大肠杆菌感受态的制备

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大肠杆菌感受态的制备注意事项

大肠杆菌感受态的制备注意事项一、前言大肠杆菌是一种常见的细菌，广泛存在于自然界中。

其感受态的制备是研究大肠杆菌生长和代谢机制的重要手段之一。

本文将从实验室条件、培养基、细胞处理等方面详细介绍大肠杆菌感受态的制备注意事项。

二、实验室条件1. 实验室应保持干净整洁，避免灰尘和异味影响实验结果。

2. 实验室应保持适宜的温度和湿度，避免过高或过低的环境温度对实验产生影响。

3. 实验室应定期消毒，确保操作台面、仪器设备等无菌。

三、培养基1. 选择合适的培养基是制备大肠杆菌感受态的关键。

常用的培养基有Luria-Bertani（LB）培养基、M9盐基培养基等。

根据实验需要选择适当的培养基。

2. 培养基应在使用前进行严格无菌处理，避免污染影响实验结果。

3. 培养基pH值应控制在合适的范围内，一般为7.0-7.5。

4. 培养基中添加的各种营养物质应按照实验要求精确称量，避免误差对实验结果产生影响。

四、细胞处理1. 大肠杆菌应在对数生长期进行处理，通常为OD600=0.6-0.8。

2. 细胞应在无菌条件下进行采集和洗涤，避免污染影响实验结果。

3. 细胞应在适当的温度下进行处理，一般为37℃。

4. 细胞处理过程中应注意避光，避免光照对实验结果产生影响。

五、感受态制备1. 感受态制备前应将培养基和细胞等物品预先冷藏或冰冻，以保证制备过程中温度控制的准确性。

2. 制备感受态前应先将培养基预热至37℃，并加入相应浓度的感受态诱导剂（如IPTG）。

3. 加入诱导剂后，将细胞转移到含有诱导剂的培养基中，并在适当温度下孵育一定时间（通常为2-4小时）。

4. 制备过程中应注意避光，避免光照对实验结果产生影响。

5. 制备完成后应及时取样，避免长时间放置影响实验结果。

六、结论以上是大肠杆菌感受态制备的注意事项。

在实验过程中，我们应该严格按照要求进行操作，保证实验结果的准确性和可靠性。

同时，在实验室管理方面也要加强管理，保证实验室环境的卫生和安全。

大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)

大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）实验目的1.掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法。

2.了解大肠杆菌感受态细胞的生理特性和制备原理。

实验原理受体或宿主细胞容易接受外源DNA的状态称为感受态，通过物理或化学的方法，人工诱导细胞成为敏感的感受态细胞，以便外源DNA 进入，从而实现外源DNA在宿主细胞内大量复制和表达。

在低温、低浓度CaCl2的作用下，大肠杆菌细胞膜的磷脂双分子层形成液晶结构，细胞外膜和细胞内膜间隙中的部分核酸酶解离，细胞膜的通透性增加，此时大肠杆菌成为感受态细胞。

实验器材高温高压灭菌锅、超净工作台、牙签、移液器、移液器吸头、离心管、离心管架、EP管、恒温摇床、恒温培养箱、三角瓶、培养皿、离心机、制冰机等。

实验试剂（1）培养基：LB，LA。

（2）溶液：10%甘油+0.1mol/L CaCl2溶液，0.08mol/LMgCl2+0.02mol/L CaCl2溶液。

（3）菌株：E.coli DH5α。

实验操作（1）用灭菌的牙签蘸取少量E.coli DH5α菌液划线接种于LA 培养基上，放在恒温培养箱37℃培养后，挑取单菌落接种于10ml LB 培养基中，于37℃摇床、200rpm过夜培养。

（2）按1∶100的接种比例将过夜培养的菌液转接至100～200ml 的LB培养基中，于37℃摇床、200rpm培养3～4h，使菌液的OD600达到0.6～0.8。

（3）冰浴菌液30min，同时将灭菌过的离心管、移液器吸头、“10%甘油+0.1mol/L CaCl2”溶液等放进冰箱预冷，在超净工作台中将菌液分装到预冷的50ml的离心管中，于4℃离心机中4000rpm离心15min。

（4）离心后尽量除去培养液，用预冷的“0.08mol/LMgCl2+0.02mol/L CaCl2溶液”重悬菌体，冰浴25min后，于4℃离心机中4000rpm离心15min。

（5）离心后弃去上清液，重复步骤（4）一次。

（6）弃去上清液后，将菌体重悬于冰冷的“10%甘油+0.1mol/LCaCl2溶液”中，按每管80μl分装至预冷的灭菌的EP管中，-80℃保存备用。

大肠杆菌感受态的制备与转化

大肠杆菌DH5α感受态的制备于转化：CaCl2法1）、挑取大肠杆菌DH5α单菌落接种于5ml LB液体培养基中，37℃、200r/min，培养16小时。

2）、取1ml新鲜的16～20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的烧瓶中（按1：100的比例）。

于37℃剧烈振摇培养约2～3h（旋转摇床200～300r/min），每隔20～30min测量OD600值≈0.4。

3）、在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置30min。

4）、于4℃、5000r/min离心5min，倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。

5）、用10ml冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上30min。

6）、于4℃、4000r/min离心10min，倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。

7）、每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定，加甘油至终浓度为15～20％）。

此时，可以迅速将细胞分装成小份（200μl/份），液氮中冰冻，-70℃贮存备用。

将质粒转化到大肠杆菌DH5α中1）、感受态细胞悬液200μl离心管，每管加DNA或连接反应混合物（体积≤10μl，DNA≤50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。

2）、将离心管放到预加温到42℃的循环水浴中的试管架上，放置90s～2min，不要摇动试管。

3）、快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。

4）、每离心管加800μl LB培养基，用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。

5）、将适当体积（每个90mm平板可达200μl）已转化的感受态细胞转移到含相应抗生素的LB培养基上。

6）、将平板置于室温至液体被吸收。

7）、倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。

3大肠杆菌感受态细胞转化效率的测定1）、准备2 个LB/氨苄平板，涂板前将平板平衡至室温。

(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备

将分装后的菌体放入 -80 ℃冰箱里冷冻约 20min （或者使用液氮快速冷冻细胞悬液）后 , 取出待其融化。 5. 细胞破碎融化之后破碎细胞 ,用超声波细胞粉碎机破碎 ,每次 10s, interval 20s, 20 次 .若量大可用压榨机来破碎 .
6. 离心离心细胞破碎液 ,12500rpm,1h,4 ℃ ,然后收集上清并转另一个 1.5ml 管 ,再加 100μl 1M Tris
所用的 CaCl2 等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于 ⑶、防止杂菌和杂 DNA 的污染
4 ℃。
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经
高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、
DNA 酶或杂 DNA 所污染，
否则均会影响转化效率或杂 DNA 的转入。
(3)30% 甘油： 30mL 甘油溶于 100mL 蒸馏水，高压灭菌。主要设备 (1) 超净工作台 (2) 冷冻离心机 (3) 恒温摇床 (4) － 70 ℃冰箱 (5)10mL 移液管 (6) 吸耳球 (7)1mL 、200 μＬ移液枪（配套枪头） (8)50mL 离心管 (9)1.5mL 离心管
大肠杆菌感受态细胞的制备
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实验管理实验概要
大肠杆菌感受态细胞的 CaCl2 法制备及质粒转化
实验原理处于对数生长期的细菌经
CaCl2 处理后接受外源 DNA 的能力显著增加。细菌处于容易吸
收外源 DNA 的状态叫感受态。
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，
OD600 控制。对

大肠杆菌感受态细胞的制备

大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞是一种重要的细菌功能研究模型。

下面是制备大肠杆菌感受态细胞的步骤：
1. 选择适当的大肠杆菌菌株，通常使用DH5α或BL21(DE3)等菌株；
2. 选用适当的质粒载体（例如pET系列），根据需要将目标基因插入载体中；
3. 制备大肠杆菌的化学转化液（例如CaCl2转化法），转化质粒到大肠杆菌细胞中；
4. 通过筛选和鉴定，筛选出带有目标基因的单克隆菌株；
5. 将单克隆菌株培养至对数生长期，然后添加适当浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导目标基因的表达；
6. 培养细胞至感受态状态，通常需要1-2小时的诱导时间；
7. 用适当的方法分离并提取感受态细胞膜，例如超声法或离心法；
8. 在提取的细胞膜中添加目标配体或生理作用物质，检测感受态细胞的响应。

通过这些步骤，我们可以制备出高效的大肠杆菌感受态细胞，用于研究蛋白质的结构和功能、药物筛选等方面的研究。

大肠杆菌感受态的制备

大肠杆菌感受态的制备(1)取出保存在-80℃的甘油菌种，取1μl接种在1mL LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜；(3)按照1：100的比例转瓶于50 mL LB液体培养基。

37℃剧烈震荡；(4)待菌生长到对数中期OD600=0.4~0.6，约需要几小时，然后将菌液转入50 mL无菌离心管中，在冰上放置15分钟，待菌液冷却后于4℃、8,000rpm离心4分钟，收集菌体，弃去培养液；(5)在沉淀中加入O.1M预冷的CaCl2 20 mL，洗涤重悬菌体，离心收集，弃去上清液；(6)加入0.1M CaCl2(冰上预冷)2mL重悬菌体。

置于冰上，48小时内均可使用，12小时后大肠杆菌感受态细胞效率将提高3~4倍；加入0.5 mL无菌甘油使其终浓度为20％(v/v)，以每管100μl分装于1.5mL无菌离心管中，-80℃保存待用。

大肠杆菌的转化1)将从-80℃冰箱中取出的200μl感受态细胞放在冰上融化。

2)加入5-10μl的质粒或连接产物，轻轻混匀内容物，冰浴30min。

3)将EP管迅速放入42℃的水浴中热激2min。

4)快速将EP管转移到0℃冰浴中，使细胞冷却2min。

5)每管加入800μl SOC活化培养基，37℃，180r/min摇床培养1h。

6)最后离心2min，将菌体涂布于LB+抗生素的平板上，将平板置于室温直至液体被吸收。

倒置平板，于37℃培养，12～16h左右可出现菌落。

农杆菌8的菌株活化与感受态的制备(1)取出保存在-80℃的C58甘油菌种，取1μl接种在1mL LB液体培养基中，28℃，200rpm培养过夜；(2)按照1:100的比例转瓶于50 mL LB液体培养基，LB培养基中加50mg/L的硫酸庆大霉素。

28℃200rpm震荡培养过夜；(3)等OD600为0.4~0.6时停止培养，约需8h左右；(4)将菌液转入50mL无菌离心管中，在冰上放置30分钟，不时缓慢摇匀以保证内容物充分冷却。

感受态大肠杆菌制备方法

感受态大肠杆菌制备方法四川大学生命科学学院试剂配制：A液：1M，MnCl2；mol/LB液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；C液：称取CaCl20.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水（一级水），轻轻振荡使所有组分充分溶解。

将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。

TB缓冲液：方法步骤：1、溶液配制取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。

2、划线得到单菌落37℃培养箱培养过夜（约17h），挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300rpms）培养3-4小时,将培养温度调至18℃剧烈振荡（328rpms）培养，3、其余与普通感受态差不多，每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，4、加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。

5、用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上6、取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。

效率非常高，一般可到10×8，好时可到10×9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。

洁净是最重要的。

无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。

离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g5min。

涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。

涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。

预冷是必要的。

整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。

大肠杆菌感受态细胞制备

超净工作台
速离心机等
四、实验操作
1、从新活化的E.coli DH5α平板上挑取一单菌落，接种于3～
5ml LB液体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12h左右)； 2、将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，
37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～ 30min测一次OD600，至OD600为0.3～0.5时停止培养，并转装到1.5 mL离心管中； 3、培养物于冰上放置20min； 4、 0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入1 mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞, 冰浴20分钟；
7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在 4℃放置12～24h，其转化效率可以增高4～6倍；也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。
五、思考题
制备感受态细胞时，应特别注意哪些环节？
三、实验材料与设备
1、用品与与仪器：超净工作台、恒温培养箱、移液器、微型离心管等、台式
冷冻高速离心机、冰箱、制冰机等； 1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、tip头、烧杯、量筒。
镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸，一次性塑料手套等； E.coli DH5α受体菌(R-M-)， pGEX-4T-2质粒(Ampr)。
四、实验操作
5、0～4℃， 4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0 mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min；
6、 0～4℃， 4000g离心10min，弃去上清液，加入100 µ L冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；

大肠杆菌感受态细胞的制备

大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛存在于自然界中。

在科学研究中，大肠杆菌常被用作实验模型，因其生长迅速、培养简便，以及对环境因素的敏感性等特点。

为了更好地研究大肠杆菌的感受态细胞，需要进行细胞的制备工作。

大肠杆菌感受态细胞的制备工作通常包括以下几个步骤：1. 培养基的准备：首先，需要准备适合大肠杆菌生长的培养基。

常用的培养基包括Luria-Bertani（LB）培养基和M9培养基等。

这些培养基含有适量的营养物质，可以提供大肠杆菌生长所需的营养。

2. 菌液的接种：将已保存的大肠杆菌菌株接种到含有培养基的试管中。

接种前需要将试管和接种环进行高温灭菌处理，以消除外源性污染。

接种时应注意使用无菌技术，避免细菌污染。

3. 培养条件的控制：接种完成后，需要将试管放入恒温摇床或培养箱中进行培养。

培养的温度通常为37摄氏度，培养时间视实验需要而定。

同时，还需要控制培养基的pH值，保持在适宜的范围内。

4. 细胞的收获：培养一定时间后，可以通过离心的方法将细菌沉淀下来。

离心速度和时间的控制要根据细菌的大小和培养液的体积来确定。

沉淀下来的细菌即为大肠杆菌感受态细胞。

5. 细胞的保存：为了长期保存大肠杆菌感受态细胞，可以将其冻存。

冻存液的配制需要添加一定比例的甘油或DMSO等保护剂，以防细胞在冻存过程中受到损伤。

冻存后的感受态细胞可以在需要时重新复苏。

通过以上步骤，我们可以成功制备出大肠杆菌感受态细胞。

这些细胞可以用于进一步的研究，如基因表达调控、信号传导等方面的实验。

同时，制备大肠杆菌感受态细胞的方法也可以应用到其他微生物的研究中。

大肠杆菌感受态细胞的制备是一项重要的实验工作，它为我们深入研究大肠杆菌的生物学特性提供了基础。

通过合理的实验设计和精确的操作，我们可以获得高质量的感受态细胞，为科学研究的进展做出贡献。

希望本文的内容能够对相关研究人员有所帮助，推动科学的发展和进步。

大肠杆菌感受态细胞的制备

大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物技术领域。

在生物技术中，大肠杆菌感受态细胞的制备是非常重要的一步。

感受态细胞是指细胞表面有特定的受体，能够感受到外界的信号，从而引发细胞内的反应。

下面将介绍大肠杆菌感受态细胞的制备方法。

1. 菌株的选择首先需要选择适合的大肠杆菌菌株。

常用的菌株有DH5α、BL21等。

这些菌株具有较高的转化效率和稳定性，适合用于感受态细胞的制备。

2. 受体的构建感受态细胞的制备需要构建受体。

受体是一种蛋白质，能够与外界的信号分子结合，从而引发细胞内的反应。

常用的受体有蛋白激酶、离子通道等。

构建受体需要进行基因克隆、表达、纯化等步骤。

3. 质粒的构建构建受体需要使用质粒。

质粒是一种环状DNA分子，能够在细胞内自主复制。

常用的质粒有pET、pGEX等。

构建质粒需要进行基因克隆、转化、筛选等步骤。

4. 细胞的转化将构建好的质粒转化到大肠杆菌中。

转化是指将外源DNA导入到细胞内，使其表达外源蛋白。

转化需要进行化学转化、电转化等步骤。

5. 细胞的培养转化后的细胞需要进行培养。

培养条件包括温度、氧气、营养物质等。

培养时间需要根据不同的实验目的进行调整。

6. 受体的表达和纯化经过培养后，细胞内的受体会被表达出来。

为了得到纯净的受体，需要进行蛋白质纯化。

常用的纯化方法有亲和层析、离子交换层析等。

7. 受体的功能验证得到纯净的受体后，需要进行功能验证。

功能验证是指验证受体是否能够与外界的信号分子结合，并引发细胞内的反应。

常用的功能验证方法有荧光共振能量转移（FRET）、酶联免疫吸附实验（ELISA）等。

大肠杆菌感受态细胞的制备需要进行菌株的选择、受体的构建、质粒的构建、细胞的转化、细胞的培养、受体的表达和纯化、受体的功能验证等步骤。

这些步骤需要严格控制，才能得到高质量的感受态细胞。

感受态大肠杆菌制备方法.

感受态大肠杆菌制备方法A液：1M，MnCl2：B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；C液称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。

将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。

取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。

划线得到单菌落,37℃培养箱培养约17小时，挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300 rpms）培养3-4小时, 将培养温度调至18℃剧烈振荡（3280 rpms）培养，其余与普通感受态差不多，每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。

用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上。

取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。

效率非常高，一般可到10*8，好时可到10*9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。

洁净是最重要的。

无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。

离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。

涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。

涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。

预冷是必要的。

关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP 管冰箱即开始转化。

大肠杆菌感受态制备

摇床
用于大肠杆菌的振荡培养。
恒温振荡器
用于大肠杆菌的恒温振荡培养。
03 实验步骤
细菌培养
01
02
03
培养基选择
选择适合大肠杆菌生长的培养基，如LB培养基，以保证细菌正常生长。
培养温度
将细菌培养在37℃恒温摇床中，振荡培养至对数生长期。
细菌密度
通过观察细菌的生长情况，控制细菌密度，通常在 OD600值为0.6-0.8时进行后续操作。
参考文献2
02
03
参考文献3
大肠杆菌感受态制备技术进展，作者：XXX，出版日期：XXXX 年X月，出版社：XXX出版社。
大肠杆菌感受态制备实验指南，作者：XXX，出版日期：XXXX 年X月，出版社：XXX出版社。
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实验原理
感受态
感受态是指细菌处于一种生理状态，能够接受外源DNA并与之结合，进而发生转化。
转化过程
外源DNA通过细菌的细胞膜进入细胞内，并在DNA结合蛋白的作用下与细菌染色体上的同源序列发生交换，从而实现基因的克隆和表达。
影响因素
影响感受态形成的因素包括细菌生长状态、培养基成分、温度、渗透压等。
转化子的筛选和验证
筛选方法
转化子可以通过抗生素筛选、蓝白斑筛选等方法进行筛选。
验证方法
验证转化子是否含有目的基因，可以通过PCR、酶切、测序等方法进行。
注意事项
在筛选和验证过程中，需要注意避免假阳性或假阴性的结果，确保实验结果的准确性。
优化实验条件
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温度
感受态细胞的转化需要在一定的温度下进行，不同的温度可能会影响转化效率，因此需要选择适宜的温度进行实验。

大肠杆菌感受态细胞制备

大肠杆菌感受态细胞制备试剂与材料：0.1mol CaCl2含15%甘油的0.1 mol/L CaCl2溶液1.5 ml离心管，枪头（都用新的，不要回收的）仪器：无菌操作台，恒温摇床，分光光度计，离心机，超低温冰箱（遗传实验室，冻存感受态细胞）。

（1）从37 o C培养16-20 h的平板中用接种针刮取一个单菌落，沾入一个含100 ml LB培养基的烧瓶中。

于37 o C剧烈振摇培养2-3 h，（摇菌2h后测定OD600，即600 nm下的吸光度，每隔15 min测定一次，用玻璃比色皿即可），当OD值达到0.4时，菌处于对数生长期，可进行感受态制备。

（当OD值达到标准后要马上进行感受态制备），整个过程要严格无菌操作避免污染杂菌！！！。

（2）将菌液转入1.5ml离心管中，每管1ml，冰上放置15 min（制备10管，剩余的菌弃掉，离心管不要用回收的）。

（3）然后于4 o C下5000 rpm（rpm即“转/min”）离心10 min弃上清。

（注意看离心管底有无沉淀，若无沉淀则需加大离心转速）（4）每管加入600 μl预冷的CaCl2（0.1mol/L），将菌体均匀悬浮（用移液枪轻轻吹打），冰上放置30 min。

（5）4 o C下，5000 rpm离心10 min，弃上清。

（6）每管加入40 μl 含15% 甘油的0.1 mol/L CaCl2溶液，即为感受态，冻存于-70 o C。

（若立即使用则加入0.1 mol/L CaCl2溶液即可）。

注意：（1）整个过程都要在冰上进行（除4o C离心过程），此为制备成功的关键。

（提前用制冰机制冰）（2）注意离心管内溶液不要冻住，细胞反复冻融会死亡。

（3）整个过程需严格无菌操作！！！，需在无菌操作台进行，将酒精灯与感受态细胞分别置于操作台的两端，感受态细胞喜冷。

（5）操作过程戴手套，避免污染。

溶液配制：0.1mol CaCl2：称取0.2219 g CaCl2定容至20 ml（高压灭菌）含15%甘油的0.1 mol/L CaCl2溶液：称取0.2219 g CaCl2，加3 ml甘油（丙三醇），用蒸馏水定容至20 ml。

大肠杆菌感受态细胞的制备、

冰冷的0.1mo1／（6）弃去上清液，加入）弃去上清液，加入200µl冰冷的冰冷的／ L CaCl2 溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻溶液，小心悬浮细胞，即制成了感受态细胞悬液；后，即制成了感受态细胞悬液；（ 7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转）化实验，也可加入占总体积15％化实验，也可加入占总体积％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置离心管中，过的甘油，混匀后分装于离心管中于-70℃条件下，可保存半年至一年。 ℃条件下，可保存半年至一年。
转入离心管中，（ 2）每组取培养液）每组取培养液1-4ml转入离心管中，转入离心管中在冰上冷却5min(可省略）,5000r／min离心可省略）在冰上冷却可省略／离心 2min （ 3 ）倒净上清培养液，用 1ml 冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴溶液轻轻悬浮细胞，／ 30min ；离心2min；（4） 5000r／min离心）／离心；（ 5 ）弃去上清液，加入 400µl 冰冷的 0.1mo1／ L CaCl2 溶液，小心悬浮细胞。溶液，小心悬浮细胞。／ 5000r／min离心离心2min ；／离心
人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必（人工构建的质粒载体中一般缺乏此种转移所必需的mob基因）需的基因
转化（转化（transformation）：）是将异源DNA分子导入受体细胞，使受体细分子导入受体细胞，是将异源分子导入受体细胞胞获得新的遗传性状的一种手段，胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。等研究领域的基本实验技术。进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能分子通过复制表达，进入细胞的分子通过复制表达实现遗传信息的转移，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。传性状。限制－转化过程所用的受体细胞一般是限制转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株的变异株，系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。基化酶的突变株。

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法感受态细胞(Competent cells) ：常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。

受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。

转化：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。

进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。

当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-β-D 硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。

所以称这种现象为α-互补现象。

由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。

所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。

方法一：TSS方法制备感受态细菌（又称一步法）一、准备工作1、缓冲液1×TSS的配制事先配制1M的氯化镁：20.3g氯化镁(6分子水结晶)，定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。

取干净的100ml 量筒和100ml 烧杯，用量筒量取100ml去离子水，加入至烧杯中，取 1 g 蛋白胨，0.5g 酵母抽提物，0.5g 氯化钠，10 g PEG(MW= 3350)，5ml DMSO，5ml 的1 M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22um 滤器过滤除菌。

大肠杆菌感受态的制备

大肠杆菌感受态的制备原理: 热激法是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。

转化效率为106 ～107转化子/μg DNA。

材料：Top10、pcDNA3.0, TB buffer（现用现配）、超纯水、碎冰。

LB液体培养基200 ml（不含AMP）、LB固体培养基（含AMP）、LB固体培养基（不含AMP）10ml圆底离心管（玻璃或塑料）、100ml锥形瓶、2.0 ml离心管、各型号枪头, 刻度移液管均需灭菌处理甘油：100ml (高压灭菌)氨苄（母液100mg/ml，终浓度为100ug/ml）： 1ml母液需氨苄100mg 过滤除菌。

仪器：滤器、0.22um微孔滤膜、刻度吸量管、恒温摇床、恒温培养箱, 分光光度计、比色杯、低温离心机、制冰机、超净工作台, 移液器。

步骤：1）从冻存的E.coli .Top 10, 划线接种至LB固体培养基（不含AMP）. 37℃培养O/N, 16h左右。

2) 从新活化的E.coli .Top 10菌平板上挑取一单菌落，接种与2ml LB液体培养基（10ml圆底离心管）中，37℃振荡培养O/N, 16h左右。

备注: E.coli . Top 10, 20%无菌甘油, －70℃保存。

3)将该菌悬液以(400UL)1:100～1:50转接于20 ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液明显混浊后，2.5~3小时后测一次OD(600nm)，至OD600nm≤0.6时停止培养.摇菌期间, 配TB buffer，开制冰机。

TB buffer置于冰上预冷(20~30分钟). 低温离心机预冷(20~30分钟)以下步骤需在超净工作台和冰上操作；4）细菌置于冰上,10min。

5）取12管, 1.5 ml细菌培养液3000 g 4℃离心5min,弃上清。

6) 每管加200 ul 预冷的LB，轻轻混匀, 均成2管, 置冰上20~30分钟，3000 g 4℃离心5min,弃上清。

(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备

所用的 CaCl2 等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于 ⑶、防止杂菌和杂 DNA 的污染
4 ℃。
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经
高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、
DNA 酶或杂 DNA 所污染，
否则均会影响转化效率或杂 DNA 的转入。
OD600 控制。对
TG1 菌株， OD600 为 0 ． 5 时，细胞密度在 5×107 个 /ml 左右。（应注意 OD600 值与细
胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。
此外，受体
细胞一般应是限制 -修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并
且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。 ⑵、试剂的质量
上摇动 10min, 弃去染色液 .
③ 加入约 50ml 的水 , 再加热至沸腾后保持沸腾状态
30-60s, 停止加热后在摇床上要
5-10min, 换水可完成脱色 .
④ 若要得到无背景的染色胶 ,可重复脱色步骤或将胶放在水中过夜 .
镍柱。用不同浓度的咪唑洗脱。因为咪唑和组氨酸都带正电，可在咪唑逐渐加大浓度的条件下洗脱目的蛋白。 protocol 里有啊。
（二）感受态细胞的制备（注意：以下操作在超净工作台完成。） (1) 将菌液转入 50mL 离心管中，冰上放置 10min 。 (2) 在 4 ℃下， 4000r/min 离心 10min 。弃去上清，将管倒置 1min 以便培养液流尽。 (3) 用冰上预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液 10mL 轻轻悬浮细胞，冰上放置 30min 。 (4)0 ～ 4℃ 4000r/min 离心 10min ，弃去上清，加入 2mL 预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置（务必冰上放置）。（注意：以上操作完成了新鲜感受态细胞的制备）