生化分离工程总复习

凝胶过滤色谱
▪ 分子筛色谱，体积排阻色谱 ▪ 原理：利用有一定孔径的多孔的亲水性凝胶作为载体，
当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，直径大于凝 胶孔径的大分子由于不能进入胶粒内部，便随着溶剂在胶 粒间隙向下移动并最先流出柱外；直径小于凝胶孔径的分 子能不同程度的自由出入凝胶珠的内外。这样不同大小的 分子由于所经的路径不同从而得到分离，大分子物质先被 洗脱下来，小分子物质后被洗脱下来。
▪ ④成品加工
根据产品应用时的要求，在产物经过提取和 精制后，一般还需要一些加工步骤。例如浓缩、 无菌过滤和去热原、干燥、加入稳定剂等。
膜分离 （浓缩、去热原）
冷冻干燥机
干燥技术
▪ 针对热敏性物质开发的单元操作有：
• 瞬时快速干燥：接触时间短、气流温度高 • 喷雾干燥：时间短、热效低、可同时造粒 • 气流干燥：接触时间较长 • 沸腾干燥：接触时间最长，热效最高 • 冷冻干燥：适用于粘稠状物料，活性保持最好 • 微波干燥：时间短，效率高 • 红外干燥：温度高，干燥速度快
超临界流体萃取
树脂吸附
萃取技术
▪ 溶剂萃取（液-液萃取）：乳化现象 ▪ 液-固萃取（浸取）：相似相容 ▪ 双水相萃取： ▪ 超临界萃取：升温，降压，密度变小，
溶解度变小 ▪ 反胶团萃取
破乳方法
▪ 发酵液过滤或沉淀 ▪ 加热 ▪ 稀释法 ▪ 加电解质 ▪ 转型法 ▪ 顶替法
沉淀技术
▪ 盐析沉淀：最常用(NH4)2SO4，次常用Na2SO4 ▪ 有机溶剂沉淀：丙酮、乙醇，易变性 ▪ 等电点沉淀
凝胶层析的应用
▪ 脱盐 ▪ 分离提纯 ▪ 测定高分子物质的分子量 ▪ 高分子溶液的浓缩 ▪ 蛋白质复性研究
柱层析操作过程
（1）装柱：①干法装柱 ②湿法装柱 注意：湿法装柱中柱内预留一部分水，防止气泡的产生，装柱过 程要连贯。平衡。
（2）加样：①干法加样 ②湿法加样 注意：加样过程中，要防止产生飞溅，量要适中。
吸附与离子交换技术
离子交换树脂由骨架、活性基团和可 交换离子组成。 ▪ 阳离子树脂：能与带正电的蛋白质结合 ▪ 阴离子树脂：能与带负电的蛋白质结合
离子交换操作过程
▪ 树脂预处理 ▪ 离子交换过程 ▪ 洗脱过程：洗脱方法有pH梯度和盐梯度 ▪ 树脂的再生
五、应用实例
▪ 软水制备：利用钠型磺酸树脂除去水中的钙离子和 镁离子等碱金属后即可制得软水。
▪ ① 发酵液的预处理和固液分离
经过加热、调pH、添加絮凝剂等方法对发酵液进行 预处理后，经常采用过滤和离心这两个单元操作进行固液 分离。如果产品在细胞内，那么这一步中往往还包括细胞 的破碎以释放产品操作，这个过程通常是在进行固液分离 之后进行的，这样可以减少分离体系的体积 (相应增加产 品浓度)。由于产品释放之后体系中又同时存在有固体和 可溶物（产品），因此需要再增加一步固液分离以除去细 胞碎片。
▪ 无盐水制备：将原水通过氢型强酸性阳离子交换树 脂和羟型强碱或弱碱性阴离子交换树脂的组合，经 过离子交换反应，将水中所有的阴、阳离子除去， 从而制得纯度很高的无盐纯水。
膜分离技术
膜的分类
▪ 微滤膜的孔径大小在0.025-14μm之间 ▪ 超滤膜孔的大小在1－20nm之间 ▪ 反渗透膜（截留物质是低分子量的溶质如抗生素、蔗糖
（3）洗脱：以设定好的流速加入洗脱剂，可以是单一溶剂，也可以 梯度洗脱。
注意：不使柱表面的溶液流干，柱上端保留一层溶液。 （4）收集：每隔10mL收集一试管，使用层析的手段或紫外检测器
进行实时的检测，合并具有相同物质的流份。
电泳技术
▪ SDS-PAGE电泳：测定蛋白质分子wk.baidu.com ▪ 等电聚焦电泳：测蛋白质等电点
和盐类）→孔径范围0.1-10nm ▪ 纳滤膜，平均孔径为2nm。
▪ ③高度纯化（精制）
这步中所用得技术对产品的针对性（选择性） 较强，能够除去与产品的物理性质或化学功能类似 的一些杂质。色谱、电泳、结晶是很好的一些纯化 方法，产品的品质也能得到很大的提高。
层析
结晶
色谱技术（层析技术）
▪ 吸附色谱 ▪ 离子交换色谱 ▪ 凝胶过滤色谱：分子量大小差异 ▪ 疏水作用色谱：高浓度盐溶液 ▪ 亲和色谱：酶和底物的专一性
发酵液预处理的方法
加水稀释
• 降低液体黏度
加热
• 调节pH值 • 凝聚和絮凝 • 使用惰性助滤剂 • 使用反应剂
固液分离----过滤或离心
➢典型过滤设备：
- 板框过滤机 - 真空转鼓过滤机
➢离心设备： — 碟片式离心机 — 管式离心机 — 倾析式离心机
常用过滤设备
（2）板框过滤机
广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、 酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于 固体含量1-10%的悬浮液的分离。
这个阶段的主要任务是去除（或收集）
发酵液中的固相物质，为后续的几个过程提 供澄清的原料液体。经过这一步操作，产物 的浓度或品质一般不会有太大的改善。
板框过滤机
离心机
细胞破碎技术
珠磨法
破碎方法
机械法 非机械法
高压匀浆
超声破碎
干燥处理 冻融 渗透 酶溶法 化学法
▪ ②初步纯化（提取）
在这一步中，需要除去与目标产物性质差异 较大的杂质并对产品进行浓缩。对于不同性质产 品，根据其各自的特点采用不同的方法进行分离， 沉淀、吸附和萃取是这个步骤中的典型操作。这 个步骤往往是由许多个单元操作组合起来的多级 加工过程，经过处理，产品的浓度（或纯度）有 较大变化。
抗生素的生产过程是一个典型的生化分离过 程，包括以上四个步骤，如表3所示。产品的浓度 在分离（初步纯化）过程中增加幅度最大，但产 品的纯度却是在纯化过程中提高最多。
表3 典型生物制品分离过程示例
步骤
发酵液获得 去除不溶物
分离 纯化 精制
典型过程
发酵 过滤 萃取 色谱 结晶
产品
浓度（克/升） 纯度（％）
0.1-5 1.0-5 5-50 50-200 50-200
0.1-1.0 0.2-2.0
1-10 50-80 90-100
再见