小鼠的急性毒性试验
急性毒性实验参考
小鼠口服枸橼酸托烷司琼原料急性毒性试验摘要小鼠一次灌胃枸橼酸托烷司琼原料，连续观察14 天。
观察行为反应并记录死亡情况。
死亡小鼠解剖可见心脏瘀血。
存活者第15 天全部解剖，肉眼检查主要脏器未见明显病变。
其死亡率用Bliss 法求得枸橼酸托烷司琼LD50 为418.29 mg/kg；95 可信限为390.74 447.79 mg/kg。
1.0 实验目的观察受试物一次口服对小鼠产生的急性毒性反应和死亡情况。
2.0 受试物2.1 名称：枸橼酸托烷司琼原料，白色粉末。
2.2 提供单位：中国科学院上海药物研究所朱友成组2.3 批号: 99022.4 含量：99.7%2.5 配制方法：将受试药物用0.5％CMC-Na 研磨配制成混悬液，并稀释成相应浓度，使各剂量组给药体积相等。
2.6 溶剂：0.5％CMC-Na3.0 动物3.1 来源、种属、合格证：昆明种小鼠60 只，（♀30 只，♂30 只）由中国科学院上海实验动物中心提供，合格证：中科动管第005 号。
经一周适应性饲养。
饲料购自中英合资上海西普尔必凯实验动物有限公司。
自由取水，饲养温度为23 2℃。
3.2 体重：给药时体重为18 22 克。
3.3 性别：雌雄各半。
3.4 每组动物数：按体重随机分组，实验时以每10 只(♀5 只，♂ 5 只)为一组4.0 剂量4.1 剂量设置：按预初实验结果，最高剂量定为570 mg/kg。
以0.9 的比例递减，即为570、513、461.7、415.5、374、336.6 mg/kg，6 个剂量组。
4.2 每只动物接受容量：口服体积为0.2 ml/10g 体重。
5.0 给药途径小鼠禁食 6 小时一次灌胃给药。
6.0 方法动物按体重随机分 6 组，每组10 只，雌雄各半，每组的小鼠体重分布相似。
给药后即观察动物各方面反应情况，死亡动物即进行解剖，检查内脏。
记录每天动物的死亡数。
7.0 观察指标7.1 观察期：14 天7.2 毒性反应：观察检查小鼠外观、行为、进食、粪便等情况，死亡动物进行尸解。
注射用多西他赛小鼠急性毒性试验
注射用多西他赛小鼠急性毒性试验摘要】目的研究注射用多西他赛对小鼠的急性毒性作用，为临床安全用药提供参考。
方法将注射用多西他赛配制成适当浓度，观察小鼠静脉注射的急性毒性。
结果注射用多西他赛小鼠急性毒性试验设定剂量分别为：400.0mg/kg、320.0mg/kg、256.0mg/kg、204.8 mg/kg、163.8mg/kg和对照组。
400.0mg/kg组死亡率为100%；320.0mg/kg组死亡率为60%；256.0mg/kg组死亡率为20%；204.8mg/kg组死亡率为10%。
163.8mg/kg和对照组无动物死亡。
结论注射用多西他赛小鼠静脉给药半数致死量（LD50）为290.7mg/kg，95%可信区间为263.2－321.1。
【关键词】注射用多西他赛急性毒性动物实验【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）33-0045-02多西他赛(docetaxel)，又名多烯紫杉醇，是半合成紫杉醇衍生物,属第2代紫杉烷类抗癌药。
多西他赛属紫杉烷类药物，其细胞毒作用机制与紫杉醇类似，能通过实质上“冻结”细胞内在骨架二抑制肿瘤细胞分化，最终导致肿瘤细胞死亡。
该药物主要用于乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌等多种实体肿瘤，是临床现有药物中治疗转移乳腺癌(MBC)和非小细胞肺癌(NSCLC)最有效的单剂化疗药物[1]。
本试验在GLP条件下，按照相关技术指导原则要求，对注射用多西他赛的急性毒性进行研究，为临床用药提供依据。
1 材料与方法1.1 药物与试剂注射用多西他赛（docetaxel,20mg/支），批号20090618，由江苏省药物研究所提供；本品为白色块状物，临床静脉滴注给药，单药剂量为75～100mg/m2，国内用75mg/m2；5%葡萄糖注射液，由南京小营药业集团有限公司提供，批号2009021801。
1.2 动物SPF级ICR小鼠120只，雌雄各半，5-6周龄，体重18-22g；生产许可证号：SCXK(苏) 2008-0010由江苏省科技厅签发，由南通大学实验动物中心提供。
《食品毒理学》经口急性毒性试验
《食品毒理学》经口急性毒性试验一、实验目的和要求掌握给药方法；了解一次或24小时内多次给予受试化学物后，动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因，观察受试动物毒性反应与剂量的关系，求出半数致死量。
二、主要仪器设备实验动物：成年昆明系实验小鼠（SPF级别）。
器材：注射器（0.25，1，2，5ml）、吸管（0.1，0.2，0.5，1，2，10ml）、容量瓶（10，25，50ml）、烧杯（10，25，50ml）、滴管、灌胃针12号、动物体重秤、解剖剪刀、镊子、手术手套，口罩。
试剂：受试化合物（氯化钡溶液，20mg/mL）。
三、实验原理氯化钡是强电解质，可完全电离出钡离子，导致钡离子在小鼠血液内部引发急性低钾血症，故小鼠会出现肌无力和发作性软瘫，心肌应激性减低，各种心律失常和传导阻滞，由于肌无力，严重中毒的小鼠还会出现呼吸困难乃至死亡等症状。
四、实验内容1．健康动物的选择和性别鉴定。
2．实验动物称重、编号和随机分组。
3．受试化学物溶液的配制。
4．小鼠灌胃操作技术。
（1）预实验，取小白鼠、称重、随机分为5组，每组3只，以灌胃的方式给予等体积、不同剂量的氯化钡溶液，摸索小鼠接近100%和0%死亡的剂量范围。
（2）小鼠随机分为5组，每组3只，以灌胃的方式给予等体积、不同剂量的氯化钡溶液。
小鼠灌胃法：将钝头的12号注射针（适用于小鼠），安装在适当容积的注射器上，吸取所需的受试物溶液，左手抓住动物双耳后至背部的皮肤（小鼠仅抓住耳后、颈部的皮肤，用无名指、小手指和大鱼际肌将其尾根部压紧），将动物固定成垂直体位，腹部面向操作者。
注意使动物的上消化道固定成一直线。
右手持注射器，将针头由动物口腔侧插入，避开牙齿，沿咽后壁缓缓滑人食管。
若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，一旦感觉阻力消失，即可深入至胃部。
如遇动物挣扎，应停止进针或将针拔出，千万不能强行插入，以免操作穿破食管，甚至误人气管，导致动物立即死亡。
小鼠的急性毒性试验
组再分为5 个处理组( 以单一农药24h 半致死浓度LC50作为1 个毒性强度单位) . 每次实
验分别取相应的2 种农药的单一对照组和5 个处理组, 每处理组设3 个重复. 给药后观察
24h,记录动物中毒表现和死亡情况以及体重变化情况。对死亡动物和试验结束时的存活动物
处死解剖。用概率单位法计算PQ的LD50及其95%可信区间。
五种农药对小鼠的急性毒性试验
绪论 随着现代农业的飞速发展，农药的应用越来越广泛，在农林作物的病虫防治中,农药一直发 挥着巨大作用,尤其是本世纪60-70年代,人们大量使用农药,几乎使粮食产量增长一倍,但随 着农药长期的、大量的、不合理的使用,导致了对环境的严重污染并对人体健康产生极大的 影响。它们对动、植物和人类的危害越来越严重。一方面它们可以直接进入生物体内引起急 性、慢性中毒和畸变，同时还通过径流、排污、挥发等途径进入土壤、大气和水体，引起各 种生态环境下生物的死亡，并通过食物链的富集影响人类的食品安全。 目前，因农药使用 与管理失控而引发的一系列水域环境污染以及食品安全等问题，已引起政府相关部门和业内 学者的广泛重视。当前，随着有机氯农药的禁用，菊酯类和有机磷类等成为我国目前使用较 广泛的农药。 《中华人民共和国农药管理条例》指明，农药是指用于预防、消灭或者控制危害农业、林业 的病、虫、草和其他有害生物以及有目的地调节植物、昆虫生长的化学合成物或者几种物质 混合物及其制剂。农药残留是指农药使用后残存于环境、生物体和食品中的农药及其衍生物 和杂质的总称。动植物在生长期间、食品在加工和流通中均可受到农药的污染，导致食品中 农药残留。 相关报道表明，农药利用率一般为10%，约90%的残留在环境中，过多地使用农药，大量未被 利用的农药经过降雨、农田渗滤和水田排水等进入水体，同时，还有大量散失的农药挥发到 空气中，最后汇入水域，沉降积淀在土壤中，通过农作物吸收和食物链进入人体进行累积， 并对人体健康造成危害。目前中国一些食品，如茶叶、大米、肉、蛋等食品中农药残留量常 超过规定标准，过多的残留量对人体健康会造成危害。为此，论述农药残留对人体健康的危 害效应及其毒理机制和防治措施，以期对防治食品中农药残留对人体健康的危害提供理论依 据。 在哺乳类实验动物中，由于小鼠个体小，饲养管理方便，生产繁殖快，质量控制严格，价廉 可以大量供应，又有大量的具有各种不同特点的近交品系，突变品系，封闭群及杂交一代动 物，小鼠实验研究资料丰富参考对比性强；更重要一点乃是全世界科研工作者均用国际公认 的品系和标准的条件进行试验，其实验结果的科学性、可靠性、重复性高，自然会得到国际 认可。 本文以百草枯、甲氰菊酯、乐果、草甘膦和敌敌畏五种常用农药为实验材料, 检测了它们对
《动物毒理实验》课件：实验一 小鼠经口急性毒性试验
根据实验设计要求确定最高剂量组所需受 试化学物的浓度和总体积，配制母液。
（3）等容量稀释法配制6个剂量组的染毒溶液
➢ 求母液浓度C1 绝对致死剂量为2500mg/kg，最低中毒剂
量为800mg/kg，每10g体重小鼠灌胃0.2mL C1=2500mg/kg×10g/0.2mL＝125mg/mL ➢ 求公比r
三、实验试剂和材料
1. 药物与试剂 盐酸二甲硝咪唑、苦味酸酒精 饱和溶液和中性红溶液、记号笔
2. 设备与器械 吸管、烧杯、灌胃器、电子天 平（感量0.1 g）、外科手术剪、5 mL注射器、 10 mL注射器、干棉球 3. 实验动物 成年健康小鼠，18-22g，雌雄 各半
四、实验步骤
1. 剂量选择： 查阅文献，估计预期毒性中值；
式中，K：各组剂量的比值，K＝1/r。 取母液m mL置一容器中，供最高剂量组染毒用；加入
m mL溶剂，稀释后的浓度为C2，C1︰C2＝1︰K，取出 m mL供第二组动物染毒用；再加入m mL溶剂，稀释后的 浓度为C3，C2︰C3＝1︰K，取出m mL供第三组动物染 毒用。依次类推，配制其它不同剂量组的试液。
可能的中毒表现： 兴奋，活动增加、骚动、窜跑、跳跃、呼吸加深加快； 抑制，活动减少、呆立、静卧、步态不稳、呼吸困难等； 刺激症状：搔鼻、尖叫、出汗、流涎、眼耳鼻等的出血。
观察指标（2）
体重 观察期间的体重变化可以反映动物中毒
后的整体变化，应3-5天测量一次； 体重减轻：可能是动物食欲下降、摄食
量减少；也可能是化合物干扰代谢系统，影 响食物吸收、利用；
（1） 动物的禁食和复食：灌胃前禁食6～10h，使 动物保持空腹状态，且不至因禁食时间过长影响肝 脏，进而影响实验结果。灌胃后至少2～3h后才能 复食，灌服油剂比水剂要求复食时间更长； （2） 灌胃体积：小鼠每10g体重灌胃0.1～0.2mL， 最多不超过0.4mL。小鼠灌胃量的极限是0.5～1mL； （3） 灌胃方法和注意事项。
动物急性毒性试验-小鼠
动物急性毒性试验(Acute toxicity test,Single dose toxicity test),研究动物一次或24小时内多次给予受试物后,一定时间内所产生的毒性反应.拟用于人体的药物通常需要进行动物急性毒性试验[1].急性毒性试验处在药物毒理研究的早期阶段,对阐明药物的毒性作用和了解其毒性靶器官具有重要意义.急性毒性试验所获得的信息对长期毒性试验剂量的设计和某些药物Ⅰ期临床试验起始剂量的选择具有重要参考价值,并能提供一些与人类药物过量急性中毒相关的信息[实验目的]通过实验，培养学生科研设计能力，提高学生科研思维素质；学习药物急性毒性实验的测定方法（统计方法）及观察方法。
1、计算敌百虫半数致死量。
[实验材料]小白鼠（雌雄均可，18-22 g）、鼠笼、1ml注射器、苦味酸溶液、敌百虫等。
（计算机仿真实验）[实验方法]1. 预试验：取小鼠24只，以4只为一组分成6组，选择组间距较大的一系列剂量，各组分别灌胃给药敌百虫，观察出现的症状并记录死亡数，找出引起0%死亡率和100％死亡率剂量的所在范围。
2. 正式试验：在预试验所获得的0%和100%致死量的范围内，选用5个剂量，相邻剂量之间的比例为1：0.7。
将小鼠随机分组，每组10只小白鼠灌胃给药敌百虫。
3. 观察纪录给各种反应：潜伏期，中毒现象，开始出现死亡的时间，死前的现象，各组死亡的只数等。
通常药后要观察3-7天。
根据各组动物的死亡率，用改良寇氏法（Korbor）或简化机率单位法算出LD50和可信限。
[实验结果]在给药后1 小时内，随药物剂量的增加，小鼠中毒的潜伏期逐渐缩短，中毒症状随药物剂量的增加和作用时间的延长而逐渐加重（口吐泡沫→大小便失禁→肌肉僵直→兴奋→死亡）。
给药后3 小时内各组小鼠死亡情况见下表：组别动物数（n ）给药剂量（mg/kg）对数剂量（X）动物死亡数死亡率（P）P21 10 384 2.58 1 0.1 0.012 10 548 2.743 0.3 0.093 10 784 2.89 4 0.4 0.164 10 1120 3.056 0.6 0.365 10 1600 3.20 8 0.8 0.64i=0.15 ∑P=2.2∑P2=1.26 [结果计算]实验完毕后，清点各组死亡鼠数并计算出死亡率（P），采用改良寇氏（Korbor）法计算LD50。
小鼠的急性毒性试验
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4.结论 5.参考文献
钟子期听懂了俞伯牙的琴音——“巍巍乎若高山，荡荡乎若流水”,俞伯牙视其为知音。钟子期死后，面对江边一抔黄土，俞伯牙发出“此曲终兮不复弹，三尺瑶琴为君死”的感慨，摔琴而去， 从此，高山流水，知音难觅。
红楼里，宝钗与黛玉皆爱宝玉，宝钗看重功名，常拿一些伦理纲常来压制他的不羁与顽劣，黛玉却从未提及这些，因她懂得他的心性，她说“ 你既为我之知己，自然我亦是你之知己”, 造化弄人，木石前缘虽是虚空一场，却怀金悼玉，梦萦千古，今日读来依然荡气回肠！
2结果不分析21单一农药对小鼠急性毒性211中毒症状212实验结果不分析表4单一急性毒性实验前后小鼠体重变化农药浓度设置mgl实验前体重g实验h后体重g百草枯精品感谢下载载乐果敌敌畏单一急性毒性实验中小鼠死亡情况农药浓度设置mgl死亡数量死亡概率x百草枯乐果精品感谢下载载敌敌畏22五种农药对小鼠癿联合急性毒性221中毒症状222实验结果不分析联合急性毒性实验中小鼠死亡情况农药组合浓度组合mgl02080406050506040802甲氰菊酯乐果甲氰菊酯敌敌畏百草枯乐果百草枯敌敌畏精品感谢下载载乐果敌敌畏乐果草甘膦敌敌畏草甘膦联合急性毒性实验前小鼠体重农药组合小鼠体重g浓度组合mgl02080406050506040802甲氰菊酯乐果甲氰菊酯敌敌畏百草枯乐果百草枯敌敌畏乐果敌敌畏乐果草甘膦敌敌畏草甘膦联合急性毒性实验后小鼠体重农药组合小鼠体重g浓度组合mgl02080406050506040802精品感谢下载载甲氰菊酯乐果甲氰菊酯敌敌畏百草枯乐果百草枯敌敌畏乐果敌敌畏乐果草甘膦敌敌畏草甘膦3
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杏花疏影小楼边，一腔笛韵委婉悠扬；山亭古寺四月间，深涧桃花兀自娇娆；暗香疏影黄昏后，东篱素菊暗香盈袖；柴门冬雪夜归人，红泥火炉绿蚁新醅……若懂得，景与物，也相宜。 彷徨失意时，一句懂得，是严冬的一场花开春暖，茫然无助时，一句懂得， 是酷暑的一阵清凉细雨，心与心的贴近，皆因一个“懂得”而欣慰，美好。
乙醇小鼠急性经口毒性评价
实验二、乙醇小鼠急性经口毒性评价
体重 (若动物无死亡，应称重)
反映动物中毒后综合性整体变化，比较客观简便的 量化指标 应定期多次称量动物的体重变化，一般为每周1次 对体重指标的变化要仔细观察和分析
用5个剂量时，
LDk的可信限= log-1(logLDk + 1.96 S ) (P=0.95) X ----为对数剂量； i-----为相邻两组剂量比值（以高剂量组为分子）的对数； y-----为死亡率相应的机率单位（查附表）； 1、2、3、4、5…为小剂量组到大剂量组的顺序。 yK----为LDk所相当的反应率的机率单位 W----为权重系数（查表）
+ + i=0.1
+ + + + +
-
0 2 2 1 5
2 3 2 0 7
2 5 4 1 12
根据上表数据计算：n=12,n2=144 ∑xf=12.59*2+10.0*5+7.94*4+6.31*1=113.25 (∑xf)2=12825.56 ∑x2f =12.592*2+10.02*5+7.942*4+6.312*1=1109 n ∑x2f =13308 因此，该化学物小鼠经口LD50 LD50=1/12*113.25=9.44(mg/kg) 及其95%可信区间范围为 S=0.55(mg/kg) 9.44mg/kg (8.37~10.51mg/kg).
0%和100%反应率的权重表
小鼠口服急性毒性试验等(1)
小鼠口服急性毒性试验等(1)小鼠口服急性毒性试验是一种对化学物质进行毒性评价的方法。
它是毒性测试的基础，也是化学品安全评价必不可少的环节。
本文将从试验原理、方法、结果解释等方面详细介绍小鼠口服急性毒性试验。
一、试验原理小鼠口服急性毒性试验是一种比较常见的毒性试验方法，它的原理是将待测化学物质按照一定剂量直接灌入小鼠口腔，通过观察动物死亡率、体重、行为等来评估待测物质的毒性。
一般来说，这种试验方法具有可重复性高、操作简便、成本低廉等优点。
二、试验方法1. 制备试验物质：按照试验计划，制备待测化学物质，并确定试验剂量。
2. 动物实验：选用符合规范要求的小鼠，将待测物质按剂量直接灌入小鼠口腔，观察小鼠的体重、行为等。
3. 处理数据：将实验数据录入计算机，计算LD50值，评估待测物质的毒性等级。
三、试验结果解释完成试验后，需要对试验结果进行分析和解释。
小鼠口服急性毒性试验的结果主要包括LD50值和毒性等级，其中，LD50值是介于试验剂量和死亡率之间的浓度，在一定时间内能导致50%的动物死亡。
根据LD50值的大小，可以将待测物质分为五类，分别是：1. 第一类：LD50值大于5000mg/kg，属于低毒性。
2. 第二类： LD50值在500-5000mg/kg，属于中毒性。
3. 第三类： LD50值在50-500mg/kg，属于高毒性。
4. 第四类： LD50值在5-50mg/kg，属于极高毒性。
5. 第五类： LD50值小于5mg/kg，属于剧毒性。
对于口服急性毒性试验来说，评估化学物质的毒性等级具有一定的局限性，因为它并不能全面反映化学物质在长期使用中的慢性毒性或致癌性等潜在危害。
因此，在进行毒性测试时，需要结合其他试验方法和临床实验来综合评估化学物质的毒性。
总之，小鼠口服急性毒性试验是一种简单、有效的毒性测试方法，但也需要在更大的层面上同时考虑其他因素，才能更全面地评估化学物质的毒性。
丹酚酸B对小鼠的急性毒性试验
关 于丹 酚酸 Ｂ的急性毒性试验结果未见文献报道 ， 对丹 酚酸 Ｂ的毒性研 究也较少 。本 文对丹 酚酸 Ｂ进行 了急性 毒 性试验 ， 结果表 明， 实验 小 鼠尾静 脉注射 过量 的丹酚 酸 Ｂ后 会 出现一定 的中毒 现象 ， 半 数致 死 量为 ６６ ８０ ９ｍ 其 ３ ． ９ ｇ・ ｋ ～，Ｄ ｏ ９ ％ 可 信 限 为 ６ ７ ２ ５ ５—６ ７ １２ ８ ｍ ｇ Ｌ ５的 ５ １ ． ２ ５ ． ８ ｇ・ ｋ ～。生存的小 鼠体重增加与生理盐水组基 本相 同 ， ｇ 将存 活 小 鼠处死后 ， 肉眼观察未见主要脏器病 理改变 。以上结果显
验采用尾静脉单次注射给药 方式 给药 ， 给药 容积 为 ２ Ｌ・ ０ｍ
～
，
给药时 间在 ３ 完 成。４ｈ内严密 观察 ， ２天起 ， ０Ｓ 第 每
天观察 ２次 ， 连续观察 １ ， ４ｄ 隔天称量 动物体重 ， 记录动物 的 饮食 、 外观 、 为、 行 分泌物 、 排泄物 、 毒性反 应和死亡情 况。对
・
示 ， 酚酸 Ｂ的毒性较低 ， 丹 临床应用 比较安全 。
由于 对 丹 酚 酸 Ｂ的 毒 性研 究 未 见 报 道 ， 文 对 丹 酚 酸 Ｂ 本
ｋ 组 的仅存活 一只 动物 ， ｇ 体重增 加较 大 ， 腹腔 有部 分积
表 １ 丹酚酸 Ｂ静脉注射小 鼠的体重变化
液， 可能为体重增长较多的原因（ 见表 １ 。 ）
药事 ・ ｌＰａ ａｕ Ｑｉ ｈｒ ｃ ｕ ｍｅ
厦 Ｑ ！
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５ ０３ ・
丹 酚 酸 Ｂ对 小 鼠 的 急 性 毒 性 试 验
凌 真 ， 登存 ， 董 李倚 云 ， 闻硎毓
（ 州 药 品检 验 所 ， 苏 扬 州 ２ ５０ ） 扬 江 ２０ ９
小鼠急毒实验标准操作LD50 SOP
标准操作规程(Standard Operating Procedure)小鼠LD50毒性试验编号：制定日期：起草人：审核人：BALB/c 小鼠LD50毒性试验1.实验目的衡量化合物的毒性，寻找安全剂量范围，为进一步体内活性评价提供数据支持。
2.实验原理经口一次性给予或24 h 内多次给予受试物后，在短时间内观察动物所产生的毒性反应，包括致死的和非致死的指标参数，致死剂量通常用半数致死剂量LD50来表示。
3.实验内容(1) 探测化合物的LD50剂量范围。
(2) 确定组数并计算各组剂量。
(3)正式实验：给不同组的小鼠灌胃不同剂量的药物，并观察记录各组别小鼠的行为变化及死亡情况。
(4)记录实验结果，并计算LD50。
4.实验材料试剂：化合物，生理盐水。
材料：电子天平，注射器，灌胃针。
实验动物：动物品系：BALB/c小鼠；性别：雌性；级别：SPF级；年龄：7周龄，实验周期内的动物年龄约为8-10周龄；体重，20±2g，实验前禁食12h。
5.实验方法与步骤1．预实验：取小鼠20只，以3只为一组，分成5组。
单次口服固定剂量方法（Fixed-dose procedure）。
选取一组剂量，进行化合物溶液灌胃给药。
给药前禁食不禁水12小时，观察出现的症状并记录死亡数，找出引起0%及100%死亡率剂量的所在范围。
2．正式试验：在预试验所获得的0%和100%致死量的范围内，选用几个剂量（一般用5个剂量，按等比级数增减，相邻剂量之间比例为1:0.7或1:0.8）和生理盐水溶媒对照组，各组动物数为10只，分别用marker笔标记。
动物的体重和性别随机分配，完成动物分组和剂量计算后灌胃给药最好先从中剂量组开始，以便能从最初几组动物接受药物后的反应来判断两端的剂量是否合适，否则可随时进行调整，尽可能使动物的死亡率在50%上下，死亡率为0%或100%时，不能用于计算。
6.观察与记录首日给药后4小时内每小时密切观察小鼠活动状态和死亡情况，每天对各组小鼠进行称重，统计死亡数量。
小鼠口服急性毒性试验等-V1
小鼠口服急性毒性试验等-V1
小鼠口服急性毒性试验是一种常用的毒性测试方法，它是用来评估一
种化学物质在短时间内对小鼠生命的影响。
试验流程：
1.实验动物：以小鼠为试验动物，分成不同剂量组和一组对照组。
2.剂量制备：根据需要的剂量，制备出测试物质的不同浓度的溶液。
3.给药：给实验组小鼠口服不同浓度的溶液，对照组小鼠则没有给药。
记录给药时间和剂量。
4.观察：观察实验组小鼠在给药后的表现，包括体重变化、呼吸状况、行动能力、食欲等，一般会持续3-14天。
5.结果分析：根据实验的结果，计算出药物的致死剂量（LD50），并
确定药物的毒性等级。
实验注意事项：
1.按照标准化程序进行实验，保持严谨性和可重复性。
2.保证实验室和动物房的干净和卫生。
3.正确选择实验动物，保证实验的可靠性。
4.严格控制药物剂量，避免实验误差。
5.细致记录实验数据，确保数据的准确性。
小鼠口服急性毒性试验是一种常见的毒性测试方法，但是也存在一些限制，如试验结果只针对小鼠，不能直接推广到人类。
同时，在进行该项实验时应该遵循相关法规和伦理要求，保证实验的合法性和道德性。
《动物毒理实验》课件：实验一 小鼠经口急性毒性试验
注意事项
▪ 保定时：一定要固定好动物，使动物头不 要随意摆动，但不能挤捏颈部。
▪ 灌胃器针头弧度面向前从动物右嘴角处插 入，灌胃动作要轻柔。不能虐待动物，尤 其是大鼠，否则，容易被其咬伤。
▪ 插入灌胃针时，如果遇到阻力，不能用力 继续进针，应停止进针，等待其自动吞咽 时，迅速进针。否则，容易损伤动物食道。
➢ 给药：
以灌胃器轻轻压其头部，
使口腔与食道成一条直线;
再将灌胃针沿上腭壁轻轻
Байду номын сангаас
进入食道; 当灌胃针进入约3cm左右 时即达胃内。
小鼠灌胃法
灌胃时的注意事项
▪ 如果灌胃针的位置插入正确，小鼠可自行 吞服药；
▪ 灌胃针插入位置不正确，小鼠会强烈挣扎， 必须拔出重插，否则可能将药物灌入气管， 造成小鼠死亡；
（1） 动物的禁食和复食：灌胃前禁食6～10h，使 动物保持空腹状态，且不至因禁食时间过长影响肝 脏，进而影响实验结果。灌胃后至少2～3h后才能 复食，灌服油剂比水剂要求复食时间更长； （2） 灌胃体积：小鼠每10g体重灌胃0.1～0.2mL， 最多不超过0.4mL。小鼠灌胃量的极限是0.5～1mL； （3） 灌胃方法和注意事项。
➢ 药物溶液的配制 ✓ 称取盐酸二甲硝咪唑6.25g，用生理盐水或
蒸馏水将药物溶解并稀释至50mL，即为 母液(母液浓度为125mg/mL)； ✓ 从母液中取10mL供第1组动物染毒； ✓ 在剩下的母液中加入10mL溶剂，稀释后 取10mL供第2组染毒； ✓依次类推，配制其它不同剂量组的试液。
4. 灌胃给药
√ r=
n-1
b a
=
小鼠急性毒性试验心得体会
小鼠急性毒性试验心得体会
这次的急性毒性试验是在24 h内一次或多次给予实验动物一定
剂量受试物后，观察动物的中毒表现及程度，死亡特征及数量，并
根据剂量-反应关系求出LD
50，以评价化学物的急性毒性作用。
半数致死剂量(LD
50)是指引起一组受试实验动物半数死亡的剂量。
LDgo值需经过统计处理计算而得到，常用以表示急性毒性的大
小。
LD
50值越大，表示受试物的毒性越低，反之LD50值越小，则毒
性越强。
我们采用了健康小鼠或大鼠，小鼠体重l8-25g，大鼠体重l80-240g，雌雄各半。
动物总数和每组动物数应根据不同LD50计算方法而定。
本次实验的意义和目的是化学毒物经口急性毒性试验是研究化学物毒效应的基本试验，经口染毒的方法是现代毒理学中重要的基本技术之一。
本试验目的是学习急性毒性试验的实验设计原则、动物随机分组方法及经口灌胃技术，掌握主要的LD50计算方法和急性毒性分级标准。
ld50测定
实验一、LD50的测定[目的] 通过测定药物LD50的方法、步骤和计算过程，了解急性毒性试验的常规。
[材料] 小鼠50只(体重17－25g，雌雄各半) 注射器及针头1. 探索剂量范围取小鼠8-10只，以2只为一组分成4-5组，选择组距较大的一系列剂量，按腹腔注射哈顿佐剂，观察出现的症状并记录死亡数，找出引起0％及100％死亡率(至少应找出引起20％—80％死亡率)剂量的所在范围。
2. 进行正式试验在预初试验所获得的0％和100％致死量范围内，选用5个剂量按等比级数增减；尽可能使半数组的死亡率都在50％以上，另半数组的死亡率都在50%以下。
每组10只左右，动物的体重和性别要均匀分配。
完成动物分组和剂量计算后按组腹腔注射给药。
最好先从中剂量组开始，以使能从最初几组动物接受药物后的反应来判断两端的剂量是否合适，否则可随时进行调整。
LD50测定中应观察记录的项目：1、实验各要素：实验题目，实验日期，室温，检品的批号、规格、来源、理化性状、配制方法及所用浓度等；动物品系、来源、性别、体重、给药方式及剂量(药物的绝对量与溶液的容量)和给药时间等。
给药后各种反应；潜伏期(从给药到开始出现毒性反应的时间)；中毒现象及出现的先后顺序，开始出现死亡的时间；死亡集中时间；末只死亡时间；死前现象。
逐日记录各组死亡只数。
尸解及病理切片：从给药时开始记时，凡两小时以后死亡的动物，均及时尸解以观察内脏的病变，记录病交情况．若有肉限可见变化的则需进行病理检查．整个实验一般要观察7-14天，观察结束时，对全部存活动物称重，尸解，同样观察内脏病变并与中毒死亡鼠尸解情况相比较。
当发现有病变时，也同样作病理检查，以比较中毒后病理改变及恢复情况。
2、结果计算根据试验设计，采用相应的方法计算LD50，一般采用按Reed－Muench法计算或寇氏改进法karber法。
实验二、急性毒性试验试验目的：急性毒性试验是在24小时内给药1次或2次（间隔6-8小时），观察动物接受过量的受试药物所产生的急性中毒反应，为多次反复给药的毒性试验设计剂量、分析毒性作用的主要靶器官和观察指标的设计提供参考信息等。
实验1-小鼠经口染毒LD50测定
√
pq ∑ n
根据lg LD50及其95%可信限值： 计算：lg LD50± 1.96Sm 得出 LD50及其95%可信区间范围。
急性毒性分级（评价）
毒性分级 剧毒 高毒 中等毒 低毒 实际无毒 大鼠一次经口LD50 （mg/kg） <1 1~ 50~ 500~ 5000~
实验报告撰写(经口LD50测定)
* 小鼠的编号是按体重由轻至重排序后填到表中的
甲 1
乙 2
丙 3
丁 4
戊 0
6.灌胃操作（等体积，1ml）
受试物配置：母液+生理盐水=1ml
母液量ml= 鼠重(kg)×吸取药剂量(剂量 组量mg/kg÷100mg/ml)
氯化镉小鼠经口染毒死亡情况
组别 1 2 3 4 5 剂量 mg/kg 112 150 200 267 356 对数 2.049 2.176 2.301 2.427 2.551 动物数 （n） 10 10 10 10 10 死亡数 （只） 死亡率 存活率 （p） （q） pq
称重和编号注意事项：
先编号（雌性1-25，雄性26-50）； 再称重;并记录每个号和对应的重量；等 标号干后再放入笼中，以免鼠间摩擦使 编号不清。
பைடு நூலகம்
⑶ 随机分组 随机数字的获取方法： f（x）=RAND()*100 同性别同一组动物体重差异应小于平 均体重的10% 不同组间的平均体重差异应小于5%
小鼠经口的急性毒性评价
小鼠经口的急性毒性评价食品质量与安全：张志颖指导教师：丁志刚摘要：通过霍恩法对啮齿类动物小白鼠做急性毒性实验，以氯化镁溶液为外源化学物，了解氯化镁溶液对机体是否产生毒效应。
确定外源化学物的致死剂量及其他急性毒性参数，通过观察动物中毒表现、毒作用强度和死亡情况，初步评定外源化学物的毒效应特征、靶器官、剂量—反应关系和对人体产生损害的危险性。
关键词：小白鼠氯化镁溶液霍恩法急性毒性评价1前言氯化镁常温下为白色结晶，易吸湿，100℃时失去2分子结晶水，在110℃开始失去部分盐酸而分解，强热转为氧氯化物，其PH约为<7,有刺激性，氯化镁是有毒的，其次氯化镁是低毒的。
氯化镁本身的毒性来自其本身凝血的作用，例如卤水点豆腐，就是使蛋白质凝固。
假如一定剂量的氯化镁进入血液，血液凝固，人必死无疑。
所以说氯化镁对于温血动物来说还是有一定的杀伤力。
制作豆腐时，氯化镁可以作为很好的混凝剂。
它常与硫酸镁一起凝固豆奶，由于其营养价值，氯化镁还是婴儿配方奶粉的组成部分。
2材料与方法2.1 材料试验动物：健康成年小鼠16只，雌雄各半，体重在18~25g之间。
2.2仪器与试剂试验器材：注射器、刻度吸管、容量瓶、小烧杯、滴管、灌胃针、电子天平、镊子、动物体重秤、手套。
试验试剂：受试物（氯化镁）、3%~5%的苦味酸溶液、0.5%的品红溶液。
2.3实验方法2.3.1健康动物选择2.3.2性别辨认2.3.3小鼠称重、编号和随机分组根据霍恩法将小鼠分为4个小组，每组4只。
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 随机数18 43 38 62 82 16 48 35 67 05 72 12 25 83 43 41除4余数 2 3 2 2 2 0 0 3 3 1 0 0 1 3 1 1所在组别二三二二二四四三三一四四一三一一2.3.4剂量设置（1000mg/kg、2150mg/kg、4640mg/kg、10000mg/kg）组号一二三四染毒剂量1000mg/kg 2150mg/kg 4640mg/kg 10000mg/kg27.75mg 57.587mg 122.96mg 280mg每组小鼠染毒毫克数2.3.5氯化镁溶液的配制（1）氯化镁的量取（称量法）准确称取12.6575g的氯化镁固体，加蒸馏水溶解后，倒入25ml容量瓶，混匀，再加蒸馏水定容至刻度。
医疗器械--小鼠急性全身毒性试验操作规范
医疗器械--小鼠急性全身毒性试验操作规范试验目的急性全身毒性试验的目的是通过尾静脉注射途径、腹腔注射途径或其他符合国家标准GB/T16886.11-2011《医疗器械生物学评价第11部分：全身毒性试验》中所提到的途径，给予小鼠试验样品的原液或浸提液，并在规定周期内观察小鼠的临床表现、死亡情况及体重变化情况，以确定试验样品是否具有对小鼠产生急性全身毒性的可能。
本试验依据GB/T16886.11-2011《医疗器械生物学评价第11部分：全身毒性试验》规定的方法来进行。
试验样品及浸提液的制备试验样品信息委托单位应按要求提交试验样品的详细资料。
浸提介质符合GB/T16886.12-2017《医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照材料》规定的极性浸提介质和非极性浸提介质。
例如：极性介质生理盐水（SC）和非极性介质棉籽油（CSO）。
试验用器具制备试验液的器皿应是洁净的、化学惰性的封闭容器，容器顶部空间应尽量小。
例如：具盖并带惰性衬层（如聚四氟乙烯）的硼硅酸盐玻璃试管，或符合GB/T16886.12-2017《医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照材料》规定要求的浸提容器。
试验液制备试验用浸提液应参照表面积和浸提液体积的对应关系进行制备。
试验动物名称昆明种小鼠。
来源具有试验动物生产许可证号的供应商。
性别采用单一性别动物进行试验，雌性动物要求未育无孕。
产品仅应用于某种性别时，试验应在该性别动物身上进行。
体重范围17g~23g。
年龄健康初成年的动物。
适应时期至少5天。
动物数目20只。
标记方法耳标法。
试验系统的合理性在毒理学研究中，昆明种小鼠被广泛用于急性全身毒性试验，其背景资料丰富。
试验是按照GB/T16886.11-2011中的规定进行的，符合测试标准中对医疗器械进行评价的要求。
动物管理饲养应按照符合动物实验室及试验动物管理规范而制定的标准操作规范进行饲养。
饲料选用具有生产许可证号的小鼠饲料。
饮水灭菌自来水。
急性毒性试验
急性毒性实验
取健康小鼠24只，雌雄各半，禁食24h后，生药于次日灌胃给予痛风颗粒颗粒混悬液0.78ml(16.30g／kg，相当生药量86.88g／kg)，观察小鼠活动、饮食、呼吸等情况，然后连续观察15天，纪录7天内的动物死亡数及毒性反应。
结果：灌胃后，小鼠活动减少，约1小时左右逐渐缓解，7天内24只小鼠无一只死亡及明显中毒反应。
计算过程：
常温下配的痛风颗粒最高浓度为0.417g/ml(16.30g／kg，相当生药量86.88g／kg)，颗粒密度4.73g/ml。
20g小鼠胃内容积0.78ml。
按动物表面积比率换算等效剂量换算（20g小鼠：70Kg成人=381.9:1）
按最高浓度4.73g/ml（相当生药剂量22.23g/ml）及小鼠最大灌胃容量0.78ml计算：
小鼠最大给药剂量：4.73*0.78/0.02=207.87g/kg；
按动物表面积比率换算等效剂量换算，折算70Kg成人最大给药量：207.87*0.02*387.9=1612.66g/70kg，相当生药剂量7579.5g/70Kg。
成人每日口服痛风颗粒生药剂量30g/70kg，小鼠一次口服痛风颗粒为成人每日临床常用量的253倍：7579.5/30=253倍
小鼠一次口服痛风颗粒的最大耐受量为86.88g／kg，此为成人每日临床常用量的253倍，结果表明该药口服给药临床常用量使用安全。
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五种农药对小鼠的急性毒性试验
绪论
随着现代农业的飞速发展，农药的应用越来越广泛，在农林作物的病虫防治中,农药一直发挥着巨大作用,尤其是本世纪60-70年代,人们大量使用农药,几乎使粮食产量增长一倍,但随着农药长期的、大量的、不合理的使用,导致了对环境的严重污染并对人体健康产生极大的影响。
它们对动、植物和人类的危害越来越严重。
一方面它们可以直接进入生物体内引起急性、慢性中毒和畸变，同时还通过径流、排污、挥发等途径进入土壤、大气和水体，引起各种生态环境下生物的死亡，并通过食物链的富集影响人类的食品安全。
目前，因农药使用与管理失控而引发的一系列水域环境污染以及食品安全等问题，已引起政府相关部门和业内学者的广泛重视。
当前，随着有机氯农药的禁用，菊酯类和有机磷类等成为我国目前使用较广泛的农药。
《中华人民共和国农药管理条例》指明，农药是指用于预防、消灭或者控制危害农业、林业的病、虫、草和其他有害生物以及有目的地调节植物、昆虫生长的化学合成物或者几种物质混合物及其制剂。
农药残留是指农药使用后残存于环境、生物体和食品中的农药及其衍生物和杂质的总称。
动植物在生长期间、食品在加工和流通中均可受到农药的污染，导致食品中农药残留。
相关报道表明，农药利用率一般为10%，约90%的残留在环境中，过多地使用农药，大量未被利用的农药经过降雨、农田渗滤和水田排水等进入水体，同时，还有大量散失的农药挥发到空气中，最后汇入水域，沉降积淀在土壤中，通过农作物吸收和食物链进入人体进行累积，并对人体健康造成危害。
目前中国一些食品，如茶叶、大米、肉、蛋等食品中农药残留量常超过规定标准，过多的残留量对人体健康会造成危害。
为此，论述农药残留对人体健康的危害效应及其毒理机制和防治措施，以期对防治食品中农药残留对人体健康的危害提供理论依据。
在哺乳类实验动物中，由于小鼠个体小，饲养管理方便，生产繁殖快，质量控制严格，价廉可以大量供应，又有大量的具有各种不同特点的近交品系，突变品系，封闭群及杂交一代动物，小鼠实验研究资料丰富参考对比性强；更重要一点乃是全世界科研工作者均用国际公认的品系和标准的条件进行试验，其实验结果的科学性、可靠性、重复性高，自然会得到国际认可。
本文以百草枯、甲氰菊酯、乐果、草甘膦和敌敌畏五种常用农药为实验材料, 检测了它们对
小鼠的单一和联合急性毒性效应，来评价各种农药的的毒性强弱以及对环境的危害。
1 材料与方法
1.1动物
SPF 级昆明小鼠，雌雄各半，体重18～22 g，通过腹腔注射药物给药，给药后密切观察小鼠的反应，观察4小时。
给药前禁食不禁水十二小时。
小鼠按20g体重给药0.4mL，，用药物水溶液灌胃。
1.2试验药物
甲氰菊酯( 山东大成农药厂生产) 、百草枯( 山东滨农科技有限公司生产) 、乐果( 杭州庆丰农化有限公司生产) 、敌敌畏( 南通江山农药化工有限公司生产) 和草甘膦( 镇江江南化工有限公司生产)
1.3实验方法
1.3.1预实验
分别以组间剂量比值为3.0和1.5进行预试验,通过预试验初步观察到小鼠的毒性反应和死亡情况,分别找出五种农药对小鼠经口染毒的大致致死剂量范围(即死亡率0% ～100%的剂量范围) ,确定小鼠的正式试验剂量、组数和组间剂量比值，观察小鼠反应，统计小鼠死亡时间。
1.3.2单一农药对小鼠的急性毒性实验
通过预实验求出小鼠都不死亡的最高浓度以及全部死亡的最低浓度，在这区间按等对数间距设置7个浓度组，和一个对照组（不含农药），每组做三个重复。
试验前小鼠隔夜禁食、不禁水,分别对小鼠以单纯随机方法分配到各剂量组，每组10只小鼠。
于第2天上午染毒,各实验组剂量由预试验确定,同时设立对照组(生理盐水) ,给药体积0.2 ml·(10 g) - 1体重。
给药后观察24h,记录动物中毒表现和死亡情况以及体重变化情况。
对死亡动物和试验结束时的存活动物处死解剖。
用概率单位法计算PQ的LD50及其95%可信区间。
表1 单一急性毒性实验中各农药的浓度设置
农药浓度设置（mg/L）
甲氰菊酯
百草枯
乐果
敌敌畏
草甘膦
1.3.3五种农药对小鼠的联合急性毒性实验
通过各种单一农药对小鼠的急性毒性实验，计算出各种农药对小鼠的24h的半致死浓度（LC50），以加和等毒性强度方式设置两种农药的联合毒性浓度梯度，共10种农药组合，每组再分为5 个处理组( 以单一农药24h 半致死浓度LC50作为1 个毒性强度单位) . 每次实验分别取相
应的2 种农药的单一对照组和5 个处理组, 每处理组设3 个重复. 给药后观察24h,记录动
物中毒表现和死亡情况以及体重变化情况。
对死亡动物和试验结束时的存活动物处死解剖。
用概率单位法计算PQ的LD50及其95%可信区间。
表2 联合急性毒性实验中各组合农药的浓度设置
浓度组合（mg/L）
农药组合
0.2+0.8 0.4+0.6 0.5+0.5 0.6+0.4 0.8+0.2
甲氰菊酯+百草枯
甲氰菊酯+乐果
甲氰菊酯+敌敌畏
甲氰菊酯+草甘膦
百草枯+乐果
百草枯+敌敌畏
百草枯+草甘膦
乐果+敌敌畏
乐果+草甘膦
敌敌畏+草甘膦
1.4毒性评价标准
表3农药急性经口毒性标准
级别经口LD50（mg/Kg）
剧毒<5
高毒5~50
中毒50~500
低毒>500
1.5观察指标
全面观察中毒的发生、发展过程和规律以及中毒特点和毒作用的靶器官。
观察的系统包括：1、中枢神经系统和神经肌肉系统：体位异常、叫声异常、不安、呆滞、痉挛、抽搐麻痹、
运动失调、对外反应过敏或迟钝；
2、植物神经系统：瞳孔扩大或缩小、流涎或流泪；
3、呼吸系统：鼻孔流液、鼻翼煽动、呼吸深缓、呼吸过速、蜂腰；
4、泌尿生殖系统：会阴部污秽、有分泌物、阴道或乳房肿胀；
5、皮肤和毛：皮肤充血、紫绀、被毛蓬松、污秽；
6、眼：眼球突出、结膜充血、角膜混浊；
消化系统：腹泻、厌食。
2结果与分析
2.1单一农药对小鼠急性毒性
2.1.1中毒症状
2.1.2实验结果与分析
表4单一急性毒性实验前后小鼠体重变化
农药浓度设置（mg/L）实验前体重（g）实验h后体重（g）甲氰菊酯
百草枯
乐果
敌敌畏
草甘膦
表5 单一急性毒性实验中小鼠死亡情况
农药浓度设置（mg/L）死亡数量死亡概率（x%）甲氰菊酯
百草枯
乐果
敌敌畏
草甘膦
2.2五种农药对小鼠的联合急性毒性
2.2.1中毒症状
2.2.2实验结果与分析
表6 联合急性毒性实验中小鼠死亡情况
农药组合
浓度组合（mg/L）
0.2+0.8 0.4+0.6 0.5+0.5 0.6+0.4 0.8+0.2
甲氰菊酯+百草枯甲氰菊酯+乐果甲氰菊酯+敌敌畏甲氰菊酯+草甘膦百草枯+乐果百草枯+敌敌畏
百草枯+草甘膦
乐果+敌敌畏
乐果+草甘膦
敌敌畏+草甘膦
表7 联合急性毒性实验前小鼠体重
农药组合
小鼠体重（g）
浓度组合（mg/L）
0.2+0.8 0.4+0.6 0.5+0.5 0.6+0.4 0.8+0.2
甲氰菊酯+百草枯
甲氰菊酯+乐果
甲氰菊酯+敌敌畏
甲氰菊酯+草甘膦
百草枯+乐果
百草枯+敌敌畏
百草枯+草甘膦
乐果+敌敌畏
乐果+草甘膦
敌敌畏+草甘膦
表8 联合急性毒性实验后小鼠体重
农药组合
小鼠体重（g）
浓度组合（mg/L）
0.2+0.8 0.4+0.6 0.5+0.5 0.6+0.4 0.8+0.2
甲氰菊酯+百草枯
甲氰菊酯+乐果
甲氰菊酯+敌敌畏
甲氰菊酯+草甘膦
百草枯+乐果
百草枯+敌敌畏
百草枯+草甘膦
乐果+敌敌畏
乐果+草甘膦
敌敌畏+草甘膦
3.讨论
甲氰菊酯属于拟除虫菊酯类农药, 一般认为, 拟除虫菊酯类农药能延迟轴突神经细胞膜钠离子通道的关闭, 影响神经传导和突触传递, 从而导致一系列的中枢神经和末梢神经反应. 而
有机磷农药的毒害作用, 主要是抑制体内的胆碱酯酶, 使其丢失活性, 因而失去分解乙酰胆碱的作用, 最终产生一系列的毒害作用
草甘膦和百草枯属于除草剂, 草甘膦为广谱性内吸传导型除草剂, 主要抑制植物体内烯醇丙酮基莽草酸磷酸合成酶, 从而抑制莽草酸向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的转化, 使蛋白质的合成过程受到干扰. 百草枯进入细胞后, 会引发一系列氧化还原反应, 最终形成多种过氧化物, 过氧化物通过脂质过氧化反应直接造成细胞膜的损害, 还可以通过消耗体内还原物质( 如NADPH) 而干扰多种重要的生化反应, 间接造成损害
4.结论
5.参考文献。