分光光度法原理

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分光光度法

第一节基本原理

第二节仪器结构

第三节显色与测量条件的选择

第四节 723N型分光光度计操作维护

第一节基本原理

在光谱分析中，依据物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为吸光光度法,主要有:

红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围1000 m ,主要用于有机化合物结构鉴定。

紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围200400 nm（近紫外区），可用于结构鉴定和定量分析。

可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围400750 nm ，

主要用于有色物质的定量分析。

光的吸收定律

1.朗伯—比耳定律

布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度成正比：A∝b

1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有成正比的关系：A∝c 二者的结合称为朗伯—比耳定律：当一束平行的单色光通过均匀、非散射的稀溶液时，溶液对光的吸收程度与溶液的浓度及液层厚度的乘积成正比。

朗伯—比耳定律

是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。应用于各种光度法的吸收测量。它不仅适用于可见光，也适用于紫外光和红外光；不仅适用于均匀非散射的液体，也适用于固体和气体。

朗伯—比耳定律，数学表达式

其数学表达式为

式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度

b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；

c：溶液的摩尔浓度，单位mol/L；

ε：摩尔吸光系数，单位L/mol/cm；

摩尔吸光系数ε的讨论

摩尔吸光系数ε在数值上等于浓度为1 mol/L、液层厚度为1cm时,该溶液在某一波长下的吸光度；

摩尔吸光系数ε的讨论

（1）摩尔吸光系数是吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数；

（2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；

（3）可作为定性鉴定的参数；

（4）同一吸收物质在不同波长下的ε值是不同的。在最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以εmax表示。εmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。

摩尔吸光系数ε的讨论

（5）εmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。

ε>105：超高灵敏；

ε=(6～10）×104：高灵敏；

ε<2×104：不灵敏。

摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度

桑德尔灵敏度指数：S （μg/cm 2 ）

在λmax 时，A= 下，单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含量。最佳读数范围与最佳值

吸光度A与透光度T的关系:

A ＝－lg T

用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在T %=20～65% ,最佳读数范围：A =～

可求出浓度相对误差最小时的透光度T min为：

T min＝%, A min＝

第二节仪器结构

仪器基本组成

1. 光源

在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。

可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～1000 nm。

紫外区：氢、氘灯。发射185～400 nm的连续光谱。

2.单色器

将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出任一波长单色光的光学系统。

①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；

②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；

③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；

④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；

⑤出射狭缝。

3. 样品室（吸收池）

样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池（玻璃能够吸收紫外光），可见区一般用玻璃池。

4. 检测器

利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。

5. 结果显示记录系统

检流计（721）

数字显示（7230）

微机进行仪器自动控制和结果处理

（723N是带微电脑智能化的分光光度计）

第三节显色与测量条件的选择

显色反应：将待测组分转化成有色化合物的的反应。 M＋L＝ML 显色反应要求：

（1）选择性好；

（2）灵敏度高，ε>104；

（3）有色化合物ML要稳定，不分解；

（4） ML的组成要一定（只ML 无MLn）；

（5） ML与 L 颜色差别大,吸收峰波长差：Δλ>60nm.

选择合适的参比溶液

为什么需要使用参比溶液

测得的的吸光度真正反映待测溶液吸光强度。

参比溶液的选择一般遵循以下原则：

参比溶液的选择

1．M、L 均无色，可用蒸馏水作参比。

2. L 无色，M 有色，可用不加显色剂的被测试液作参比溶液。

3. L有色，M 无色，可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。

4．L、M 均有色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液。

5．改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以此溶液作为参比溶液消除于扰。

第四节 723N型分光光度计操作维护

开机操作

1、开启主机电源，仪器自动完成初始化，显示主菜单。

2 、仪器预热30分钟。

（要不要打开样品室盖子）

停机操作

1、分析完毕，按“菜单”键，返回主菜单。

（是否一定要返回主菜单，才能关电源）

2、按电源开关键，关闭仪器，切断电源。

3、检查样品室是否有溢出的溶液。清扫仪器内外卫生，作好仪器使用登记，罩上防尘罩。

日常维护

6.1.1 每次使用后应检查样品室是否积存有溢出溶液，经常擦拭样品室，以防废液对部件或光路系统的腐蚀。

6.1.2 仪器使用完毕后，应盖好防尘罩，可在样品室及光源室内放置硅胶袋防潮，但开机时一定要取出。

6.1.3 长期不用仪器时，尤其要关注环境的温度、湿度，定期更换硅胶。

常见故障和处理

定量分析分为两大部分：

1，化学分析法：（1）容量分析法：酸碱滴定法，氧化还原滴定法，络合滴定法，沉淀滴定法

（2）重量分析法

2，仪器分析法：（1）色谱分析法：气相色谱法，高效液相色谱法

（2）电化学分析法：伏安分析法，库仑分析法，电位分析法

（3）光学分析法：原子吸收法，原子发射法，红外光谱法，紫外光谱

法，

吸光光度法，拉曼光谱法

（4）质谱分析法

（5）核磁共振法