工具酶3.8
1962年W. Arber提出,菌体中含有2种以上功能 不同的酶：
1. 核酸内切酶：能识别切断外来DNA分子的某 些部位，使其使去活性，限制外来只菌体的繁 殖——限制性核酸内切酶；菌体的防御系统。
2. 修饰酶：也能识别限制性内切酶所识别的 序列，并把某些 C 或 A 甲基化，使其不被 RE 降 解——菌体保护自身DNA系统。
(2)同尾酶(isocaudarmer)：不同来源的酶其 识别和切割序列有一定的相关性，作用后能产
生相同的黏性末端，例如BamH I(GGATCC)。同
尾酶产生的DNA片段能通过黏性末端之间的互
补作用而彼此连接起来，但重组后形成的序列
再也不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
同尾酶
Sau3A I GATC CTAG BamH I GGATCC CCTAGG
4.切割后产生平头或黏性末端。
5.Ⅱ型RE酶只需Mg2+， 不需ATP。
Ⅱ型酶切割双链DNA可产生两种不同的切口
1. 平头末端 (blunt end) 即在识别序列的对 称轴上进行切割，例如Hae Ⅲ识别序列为5’GGCC-3’，其切点在G与C之间； 2.黏性末端(cohesive end) 即在识别序列的 两个对称点切开DNA双链，产生末端带有单链 尾巴的切口。黏性末端又可分为两种：从DNA 分子5’端切割产生5’端突出的黏性末端称为 5’黏性末端．如EcoRI；从3’端切割产生3’ 端突出的黏性末端称为3’黏性末端，如Pst I。
第三节
DNA 聚 合 酶
DNA聚合酶
(DNA polymerase)
在细胞内的DNA复制过程中起着重要的作用。 它们通常被分为DNA聚合酶I、Ⅱ、Ⅲ三类。 DNA聚合酶I是基因工程中最常用的工具酶。 基因工程中常用的DNA聚合酶有： 大肠杆菌聚合酶I(全酶)；
基因工程第二章基因克隆所需的工具酶
Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’
3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突起 ２）富含ＧＣ
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叶亚新
四．限制酶的特点
３）对称性—双对称
EcoRI 5’-G A A T T C-3’
3’-C T T A A G-5’
Fok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’ 5’-GGATG(N)9
3’-CCTAC(Ｎ)13-5’ 3’-CCTAC(N)13
ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI
AvaI 5’-CPyCGPuG-3’
CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG
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第二章 基因克隆所需的工具酶
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等
3. III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一
亚单位，限制酶是独立存在的。 上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸
识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。
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三. 限制性内切酶的定义、命名
1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限制 酶。
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四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点 １）识别４-8个相连的核苷酸
第二讲(1) 分子克隆工具酶—限制和修饰
1 限制酶的发现
20世纪30年代初发现噬菌体在不同菌株之 间的限制现象与不受限制现象， 60年代提出 对上述现象解释的假设: 内切酶能识别并切断外源DNA的某些位点 使其失活而限制外来噬菌体的繁殖，属限制酶 类。
λ噬菌体不同感染株对E.coli不同菌株的感染率
λ噬菌体感染率 E.coli菌株 λ（K） λ（B） λ（C）
由于限制酶要求严格的识别和切割 序列，在一段不大的DNA片段中，酶切 位点是不多的，酶切产物片段的大小和 数目也是固定的。 此特性可用于鉴定酶种类和活性测 定，也用于鉴定DNA片段是否有同源性， 或有无变异。
6 同裂酶（isoschizomer ） （
定义：来源不同，能识别相同序列的限制酶。 定义：来源不同，能识别相同序列的限制酶。 特点： ） 特点：1）识别序列相同 2）切割位点可能不同 ） 同序同切酶：识别序列和切割位点都相同。 同序同切酶：识别序列和切割位点都相同。 Hind II与Hinc II GTY/RAC 与 Hpa II与HpaII C/CGG 与 同序异切酶：识别序列相同，但切割位点不同。 同序异切酶：识别序列相同，但切割位点不同。 KpnI GGTAC/C Acc65I G/GTACC
根据识别序列的规律性，找可能的识别序列。
偶数序列，先找GC、CG、AT、TA，然后找其两侧 的核苷酸。 NGCN NATN NCGN NTAN 奇数序列，先找GNC、CNG、ANT、TNA，然后找 其两侧的核苷酸。 NGNC N NANTN NTNAN NCNGN N代表任意碱基。
一般说，在同一个DNA分子中，识别序列 短的出现的概率大，反之概率小。 原则上有n个碱基的识别序列的出现概率 是1/4n 。 如Sau 3A 识别序列GATC，间隔256(44) 个核苷酸就有一次机会出现这个识别序列。 E. coR I GAATTC ？？
第二章 分子克隆工具酶
2 分子克隆工具酶（4学时）概述限制性内切核酸酶甲基化酶（Methylase）DNA聚合酶（DNA polymerase Ⅰ）其他分子克隆工具酶工具酶的定义o在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。
o基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。
所以把这些酶称之为“工具酶”。
o工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。
o自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。
这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA 进而降解非己DNA的防御工具。
o本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。
常用的工具酶2.1 限制性内切酶(restriction enzyme)o限制与修饰（Restriction and modification）o限制酶识别的序列o限制酶产生的末端o DNA末端长度对限制酶切割的影响o位点偏爱（Site preference）o酶切反应条件o星星活性（star activity）o单链DNA 的切割o酶切位点的引入o影响酶活性的因素o酶切位点在基因组中分布的不均一性E.coli k 感染频率下降许多E .coli B 【E .coli B 限制λ（k ）】1. 限制与修饰现象①50年代后Luria 和Human(1952), Bertani 和Weigle (1953) 发现细菌的“限制”现象：2.1.1 限制与修饰（Restriction and modification ）E.coli B 修饰λ(k)*λ(k)感染E.coli(B)细菌如何对λ噬菌体进行限制和修饰?E.coli B对这些λ(K)进行了修饰。
表2-1 λ噬菌体不同感染株对E.coli 不同菌株的感染率111E.coli C 10-4110-4E.coli B10-410-41E.coli KλC λB λK λ噬菌体感染率E.coli 菌株细菌的限制—修饰系统①1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是在λPhage的DNA上。
第二章 分子克隆工具酶
2.1 定义及功能 2.2 种类及作用机理 2.3 使用时的注意事项
2.1 定义及功能
DNA连接酶（DNA ligase）：可使一段DNA的 3` 羟基末端和5`磷酸末端形成3`，5`- 磷酸二酯 键，把两个DNA片段连在一起，封闭DNA双链上形 成的切口的酶。 DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现 的。 J:\生物视频\细胞生物学视频\连接酶\DNA连接酶.
应用：种类繁多，分子克隆中最常用的内切 酶。
(1) 基本特性
识别长度为4-8个核苷酸的特异序列；最常见的 为6个碱基. 许多识别序列具回文结构，如Hind Ⅲ 的识别序 列： 5` AAGCTT 3` 3` TTCGAA 5 切割产生的末端有粘端 (cohesive/sticky end) 如BamH I (G↓GATCC) 和平端 (blunt end) 如 Sma I (CCC ↓GGG)
限制性核酸内切酶的反应条件
2) 反应系统因素
缓冲液（无菌、无污染） 金属离子 如：Ⅱ型酶需Mg2+，若以Mn2+代替Mg2+（如 HindⅢ，ECORI）则特异性改变。 离子浓度不合适会抑制酶活。 牛血清蛋白(BSA) BSA 是酶稳定剂，可避免热、表面张力、化 学品导致的酶变性。过量BSA会引起电泳拖尾
物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1
单位。
(3)限制性核酸内切酶的反应条件
1)底物 DNA
DNA纯度:
RNA 与 E 结合影响有效酶浓度； DNA浓度: [DNA]过大，抑制酶活，影响酶分子扩散 如：4μg DNA /1U HPaⅠ 50μl 37℃ 15h
1μg DNA /1U HPaⅠ 50μl
噬菌体T4DNA连接酶
第二章 工具酶.限制酶
第一节 第二节 第三节 第四节 逆转录酶及其它酶
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基因工程工具酶
“工若善其事，必先利其器”。 基因工程的操作，是分子水平的操作， 它涉及到一系列相互关连的酶促反应， 要靠一些重要酶类作工具，对基因进行 人工切割和拼接，故称为“工具酶”。 已知有许多酶在基因克隆实验中有着广 泛的用途。 工具酶是从哪里获得的呢？
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四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性
1. 为单链多肽, 最适pH6-8, 能被盐抑制、被Mg2+激活； ，2. 底物DNA分子双链中有特异性识别序列，通常有 4-8个bP甚或更多，大都为一回文对称的结构（即识别 序列中有一个中心对称轴，若从这个轴向两侧方向 “读”，内容都是完全相同的，也称为反向重复序 列）。 3 . 一般可在特异性识别序列内切割双链DNA分子 （有例外），产生链的断裂，断裂端有粘性末端和平 齐末端之分。其中两个粘性末端可以互补配对连结成 重组分子。 4. 其他：同裂酶、同尾酶、远距离裂解酶、双切割酶 等。分述如下：
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l
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二．核酸内切限制酶的类型 及切割频率 1、类型
特性 （7项） I型
II型
分开的核 酸内切酶 和甲基化 酶
III型
限制和修 饰活性
单一多功 能的酶
具有一种 共同亚基 的双功能 的酶
核酸内切 限制酶的 蛋白质结 构
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三种酶切末端
3’粘性末端（如Pst Ⅰ） 5’粘性末端（如EcoR Ⅰ）
分子克隆常用工具酶
离纯化的依赖DNA的DNA聚合酶，最适温度75℃-80℃ 需要Mg2+(10 mmol／L)，在低浓度Mn2+(2 mmol/L)中有 低活性，Ca2+使其完全失活，一价阳离子高至0.1 moI ／L对活性无影响，而最适浓度NaCl为40 mmol/L，KCl 为60 mmol/L 最适pH7.8(Tris-HCl)，与大肠杆菌DNA聚合酶相比，其 最大特性是耐高温和无核酸酶活性
第二章 分子克隆常用工具酶
Tel: 87286939 Office: 园林楼620
DNA 的基本结构
Structure and features
• 每一单链具有 5’-3’极性
• 两条单链间以氢键连接 • 两条单链，极性相反，反向平行 • 以中心为轴，向右盘旋
植物基因工程
植物基因工程
Replication
2)平末端DNA片段的连接
a. 直接用T4 DNA连接酶连接：效率不高，较少采用。 b. 同聚物加尾连接平末端DNA片段：先用末端核苷酸转
移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA 连接酶进行连接 c. 用衔接物连接平末端DNA分子：目的是在平末端分子 上构建限制性核酸内切酶酶切位点，经酶切后产生 特异的粘性末端，从而与具有互补末端的DNA连接
以RNA分子为模板合成互补的cDNA链
将同聚物尾巴加到线性双链 或单链DNA分子的3'-OH末端或DNA的3'-末 端标记dNTP 降解单链DNA或RNA，产生带5'磷酸的单核苷酸或寡聚核苷酸，同时也 可切割双链核酸分子的单链 能在高温（72℃）下的单链DNA为模板，从5'→3'方向合成新生的互补 链
何水林版基因工程第二章基因克隆的工具酶幻灯片
Gene Engineering－第二章 基因克隆的工具酶
1 限制性核酸内切酶(restriction enzyme)
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978
Werner Arber
Daniel
Hamilton O.
Switzerland
Nathans
Gene Engineering－第二章 基因克隆的工具酶
Gene Engineering－第二章 基因克隆的工具酶
1.3 限制性核酸内切酶的命名
属名
种名 株名
Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株
H i n d III Hind III
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
restriction enzyme
一类能从DNA分子中间水解磷酸二酯键,从而切断 双链DNA的核酸水解酶。它们不同于一般的脱氧核糖 核酸酶（DNase），它们的切点大多很严格，要求专 一的核苷酸顺序─识别顺序。
限制性核酸酶的发现,为基因结构、DNA碱基顺序分析 和基因工程的研究开辟了途径。
Gene Engineering－第二章 基因克隆的工具酶
Gene Engineering－第二章 基因克隆的工具酶
在Ecoli.K上生长的λ噬体则 表示为λ（K）。 实验表明，用这种λ（K） 噬菌体感染Ecoli. B，形成 噬菌斑的效率就很低 因此λ（K）噬菌体受到了 B菌体的限制。
Gene Engineering－第二章 基因克隆的工具酶
Gene Engineering－第二章 基因克隆的工具酶
0 - 50 mM 低盐酶 100 mM 中盐酶 150 mM 高盐酶
分子克隆工具酶_图文(精)
第二章分子克隆工具酶DNA 重组技术中对核酸的“精雕细刻”主要用酶作为工具。
60年代末，70年代初科学家们陆续发现了DNA 连接酶、T4DNA 连接酶、Ⅱ型限制性核酸内切酶Hin fI 和Eco RI、反转录酶等，才使他们能对DNA 分子进行剪切、连接等基因操作，故称这些酶为工具酶。
到目前为止，世界上发现的工具酶种类和数量繁多，现将重组DNA 分子技术中常的工具酶简介如下。
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）在重组DNA 技术中有重要地位，在此较详细介绍。
第一节限制性核酸内切酶核酸酶可分为两类：核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶(endonuclease则从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸链切断。
很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并将其分解，1962年发现这是因为细菌中含有特异的核酸内切酶，能识别特定的核酸序列而将核酸切断;同时又伴随有特定的核酸修饰酶，最常见的是甲基化酶，能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化，从而避免受内切酶水解，外来核酸没有这种特异的甲基化修饰，就会被细胞的核酸酶所水解.这样细胞就构成了限制一修饰体系，其功能就是保护自身的DNA，分解外来的DNA，以保护和维持自身遗传信息的稳定，这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。
这就是限制性核酸内切酶名称中“限制”二字概念的由来。
1.1 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease1.1.1 限制性核酸内切酶的概念是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸水解酶。
它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。
到目前为止，已经分离出可识别230种不同DNA 序列的Ⅱ型限制性核酸内切酶达2300种以上。
在限制性核酸内切酶作用下，侵入细菌的“外源”DNA分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 碱基甲基化，在此修饰酶的保护下，则可免受限制性核酸内切酶的降解。
第2章 分子克隆工具酶
（2）同尾末端的连接。
不同的同尾酶切割 DNA 产生的末端再相互连 接时，可产生新的酶切位点，同时原来的酶切 位点却消失。 例如 BamHⅠ（G↓AATCC）+ BclⅠ （T↓GATCA）→ AlwⅠ（GGATC 4/5），又如 XbaⅠ（T↓CTAGA）+AvrⅡ，或 NheⅠ 或 SpeⅠ 或 StyⅠ（CCTAGG）→ BfaⅠ（C↓TAG） 也产生了新的酶切位点
2. 反应温度
大多数为 37℃ ，一部分为 50-65℃ ，少数 2530℃ 高温作用酶在 37℃ 下的活性会下降，多数仅 为最适条件下的 10-50%
3. 反应时间
反应时间通常为 1 小时或更多，许多酶延长反 应时间可减少酶的用量 EcoRⅠ 若反应 16 小时，所需酶量为正常酶切 时间的 1/8 HindⅢ为1/8；KpnⅠ为1/4；BamHⅠ为1/2
属名 种名 株名
嗜血流感杆菌d株
Haemophilus influenzae d H i n d III
H i n d III
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
Escherichia
Coli
Ry13
EcoR I
属名 种名 株系 编号
若种名头2个字母相同 则其中一个可用种名的第一和第三个字母。
6. 归位内切酶——I-prefix 和 pI-prefix 系列酶
有些线粒体、叶绿体、核 DNA 、T 偶数噬菌 体含有一些编码内切酶的内含子，有些 intein （protein splicing element） 也有内切酶的活性， 这两类内切核酸酶称为 I-prefix 和 pI-prefix 系 列内切酶，它们识别的序列很长。 I-prefix 是由在 RNA 水平上剪切和编码的
分子克隆工具酶(1)
1
体外重组DNA技术所 需的基本条件？
A. 用于核酸操作的工具酶 B .用于基因克隆的载体 C. 用于基因转移的受体菌或细胞
用于核酸操作的工具酶有哪些？
精品医学ppt
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第二章 分子克隆工具酶 Enzymes Used in Molecular
Cloning
精品医学ppt
3
在基因工程的实际操作中，工具酶 的使用是一项基本技术。
限制酶是一类能够识别双链DNA分子中 的某种特定核苷酸序列，并由此切割 DNA双链结构的核酸水解酶。
限制酶存在于细菌中，也存在于一些病 毒中，真核生物中没有限制酶。
精品医学ppt
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一、限制酶的命名与分类
1、命名
1973年H.O. Smith和D. Nathams首次提出命名原则， 1980年Roberts在此基础上进行了系统分类
主要特性
Ⅱ型
Ⅰ型
Ⅲ型
酶分子 内切酶与甲基化酶不在 三亚基双功能酶 二亚基双功能酶
一起
识别位点 4-6bp，多为回文序
二分非对称
5-7bp非对称
列
切割位点 识别序列内或附近特异 无特异性，距识别序 距识别序列下游24-
切割
列1kb外
26bp处
在体外对DNA进行分离纯化、连接 重组或者修饰合成等，都会涉及一 系列酶促反应。
用于基因工程的工具酶种类繁多， 根据其功能可粗略分为限制酶、连 接酶、聚合酶和修饰酶4类。
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4
基因工程的操作，是在分子水平上 的操作，是依赖一些酶 (如限制性 核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶 等)作为工具对基因进行人工切割， 拼接和扩增等操作。所以把这些酶
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W=A or T S=C or G
6：EcoRI HindIII
G AATTC A AGCTT
>6 Not I
GC GGCCGC 8
BbvCI CC TCAGC
7
PpuMI RG GWCCY 7
2.结构 ① 回文对称（旋转镜像对称） DNA两条链的对称位置。
切割位点在
EcoRI
GAATTC CTTAAG
化酶
酶
分子不在一起
4-6bp, 大多数 5-7bp 非对称 为回文对称结 构
在识别位点中 在识别位点下 或靠近识别位 游 24-26bp 点
分开的反应 同时竞争
限制作用是否 Yes
No
Yes
需用 ATP
类型II(type II)占93%
识别回文序列(palindromic sequence),
在回文序列内部或附近切割,产生带3’-OH和
•全部辅音按字母读,如pstⅠ
限制性酶和修饰酶的数量
早前上是限制性酶加R，是修饰酶加M,且菌株 号和序号小写 1968年 下半年 615R 98M 1998年 10000细菌 古细菌
3000种酶 200多特异性 到2006年2月为止,共发现3773种限制酶,810种 甲基化酶
到2011年？（查）
三、限制性核酸内切酶的类型
5’-P基团的DNA产物 需Mg2+,相应的修饰酶只
需SAM。
• EcoRI
GAATTC CTTAAG
识别序列(recongnition sequence)主 要为4-6bp,或更长且呈二重对称的特殊序 列。
但有少数酶识别更长的序列或简并序 列(degenerate sequence),切割位置因酶 而异,有些是隔开的。
裂口(gap)
缺口(nick) 切口= 断口(cut)
图1 ds-DNA结构: 裂口, 缺口, 断口
连接酶只能封闭缺口(nick),不能连接裂口(gap)。
• 切割位点可为获得DNA物理图(Physical map)的特殊标记
• 利 用 限 制 性 内 切 酶 （ Restriction endonuclease ） 切 割 产 生 特 殊 DNA 片 段 的能力使得纯化那些DNA片段成为可能。
3.核酸修饰酶类 ① 甲基化酶 ② 激酶 ③ 基因转移酶 ④ 磷酸酶
第一节 限制性内切酶
任何物种都有排除异物,保护自身的防御机制 • 人的免疫系统（immunity system） • 细 菌 的 限 制 与 修 饰 系 统 （ restriction and
modification system) 限制性内切酶（restriction endonuclease) 修饰酶 (modification enzyme）
3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-G-T-C…5’
5’…G-C-T-C-A-G-OH IIIIII
3’…C-G-A-G-T-C-P
Pvull 37ºC
P-C-T-G-C-A-G…3’ IIIIII
OH-G-A-C-G-T-C…5’
3.非对称突出端
① 来自非对称识别序列（非旋转对称） 当识别序列为非对称序列时,切割
一、限制与修饰 Restriction and modification
• 限制：细菌为防御外来DNA入侵而将其降解 的现象。（一般由限制酶来降解外源DNA)
• 修饰：细菌为防止自身DNA被降解而修饰自 身DNA。 (一般由甲基化酶进行修饰）
• 限制与修饰往往成对存在， • 它们的识别序列往往相同。
依据酶的亚单位组成 识别序列的种类 是否需要辅助因子分类 可分三类(I, II III) 也有分四类,IIs类,即II亚类
各种限制与修饰系统的比较
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
酶分子
识别位点
切割位点
限制反应与甲 基化反应
三亚基多功能 酶
二分非对称
无特异性，至 少在识别位点 外 1000bp 互斥
内切酶与甲基 二亚基双功能
限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基， 最常见的为 6 个碱基。当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的 情况下，平均每 256 个和 4096 个碱基中会出 现一个识别位点（44 =256，46=4096）（原因：数 学排列组合）。
以下是几个有代表性的种类，箭头指切割位 置。
• 这种限制系统(restriction system) • 可排除外来的DNA
而自身的DNA由于甲基化，不能被限制 酶切割。
甲基化是常见的修饰作用: 可使腺嘌呤A 成为甲基-腺嘌呤, 胞嘧啶C成为甲基-胞嘧啶。
5’
GAATTC
3’
3’
CTTAAG
5’
EcoRⅠ
限制作用
M.EcoRⅠ
修饰作用
5’ 3’
列之间含若干个任意碱基。
AlwNI CAGNNNCTG
DdeI
CTNAG
3．切割位置
① 内部 大多数
AccBSI CCGCTC GGCGAG
(-3/-3)
Sau3AI GATC NlaIII CATG
③ 两侧 BcgI (10/12)CGA(N)6TGC(12/10)
DNA产物的末端是不同的
CCTCAGC BbvCI GGAGTCG
② 简并序列
AccI
GT/MKAC
GTATAC GTAGAC GTCTAC GTCGAC
③ 间隔序列 DraIII CACNNNGTG
EarI CTC T TC (1/4) GAG AAG
4.同裂酶(isoschizomer)
识别相同序列的限制酶称同裂酶。 但它们的切割位点可能不同。
HindIII
AAGCTT TTCGAA
② 非对称
AccBSI CCGCTC (-3/-3) GGCGAG
BssSI0
CTCGTG GAGCAC
③ 多识别序列 (简并序列) AccI GTMKAC ( M=A 或 C) HindII GTYRAC (Y=C 或 T )
④ 间断对称 一些限制酶识别的序列呈间断对称,对称序
3’…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’
2.平端 Blunt end
在对称轴上同时切割DNA的两条链
HaeIII
GG↓CC
EcoRV GAT↓ATC
XmnI GAANN↓NNTTC 产生平末端的 DNA 可任意连接，但连接
效率较粘性末端低。
5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-C-A-G…3’ IIIIII IIIIII
II亚类( type IIs)占5% • 识别位点非对称,非间断 4-7bp • 切割位点可能在识别位点一侧20bp范围内
某酶 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTNAG
R:与typeII具有相同的辅助因子要求 M:通常由两个M来完成,各作用一条链
限制酶识别的序列 1．限制酶识别序列的长度
具体可分为以下几种情况：
① 同序同切
这些酶识别序列和切割位置都相同。
HindII HincII GTY/RAC
HpaII HapII
C/CGG
MobI Sau3AI /GATC
② 同序异切
识别的序列是相同的，但它们的切割
位点不同。
KpnI Acc65I
Asp718I
GGTAC/C G/GTACC G/GTACC
属名
种名
•H：①宿主 属名第一字母（从分离的菌株属名取
第一个字母,大写）
•in：②种名前两个字母（从分离的菌株种名取前
两个字母,小写）
d: ③菌株代号或生物型号 Ⅲ: ④不同限制酶：如第三个限制酶（序号 罗马字）
Ｍ: ⑤修饰酶：甲基化 Ｍ．HindⅢ
读音： •有辅音和元音的拼起来读，
•如HindⅢ, EcoRⅠ
• 获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中 的基本元件。
常用的工具酶
•1．使核酸降解的核酸酶类 (1) 核酸酶（作用对象不同） ① 核糖核酸酶 ② 脱氧核糖核酸酶
2)核酸酶（水解方式不同) ① 限制性核酸外切酶 ② 限制性核酸内切酶 限制性酶：具有特异性切割 非限制性酶：随机切割（无用）
２.催化核酸合成的酶类 ① DNA聚合酶 ② RNA聚合酶 ③ 连接酶
G/TCGAC GT/MKAC GTY/RAC
EagI EagI SalI SalI SphI SphI
5.同尾酶 许多不同的限制酶切割 DNA 产生的末端是
相同的，且是对称的，即它们可产生相同的粘 性突出末端。
这些酶切割 DNA 得到的产物可进行粘端连 接。以下几种酶产生的末端是相同的。由一对 同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位 点，特称之为“杂种位点”（hybrid site）。
10(N)CGA(N)6TGC(N)12 12(N)GCT(N)6 ACG(N)10
④ 单侧 BbvI GCAGC (8/12)
BspMI ACCTGC (N4) TGGACG(N8)
四、限制性内切酶产生的末端
1.粘性末端 （匹配粘端）
粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成 的具有互补碱基的单链延伸末端结构。它们能够 通过互补碱基间的配对而连接起来。具平末端的 DNA片段则不易于连接。限制酶都可以产生两种粘 性末端，一种是形成具有3′-OH单链延伸的粘性 末端，另一种则是形成具有5′-P单链延伸的粘性 末端。
第二章
分子克隆工具酶
任课教师： 生命科学技术学院 生物工程系 王 莹 教授、博士
• 从基因工程技术过程来看，除了DNA和RNA 的提取、凝胶电泳、分子杂交和转化等一 系列外，极为重要的技术就是一系列酶催 反应。
• 基因工程是建立在酶催反应的基础上的， 其重要性不言而喻。