CFSE细胞增殖检测
CFSE标记结合流式细胞术检测单核细胞Siglec-1刺激CD4 +／CD8 +T细胞增殖
文献标识码 ： Ａ
文 章 编 号 ：６ ３４ ３ （０ ］ １ ００ ｌ ７ １０ ２ １） １７ ３ ５ ６
Ｃｏ ｂ ｎｅ ｐｐｌｃ ｉ ｎ ｏ ｍ ｉ ｄａ ｉ ａｔｏ ｆ ＣＦＳ ｌ ｂｅ ｉ ｇ ａ ｌ ｗ ｙ ｏ ｅ ｒ ｎ ｈ ｔ ｃ ｉ ｎ ｏ ｈｅ Ｅ ａ ｌ ｎ ｎｄ ｆｏ ｃ ｔ ｍ ｔ ｙ ｏ ｔ ｅ ｄｅ ｅ ｔｏ ｆ ｔ
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（ＡＣＳ） ａ ｅ ｌｈｙ ｃ ｎｔｏｌ ｅ ｅ ｉｏａｔ ｄ ｂｙ ｍ ａ ｎｄ ｈ ａ ｔ ｏ ｒ ｓｗ ｒ ｓ ｌ ｅ ｇｎｅ ｉ— ｃ ｉａｔｄ ｃ ｌ ｓ ｒ ｉ （ Ａ ＣＳ） ＣＤ４ ａ ｔｃ ａ ｔｖ ｅ ｅｌ ｏ ｔｎｇ Ｍ ． ｎｄ ＣＤ８ Ｔ ｅｌ ｒ ｍ ｅ ｈｈｙ ｈ）ｄ ｃ ｌｓ ｆｏ ｈ ａ ｂ ｏ
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CFSE细胞增殖实验
C F S E细胞增殖实验集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#准备：1.20ml 预冷5%FBS(HI)-PBS2.50ml 预冷MACS buffer3.70um滤网4. RBC lysis5.LS column6.50ml 37度预热PBS7.50ml 37度预热complete culture medium(RPMI 1640 +10% Heat InactivatedFBS+10 mM HEPES+1 mM penicilline streptomycin+ 50 mM 2-mercaptoethanol)（一）CD3抗体包被取96孔板每孔加入100ul 10ug/mlanti-CD3抗体（PBS）密封4度过夜。
（二）淋巴细胞获取1.小鼠的脾脏结摘取于10ml 冷5%FBS-PBS中。
2.于70um滤网研磨滤过，500g 4度 5min离心后弃上清。
3. RBC lysis裂红5 min，10ml 冷5% PBS终止。
4.500g 4度 5min 离心后弃上清，10mlMACS buffer重悬，计数。
留取105个细胞进行FACS。
（三）磁珠分选nave CD8a+ T细胞cell suspension at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely.cell pellet in 400 μL of MACS buffer per 108 total cells.100 μL of Naive CD8a+ T Cell Biotin-Antibody Cocktail per 108 total cells.well and incubate for 5 minutes in the refrigerator (28 °C).5.Add 200 μL of MACS buffer per 108 total cells.6.Add 200 μL of Anti-Biotin MicroBeads per 108total cells. Add 100 μL of CD44 MicroBeads per 108 total cells.7.Mix well and incubate for an additional 10 minutes in the refrigerator (28 °C).8.Wash cells by adding 10ml of MACS buffer per 108 cells and centrifuge at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely.9.Resuspend up to 108cells in 500 μL of MACS buffer.10.Place LS column in the magnetic field of a suitable MACS Separator.11. Prepare column by rinsing with 3 mL of MACS buffer.12.Apply cell suspension onto the column. Collect flow-through containingunlabeled cells, representing the enriched naive CD8a+ T cell fraction. 13.Wash column with 3 mL of MACS buffer. Collect unlabeled cells that passthrough, representing the enriched naive CD8a+ T cells, and combine with the flow-through from step 3.14.Determine cell number. 留取105个细胞进行FACS。
FlowJo分析细胞增殖
注册 |登录构建全球华人科学博客圈返回首页 RSS 订阅 帮助 FlowJo 分析细胞增殖已有 521 次阅读 2012-8-21 14:20 |个人分类:FlowJo 使用|系统分类:科研笔记|关键词:细胞增殖，数据分析，FlowJo ，CFSE ，博文FlowJo 分析细胞增殖CFSE 法检测细胞增殖的原理：CFSE(CFDA-SE)是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，CFSE 进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。
在细胞分裂增殖过程中，CFSE 标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半。
演示数据：Proliferation tutorial ：实验中所用的荧光染料为eFluor ® 670 Proliferation Tutorial Data.rarFlowJo 分析细胞增殖的步骤：1. 确定要分析的目标细胞群（下图为演示数据中的样本Sample 1）2. 打开增殖分析平台：到“工具”菜单栏中选择“细胞增殖”，打开增殖分析平台，将参数轴中的参数更换为本实验中所采用的APC_A::670Dye ，如下图所示：张千君加为好友 给我留言 打个招呼发送消息FlowJo 中文技术博客分享/u/FlowJo流式细胞技术相关资源分享，流式细胞数据分析，流式技术支持及培训博客首页动态记录博文相册主题分享好友留言板个人资料左边为拟合结果图，右边为各个统计数据，其中：RMS: root mean square error的缩写，反映的是拟合结果与实际数据的吻合程度，RMS数值越小，说明拟合结果越好。
3.打开增殖分析平台左下角的“Options”选项选项中各个参数的介绍：#Peaks：增殖峰的数目，默认的最大数目为8个。
随着细胞的分裂，子代细胞所含的CFSE荧光染料的量以2倍的比例递减，分裂到第七代的时候，第七代细胞的CFSE荧光强度只有原代细胞的1/128，可能低于细胞的自发荧光。
如何在组织中检测细胞增殖,分化和凋亡
在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡的方法一、检测细胞增殖的方法（1）直接方法：通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力1、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。
用同位素3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况。
但是具有放射性。
2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成为一种良好的细胞标记物。
CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。
当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。
这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。
3、Brdu检测法Brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu 单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。
同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义4、增殖标志检测有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增值细胞缺乏这些抗原，您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。
例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期表达，而在G0期和G1 期(非增殖期)不表达。
用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。
由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。
不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。
其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括，增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB和磷酸化组蛋白H3。
CFSE示踪与流式细胞仪检测法研究环磷酰胺对T淋巴细胞增殖的影响
◇实验方法学◇CFSE 示踪与流式细胞仪检测法研究环磷酰胺对T 淋巴细胞增殖的影响包晶晶,林海霞,马 璟(上海医药工业研究院国家上海新药安全评价研究中心,上海 201203)收稿日期:2009-12-30,修回日期:2010-03-18基金项目:科技部“十一五新药创制”重大专项资助课题(No2008ZX093052006);上海市科委企业技术创新团队项目资助(No 08430516200)作者简介:包晶晶(1983-),女,硕士生,E 2mail:jjb19831@g mail .com;马 璟(1963-),女,博士,研究员,博士生导师,通讯作者,Tel:0212508003332106中国图书分类号:R 2332;R 329.24;R 331.125;R 979.1;R 979.5文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2010)06-0828-05摘要:目的 利用定量分析羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyflu 2orescein diacetate succini m idyl ester,CFSE )时间系列数据的方法研究淋巴细胞细胞增殖动力学及免疫抑制剂对淋巴细胞增殖抑制机制的研究。
方法 环磷酰胺造成小鼠免疫抑制模型,并用CFSE 染料给对照组和给药组动物的淋巴细胞染色,通过数学模型拟合法分析数据。
结果 对照组和给药组淋巴细胞增殖进入第一代分裂的时间分别是27117h 和22188h,每代细胞死亡率分别为20%和40%;进入分裂前的细胞半衰期分别为31153h 和43132h 。
结论 通过数学拟合法对CFSE 数据进行定量分析,探讨药物对淋巴细胞增殖影响的机制,该实验中的药物环磷酰胺抑制淋巴细胞增殖的方式可能是使细胞增殖时每代细胞的死亡率增加所致。
关键词:CFSE;定量分析;数学拟合;流式细胞仪;淋巴细胞增殖;环磷酰胺 传统的测定淋巴细胞增殖的方法只能通过细胞数量的变化来反映细胞增殖的的变化,不能更深入的洞察细胞增殖是如何被改变的。
基于CFSE染色的猪淋巴细胞增殖试验方法的建立
本文受国家973计划(2005CB523202)资助作者简介:赵和平(1983年-),男,硕士,主要从事动物病毒疫苗效力评价研究;通讯作者及指导教师:仇华吉(1967年-),男,博士,研究员,主要从事分子病毒学与免疫学研究,E mail:huajiqiu@ 。
免疫学技术与方法基于CFSE 染色的猪淋巴细胞增殖试验方法的建立赵和平 孙 元 袁 远 仇华吉(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室,哈尔滨150001)中国图书分类号 S852 文献标识码 A 文章编号 1000 484X(2009)02 0159 05[摘 要] 目的:建立一种方便可靠的评价猪只细胞免疫水平的试验方法。
方法:用终浓度分别为3、6、9和12 g/ml 的刀豆素A(Con A)刺激经羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(C FSE)染色的猪外周血单个核细胞(PBMC)3、5和7天,然后用荧光标记的单克隆抗体对CD4+和CD8+细胞进行标记,最后利用流式细胞术分析。
结果:不同浓度ConA 刺激后,猪PB MC 增殖能力不同,Con A 浓度为6 g/ml 时CD4+和CD8+细胞的细胞分裂指数最大,用MTT 试验也获得相似结果。
对PB MC 刺激5天后进行分析相对较好。
结论:建立了一种基于活细胞染料C FSE 染色的猪淋巴细胞增殖试验方法,该方法可以在单个细胞水平上有效地分析刺激后CD4+和CD8+细胞亚群的增殖水平,进而评价细胞免疫水平。
[关键词] 猪淋巴细胞;细胞免疫;C FSE 染色;淋巴细胞增殖试验A method for detecting porcine lymphocyte proliferation based on CFSE stainingZ HAO He Ping ,SU N Yuan ,YU AN Yuan,QIUHua Ji.Division o f Swine Infectious Diseases,Harbin Veterinary Research Institute,The Chinese Academy o f Agricultural Sciences,Harbin 150001,China[Abstract] Objective:To develop a method to assess porci ne cell mediated immunity (CMI).Methods:PBMCs from pigs were stained wi th intracellular fluorescen t dye,CFSE,and stimulated wi th varied amounts of ConA (0,3,6,9,and 12 g/mL),and plated in 3replicate cul tures for 3,5,or 7days.Then CD4+cell and CD8+cells were labeled with fluorescent antibodies.Data were acquired using flow cytometry (FC M )and analyzed using CellQuest software.Results:Cell division indices of porci ne CD4+and CD8+cells were different when porcine PB MCs were sti mulated with different doses of ConA.The results were similar to those obtained by MTT method.Op timal results were obtained when porcine lymphocytes were s timulated for 5days.C onclusion:The CFSE based method developed in this study can be used to analyze the proliferation of di fferent cell subsets si multaneonsly.[Key w ords] Porcine lymphocytes;Cell mediated immunity;CFSE staining;Lymphocyte proliferation目前对我国养猪业危害最大的主要是一些病毒性疾病,这些疫病主要通过疫苗接种手段来控制。
CFSE法检测刺激剂对淋巴细胞增殖与活化
素（ Ｐ Ｈ Ａ） 和佛 波酯 （ Ｐ ＭＡ） 培养７ ２ ｈ对淋 巴细胞分裂与增殖 的影 响． 并采用 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ法检 测不 同刺激剂
对淋 巴细胞上 清 Ｉ Ｆ Ｎ ￣ ／ 质量浓度的影响． ０ ． １ ２ ５ ｍＬ的抗 Ｃ Ｄ ３ ／ ２ ８抗体和 ５或 １ Ｏ ｇ ／ ｍ Ｌ的 Ｐ Ｈ Ａ 可
ｏ ｆ Ｎｏ ｎ—Ｃ ｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ｌ ａ Ｄｒ ｕ ｇ Ｍｅ ｔ ａ ｂ ｏ ｌ ｉ ｓ ｍ ｎｄ ａ Ｐ Ｋ ／Ｐ Ｄ Ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ，Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｍａ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ａｃ ａ ｄ ｅ ｍｙ ｏ ｆ
中图分 类号 ： Ｒ ４ ４ ６
文献标识码 ： Ａ
文章 编号 ： １ ６ ７ ２— ０ ９ ４ ６ （ ２ ０ １ ７ ） ０ ２— ０ １ ２ ９— ０ ６
ＣＦＳ Ｅ— － ｌ ａ ｂ ｅ ｌ ｅ ｄ ｐｒ ｏ ｌ ｉ ｆ ｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ ａ ｓ ｓ ａ ｙ ｓ ｆ ｏ ｒ ａ ｓ ｓ ｅ ｓ ｓ ｍｅ ｎｔ ｏ ｆ Ｔ ｃ ｅ ｌ ｌ ｆ ｕｎ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎｄ ｕｃ ｅ ｄ ｂ ｙ ｄ ｉ ｆｅ ｒ ｅ ｎｔ ｓ ｔ ｉ ｍｕ ｌ ａ ｎｔ ｓ
Ｖ ｏ １ ． ３ ３ Ｎ ｏ ． ２
Ａ ｐ ｒ ． ２ ０ １ ７
Ｃ Ｆ Ｓ Ｅ法 检 测 刺 激 剂 对 淋 巴细胞 增 殖 与活 化
薛妮娜 坤 ， 董 凯 ， 来芳芳 ， 黄 蕊 ， 陈晓光ｈ
（ １ ．中国医学科学 院药物研究所 ， 天然药物活性物 质与功能 国家重点实验室／ 创新药物非Ｉ 临床药物 代谢及 Ｐ Ｋ ／ Ｐ Ｄ研究北京市重点实验 室 ， 北京 １ ０ ０ ０ ５ ０； ２ ．天津红 日药业股份有 限公 司 ， 天津 ３ ０ １ ７ ０ ０ ）
细胞增殖检测方法简介
细胞增殖检测方法简介1.检测细胞代谢活性检测细胞的代谢活性也可以反映细胞增殖的情况。
在细胞增殖过程中乳酸脱氢酶的活性会增加，而活性的脱氢酶可以使得外源性的四唑盐或者阿尔玛蓝(Alamar blue)还原成为带有颜色还原产物。
通过分光光度计或者酶标仪来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。
四种最常见的四唑盐是：MTT、XTT、MTS和WST1，其还原产物为甲瓒(formazan)。
(1)四甲基偶氮唑盐法(MTT)：MTT商品名为噻唑蓝，是一种黄色的染料。
1983年Mosmann 建立MTT比色法，用于检测细胞存活和增殖。
其原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶，甲瓒并沉积在细胞中，而死亡的细胞无此功能。
二甲亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫分析仪测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数量范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
MTT可以用于所有细胞类型，但MTT在标准的细胞培养基中是不溶的，而且其生成的甲瓒晶体需要溶解在DMSC)中。
因此，MTT主要作为终点检测方法。
另外，有研究发现过氧化物会降低MTT测定的准确度，抑制将近95％的MTT与O2-的反应，MTT溶解产物甲瓒会吸附在纳米纤维上，而致使检测的结果呈现假阴性。
(2)二甲氧唑黄比色法(XTT)：XTT是一种与MTT类似的四唑氮衍生物，可被活细胞还原形成水溶性的橘黄色的甲瓒产物，不形成颗粒，可直接用酶联免疫分析仪检测吸光度，故较MTT法更加快速、简便、敏感。
但XTT水溶液不稳定，需要低温保存，现配现用。
由于XTT的代谢产物呈橘黄色，故培养体系中有些黄色代谢物和试剂可能会影响其检测结果。
与MTT一样，过氧化物可抑制近95％的XTT与O2-的反应，故对XTT测定的准确度有一定的影响。
(3)内盐法(MTS)：MTS是一种新型的MTT类似物。
MTs在偶联剂PMS存在的条件下，可被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成水溶性的有色甲瓒产物，其颜色深浅与活细胞数量在一定范围内呈高度相关，可用酶标仪检测。
如何在组织中检测细胞增殖,分化和凋亡
在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡的方法一、宇文皓月二、检测细胞增殖的方法（1）直接方法：通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力1、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必须物质。
用同位素3H标识表记标帜TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况。
但是具有放射性。
2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成为一种良好的细胞标识表记标帜物。
CFSE进入细胞后可以不成逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。
当细胞分裂时，CFsE标识表记标帜荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。
这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。
3、Brdu检测法Brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。
同时结合其它细胞标识表记标帜物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义4、增殖标记检测有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增值细胞缺乏这些抗原，您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。
例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期表达，而在G0期和G1 期(非增殖期)不表达。
用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。
由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。
不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。
细胞增殖检测CFSE
细胞增殖检测C F S E YUKI was compiled on the morning of December 16, 2020一、原理荧光染料CFSE，也可称为CFDA SE（5，6- carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester）即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，这使得CFSE成为一种良好的细胞标记物。
当CFSE以含有两个乙酸基团和一个succinimidyl ester功能基团的形式存在时，不具有荧光性质，而具有细胞膜通透性，能够自由进入细胞；而当其扩散进入细胞内环境，内源的酯酶可将其乙酸基团水解，此种形式的CFSE分子具有很高的荧光活性，被激发能够产生绿色荧光，却不再具有膜通透性；同时，其含有的succinimidyl ester基团能与胞内的细胞骨架蛋白中的游离胺基反应，最终形成具有荧光的蛋白加合物。
因此，当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。
这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。
二、CFSE配制用DMSO溶解成5 mmol/L的储存液，于- 20 ℃避光保存。
使用时，用无血清DMEM培养液稀释成5μmol/L的工作液备用。
CFSE试剂盒内有一小瓶CFSE（A试剂）标明500ug ，另有一小瓶DMSO（B试剂），500ugCFSE溶解于180ulDMSO即是5mMstock solution。
三、CFSE标记细胞制作细胞悬液，加入等体积CFSE工作液，于37℃孵育10 min，用40%体积的冷小牛血清立即终止标记10min。
CFSE说明书
CellTrace™ CFSE 细胞增殖试剂盒贮存条件：• ≤–20ºC 避免反复冻融，开盖前放置至室温。
• 干燥• 避光按要求保存，DMSO和固体CFSE6个月稳定，试剂溶液尽快使用。
分子量：557.47Ex/Em:492/517 nm检测：荧光显微镜FITC滤片检测或流式488nm激发光检测。
CFSE (carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester 羧基荧光素双乙酸盐，琥珀酰亚胺酯) 被动扩散进入细胞，其本身是无色无荧光的，被细胞内的酯酶分解后产生高强度的荧光，该荧光产物与胞内的氨基结合长时间留存于细胞内并可被乙醛固定。
未结合的试剂与副产物扩散至胞外基质中，被洗去。
传代或胚胎分裂分析，CFSE与赖氨酸侧链或其他氨基基团反应，共价偶联至细胞内和细胞表面的蛋白，细胞分裂时被平均分配至子代细胞，荧光强度降到母代细胞的一半。
适合用于胞内示踪，在细胞分裂或融合后分配至子代细胞中，并不会被转移至邻近的细胞。
在小鼠淋巴细胞迁移实验中，CFSE注射进入小鼠体内后，标记的淋巴细胞的检测可长达8周。
肝内注射荧光显微镜定位检测可长达20天。
试剂盒成分• CellTrace™ CFSE (Component A), 10瓶，每瓶50 μg• DMSO (Component B), 0.5 mL使用浓度：一般来说，长时间染色（超过三天）或快速分裂为5～10uM，活力分析等短时间分析为0.5～5uM。
，荧光显微镜为25uM。
优化并使用尽可能低的浓度以保持细胞的正常生理状态。
不要使用含氨基的缓冲液或赖氨酸涂层的玻片，防止和CFSE发生反应。
试剂准备：用前制备CFSE的5mM贮存液，一瓶A溶于18ul DMSO（B）中。
流式分析：已用于检测B细胞和T细胞的分裂。
用前准备：样本制成单细胞悬液；含0.1%BSA的PBS；5mM的CFSE贮存液；细胞培养基；1．1重悬细胞于预温的PBS/0.1%BSA，浓度1×106/ml。
细胞增殖凋亡检验方法汇总
细胞增殖、凋亡-检测方法汇总1.直接计数法面单粗暴、傻瓜式的检查方法！利用计数板或计数仪得出细该数目•然后对数目逬行比较。
方法需要对不同时间原的细胞分别固定•而后在光疑下计数,可绘制出细胞生长曲线。
而具不足之处在于无法区分壇蓿细胞与非增殖抵胞，下适合样品奴星參和评估特定亚群的情况。
2「H・TdR渗入法OH腺龜碇核百(TdR )是DNA持有的滅基「也是DNA合成的必需物氐用同位素中标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体渗入DNA合成代谢过程,通过液体闪烁计数器可迴走细胞的放射性强虐，间接放映出细胞增殖情况。
该方法优点在于敏感性高”客观性强,盍每性好.但是爲要一走设备集件，也存在放时性核素污染问题。
3、Brdu/EdU检测法Brdu&EdU均是胸腺嚅睫的衍生物r均可代替胸腺嚅噪在DNA合成期掺入细胞中。
不同的是J Brdu检测法可利用B「du专性抗体和具他細胞标记物对细'进行双重染色,可判断増殖细胞的种类及増殖速度，不仅适用于体外实验也能用于活体实验。
这个方法最大的缺点需要变性DNA才能与抗体结合,破坏了DNA双链结构r导致染色弥散、准确性降低等问题。
EdU检测法则基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性r适用于细胞増殖、细胞标记示踪筈方IEI的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。
EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500,®田胞内很容易就扩散,无需DNA变性。
rdU与EdU检测优缺点综合比较BrdU EdU 检测分子大很小检测方式免疫反应化学反应影响其他标记是否DNA变性需要不需要实验时间过夜 2.5小时检测灵敏度一般灵敏4、WITT检测法&CCK8检测法MTT检测法反映细胞的能臺代谢「是检测细胞増殖活力的一种简便准确方法°其原理是在活纟田胞生长和增殖过程中,线粒体内的脱氢酶可将黄色的MTT分解为蓝紫色的水不溶性的甲瓒(Formazan ),并沉积在细胞中(死细胞无此功能。
流式细胞术检测CFSE标记人T细胞亚群增殖反应_王敏
生, 主要从事细胞免疫 学方面的 研究。现在安 徽淮北市 疾病控 制中 心 工 作, 淮 北 235000。( Tel ) 0561 3335620; ( E mail) lrk lv@ sina. com * 通讯作者
图 1 PBMC 刺激后不同 T 细胞亚群扩增的比例 Fig 1 Proportion of expanded T cell subsets activated by PHA
and CD3mAb
a1, a2)
PBMC stimulated with PHA for 5 d; b1, b2) PBM C st imulated with CD3 mAb for 5 d; c1, c2) PBMC st imulat ed wit h Mtb Ag for 8 d 图 2 不同刺激剂激活 PBMC 后 T 细胞各亚群细胞的扩增比例
WANG Min, ZHANG Lin jie, HE Jin sheng, GE Xiao song, CHEN Yong, LI Bai qing( Department of Immunology , Anhui Medical University , Hef ei 230001, China)
69pbmc经phacd3mab或mtb2ag激活后增殖不同天数用检测cd分子或tcr的荧光抗体染色后在流式细胞仪上测定获得数据再用modfit软件中的增殖分析模块进行分析可得到cd3细胞的增殖动力模型即可计算出大量相关指数包括各代细胞所占百分率增殖指proliferationindexpi即增殖后的细胞总数与增殖前的细胞总数的比值图
CFSE细胞增殖实验
准备：1.20ml 预冷5%FBSHI-PBS2.50ml 预冷MACS buffer3.70um滤网4.2.5ml RBC lysis5.LS column6.50ml 37度预热PBS7.50ml 37度预热complete culture mediumRPMI 1640 +10% HeatInactivated FBS+10 mM HEPES+1 mM penicilline streptomycin+ 50 mM 2-mercaptoethanol一CD3抗体包被取96孔板每孔加入100ul 10ug/ml anti-CD3抗体PBS 密封4度过夜;二淋巴细胞获取1.小鼠的脾脏结摘取于10ml 冷5%FBS-PBS中;2.于70um滤网研磨滤过,500g 4度5min离心后弃上清;3.2.5ml RBC lysis裂红5 min,10ml 冷5% PBS终止;4.500g 4度5min 离心后弃上清,10ml MACS buffer重悬,计数;留取105个细胞进行FACS;（三）磁珠分选naïve CD8a+ T细胞1.Centrifuge cell suspension at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely. 2.Resuspend cell pellet in 400 μL of MACS buffer per 108 total cells. 3.Add 100 μL of Naive CD8a+ T Cell Biotin-Antibody Cocktail per 108 total cells. 4.Mix well and incubate for 5 minutes in the refrigerator 2−8 °C. 5.Add 200 μL of MACS buffer per 108 total cells. 6.Add 200 μL of Anti-Biotin MicroBeads per 108total cells. Add 100 μL of CD44 MicroBeads per 108 total cells.7.Mix well and incubate for an additional 10 minutes in the refrigerator 2−8 °C.8.Wash cells by adding 10ml of MACS buffer per 108 cells and centrifuge at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely.9.Resuspend up to 108cells in 500 μL of MACS buffer.10.Place LS column in the magnetic field of a suitable MACS Separator.11.Prepare column by rinsing with 3 mL of MACS buffer. 12.Apply cell suspension onto the column. Collect flow-throughcontaining unlabeled cells, representing the enriched naive CD8a+ T cell fraction. 13.Wash column with 3 mL of MACS buffer. Collect unlabeled cells thatpass through, representing the enriched naive CD8a+ T cells, andcombine with the flow-through from step 3. 14.Determine cell number. 留取105个细胞进行FACS;四CFSE预处理1. Remove supernatant from the cell pellet.2. Add CellTrace™ CFSE 1:1000 dilution in PBS staining solution and gently resuspend the cells to 1106/ml.3. Incubate at 37°C for 20 minutes, protected from light.4. Add 4 volumes complete culture medium and mix.5. Incubate at 37°C for 5 minutes.6. Pellet the cells and remove the supernatant.7. Resuspend the cell pellet in fresh, pre-warmed complete culture medium to 1107/ml.8.均分两份,其中一份加入2ug/ml anti-CD28,一份不加抗体;9.包被板使用PBS洗涤一次,按105 -106个细胞／孔梯度接种,培养3天后上机;。
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组份编号
42110A 42110B 42110C
产品简介： 荧光染料 CFSE(CFDA-SE)，是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料，可以标记活
体细胞。CFSE 是一种带有琥珀酰亚胺(NHS)的荧光染料，可以结合细胞内的蛋白质。CFSE 在结构上将酚羟基部位改造成 AM 体，所以自身不发荧光，荧光背景低，脂溶性高，能够 轻易穿透细胞膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，进入细胞内的 CFSE 的 AM 部位能被细 胞内酯酶水解发出绿色荧光。CFSE 的琥珀酰亚胺(NHS)和细胞内蛋白质的氨基部位结合， 固定在细胞内，不会漏出细胞外。CFSE 进入细胞后定位于细胞膜、细胞质和细胞核，在细 胞核的荧光最强。
产品说明书
CFSE 细胞增殖与毒性检测试剂盒
产品组成：
产品编号 规格
试剂 A：CFSE 荧光探针 试剂 B：CFSE 溶解液 试剂 C：CFSE 细胞标记液 10X
BB-4211-1 500-5000 assays
1瓶 1ml 50ml
BB-4211-2 1000-10000 assays
2瓶 1ml*2 100ml
Survival of Patients after Primary Surgeryfor Hypopharyngeal Cancer
Asian Pacific Journal of Cancer Prevention
2012, Volume 13,
（IF=1.24）
相关产品：
产品 Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒 Annexin V-EGFP/PI 凋亡试剂盒 MTT 细胞增殖及毒性检测试剂盒 CCK-8 细胞增殖毒性检测试剂盒 WST-1 细胞增殖毒性检测试剂盒 MTS 细胞增殖与毒性检测试剂盒 Hoechst33342/PI 双染试剂盒 DAPI 染色试剂盒 细胞存活率检测试剂盒
产品号 BB-4101 BB-4102 BB-4201 BB-4202 BB-4203 BB-4204 BB-4131 BB-4133 BB-4122
产品 细胞周期检测试剂盒 JC-1 线粒体膜电位试剂盒 Caspase 3 活性检测试剂盒 Caspase 8 活性检测试剂盒 Caspase 9 活性检测试剂盒 Caspase 10 活性检测试剂盒 细胞凋亡形态学检测试剂盒 Rhodamine 123 染色试剂盒 AO/EBห้องสมุดไป่ตู้双染试剂盒
细胞测定 1、 用纯水 10 倍稀释 CFSE 细胞标记液。
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
产品说明书
2、 根据需要检测的细胞样品数，用细胞标记液将 CFSE 母液 100-500 倍稀释，再用 PBS 2-8 倍稀释，配制成染色工作液，终浓度相当于将 CFSE 母液 200-4000 倍稀释。不 同的细胞需要根据预实验结果确定最佳染色浓度。
Journal of Biomedical Materials Research
2012, Volume 100A, Issue 2, （IF=3.044）
● Jun-Xi Wang, Ying-Yao Zhang et al.
Role of Centromere Protein H and Ki67 inRelapse-free
Tumor Biology
2013, 11
（IF=2.518）
● Ruiqiang Hang , Ming Zhang, Paul K. Chu et al.
Biological response of endothelial cells to
diamond-like carbon-coated NiTi alloy
CFSE 标记细胞后通常用流式细胞仪进行细胞增殖检测。最常用于淋巴细胞的增殖检测， 也可以用于成纤维细胞、NK 细胞等其它细胞的增殖检测。
CFSE 标记细胞呈绿色荧光，荧光波长：λex=496 nm, λem=516 nm。流式检测时的激 发波长可以选择 488nm，此时的发射波长为 516nm，使用流式细胞仪检测时可以采用 FL1 detection channel。CFSE 标记的细胞也可以用荧光显微镜进行观察。
产品号 BB-4104 BB-4105 BB-4106 BB-4107 BB-4108 BB-4112 BB-4123 BB-4137 BB-4132
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
在细胞分裂增殖过程中，CFSE 的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减，标记荧光可 平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半，根据这一特性，它可被用 于检测细胞增殖，细胞周期的估算及细胞分裂等方面。
CFSE 标记的细胞用于体内观察可以长达数周之久，它常被用来做活体细胞检测实验和 用荧光电镜观察细胞长期活动的实验。CFSE 毒性小，不影响细胞的增殖能力。此方法操作 简单，且不用放射性同位素，不存在安全隐患。可以更快速，更准确和更安全地得到想要的 实验数据。
2014, 3
（IF=4.753）
● Meiying Li, Xuejun Yu et al.
Bufalin exerts antitumor effects by inducing cell cycle arrest and
triggering apoptosis in pancreatic cancer cells
Period 2 is essential to maintain early endothelial
progenitor cell function in vitro and angiogenesis after myocardial infarction in mice
Journal of Cellular and Molecular Medicine
使用方法： 试剂配制：
1、从冰箱中取出 CFSE 试剂，静置几分钟至室温。盛放 CFSE 的管子开盖前请轻弹管壁 几次，再离心几分钟让粉末充分落入管底后才能开盖。
2、取 0.9 ml CFSE 溶解液加到 CFSE 管中溶解，配制成 CFSE 母液。加入溶解液后请先 盖上盖子，反复颠倒把盖子和管壁上的试剂洗到底部，并用移液器反复吹打使溶解 完全。冬天气温较低时 CFSE 溶解液会凝固，请先在 37℃水浴至溶解液完全融解后 再进行配制，配制过程中注意避免溶液凝固，保持温度至 CFSE 溶解完全。
3、 将待测细胞用染色工作液重悬，至细胞浓度大约 107/ml。 4、 在 37℃培养箱中孵育 15-30 分钟。 5、 离心后去上清，收集细胞，加入 PBS 或无血清培养基重悬细胞。 6、 取 500ul 细胞悬液，用流式细胞仪或荧光显微镜检测。 7、
参考文献：
● Yuan-Yuan Sun, Wen-Wu Bai et al.