最新乙肝病毒DNA的实验室检测-精选PPT文档
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HBeAg与HBV DNA有着良好的相关性
乙肝病毒的感染 免疫耐受期 免疫清除期 非活动或低（ 非）复制期 再活动期
HBV DNA ALT 肝组织学
HBV DNA贯穿感染者的终生，是评价病毒复制的金标准
正常 无明显异常, 或 轻度炎症纤维化 慢性HBV携带者 增高或者波动 中度或严重炎症、纤 维化快速进展
Taq
l
R
Q
变
性
Q
5’
R
3’
退 火
R Q
5’
Taq
3’
1. 链取代 2. 水
R Q
5’
Taq
R
5’ 3’
解
Taq
5’
5’ 3’
3. 聚
合
l Taq
5’
R
5’ 3’
4. 检测荧光
乙肝病毒的感染
乙肝病毒的感染
（一）
乙型肝炎病毒结构及特点
HBsAg：是HBV感染的主要标志 HBsAb：保护性抗体 HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内，
2. “携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学 指标不能 反应体内病毒复制水平与感染程度。 3. 血清学指标(－)不能排除HBV感染。
HBsAg(－) HBV-DNA(＋) HBeAg (－) HBV-DNA(＋)
乙肝病毒的感染
4. 也可能出现HBsAg(＋)，HBV-DNA(－)。
5.HBeAg阳性标本HBV DNA检出率90％左右
HBeAg阳性慢性乙型肝炎 乙型肝炎肝硬化
正常 无炎症或仅有轻 度炎症 非活动性HBsAg 携带者
增高或者波动 中度或严重炎 症、肝纤维化
HBeAg阴性 慢性乙型肝炎 乙型肝炎肝硬化
临床诊断
乙肝病毒的感染
慢性HBV感染分期及相关实验室检测指标
鲁凤民，庄辉，乙型肝炎实验室诊断研究进展 2009
HBV-DNA与临床
HBV DNA检测的临床意义
HBV DNA是HBV存在最直接的依据
HBV DNA是HBV复制的标志
HBV DNA是患者具有传染性的标志 HBV DNA对乙肝两对半起补充作用 HBV DNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标 HBV DNA可检测出隐匿性慢性乙型肝炎
HBV DNA检测的临床意义
提供直接证据缩短“窗口期”
PCR检测
HBV HCV HIV
“窗口期”
56 70 22
核酸检测缩短的“窗口期”的天数
6-15 41-60 10-15
有利于献血员窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断
HBV DNA检测的临床意义
调查表明并不是所有“大三阳”的病人都处于 HBV复制期，具有传染性；也不是所有“小三阳” 的病人HBV都无复制。因此，要准确知道HBV是否
模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的
核酸测定中最灵敏的方法。
PCR 反应过程
3’ 5’ 5’ 3’
Primers
d.NTPs
Taq 酶
反应组分
变
性
3’
5’
5’
3’
退
火
3’
Taq Taq
3’
5’
延 重
伸 复
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
3’
3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’
5’
循环2 4个拷贝
3’
3’
3’ 3’ 3’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’
5’
循环3
8个拷贝
3’ 3’
3’
3’
3’
荧光定量PCR原理
插入染料法 SYBR Green I
杂交探针法(最常用) TaqMan
TaqMan探针
3’ 5’ 5’ 3’
Primers
d.NTPs Taq酶
R
反应体系
Q
Probe
1、荧光定量PCR技术 2、乙肝病毒的感染 3、HBV-DNA与临床
荧光定量PCR技术
荧光定量PCR技术
• Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶链式反应，是 一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物 的DNA小片段和一种耐热酶（TaqDNA聚合酶）的作用，经
处于复制状态，最准确的方法还是通过检测HBV
DNA来决定。
HBV DNA检测的临床意义
HBsAg和HBeAg均阳性而HBV DNA阴性？
●干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。
●PCR所用引物相应的DNA序列发生突变，此引物与突变DNA不能配对结
合。 ●病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体而血中游离HBV DNA很少或缺乏。
过高温变性、低温退火、适温延伸三个步骤在3个小时内
反复循环25-30次，把特定的DNA片段扩增1000万倍。 • 每个PCR体系含4种主要成分：含有待扩增序列的DNA模板 、引物、TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核酸三磷酸（dNTP）
荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入 ，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过 对PCR终产物的分析，最终实现对未知的起始
乙肝的治疗 目前尚无一种能迅速、直接杀死清除乙肝病毒的
药物，最好的抗病毒药物疗效也仅能达到50％左右。
目前国际医学界公认的治疗慢性乙肝有确切疗效的抗 病毒药物主要有两大类： 干扰素：重组人α -1b干扰素、α - 2a、 α -2b干扰素等。
核苷类似物：拉米夫定、阿德福韦。
乙肝的治疗
主要包括
、免疫调节、抗炎保肝、抗纤维化等
一般不存在于血循环中
HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM
提示HBV处于复制状态
HBeAg：HBV复制及强感染性的指标 HBeAb：有一定的保护作用，预后良好
乙肝病毒的感染
（二） HBV-DNA与“两对半”
1. “两对半” ：机体的免疫反应状态；
FQ-PCR：检测的是HBV本身的遗传物质—DNA，是 病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。
对于HBV
DNA≥105的患者应进行抗病毒治疗
乙肝病毒的感染 免疫耐受期 免疫清除期 非活动或低（ 非）复制期 再活动期
HBV DNA ALT 肝组织学
HBV DNA贯穿感染者的终生，是评价病毒复制的金标准
正常 无明显异常, 或 轻度炎症纤维化 慢性HBV携带者 增高或者波动 中度或严重炎症、纤 维化快速进展
Taq
l
R
Q
变
性
Q
5’
R
3’
退 火
R Q
5’
Taq
3’
1. 链取代 2. 水
R Q
5’
Taq
R
5’ 3’
解
Taq
5’
5’ 3’
3. 聚
合
l Taq
5’
R
5’ 3’
4. 检测荧光
乙肝病毒的感染
乙肝病毒的感染
（一）
乙型肝炎病毒结构及特点
HBsAg：是HBV感染的主要标志 HBsAb：保护性抗体 HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内，
2. “携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学 指标不能 反应体内病毒复制水平与感染程度。 3. 血清学指标(－)不能排除HBV感染。
HBsAg(－) HBV-DNA(＋) HBeAg (－) HBV-DNA(＋)
乙肝病毒的感染
4. 也可能出现HBsAg(＋)，HBV-DNA(－)。
5.HBeAg阳性标本HBV DNA检出率90％左右
HBeAg阳性慢性乙型肝炎 乙型肝炎肝硬化
正常 无炎症或仅有轻 度炎症 非活动性HBsAg 携带者
增高或者波动 中度或严重炎 症、肝纤维化
HBeAg阴性 慢性乙型肝炎 乙型肝炎肝硬化
临床诊断
乙肝病毒的感染
慢性HBV感染分期及相关实验室检测指标
鲁凤民，庄辉，乙型肝炎实验室诊断研究进展 2009
HBV-DNA与临床
HBV DNA检测的临床意义
HBV DNA是HBV存在最直接的依据
HBV DNA是HBV复制的标志
HBV DNA是患者具有传染性的标志 HBV DNA对乙肝两对半起补充作用 HBV DNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标 HBV DNA可检测出隐匿性慢性乙型肝炎
HBV DNA检测的临床意义
提供直接证据缩短“窗口期”
PCR检测
HBV HCV HIV
“窗口期”
56 70 22
核酸检测缩短的“窗口期”的天数
6-15 41-60 10-15
有利于献血员窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断
HBV DNA检测的临床意义
调查表明并不是所有“大三阳”的病人都处于 HBV复制期，具有传染性；也不是所有“小三阳” 的病人HBV都无复制。因此，要准确知道HBV是否
模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的
核酸测定中最灵敏的方法。
PCR 反应过程
3’ 5’ 5’ 3’
Primers
d.NTPs
Taq 酶
反应组分
变
性
3’
5’
5’
3’
退
火
3’
Taq Taq
3’
5’
延 重
伸 复
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
3’
3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’
5’
循环2 4个拷贝
3’
3’
3’ 3’ 3’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’
5’
循环3
8个拷贝
3’ 3’
3’
3’
3’
荧光定量PCR原理
插入染料法 SYBR Green I
杂交探针法(最常用) TaqMan
TaqMan探针
3’ 5’ 5’ 3’
Primers
d.NTPs Taq酶
R
反应体系
Q
Probe
1、荧光定量PCR技术 2、乙肝病毒的感染 3、HBV-DNA与临床
荧光定量PCR技术
荧光定量PCR技术
• Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶链式反应，是 一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物 的DNA小片段和一种耐热酶（TaqDNA聚合酶）的作用，经
处于复制状态，最准确的方法还是通过检测HBV
DNA来决定。
HBV DNA检测的临床意义
HBsAg和HBeAg均阳性而HBV DNA阴性？
●干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。
●PCR所用引物相应的DNA序列发生突变，此引物与突变DNA不能配对结
合。 ●病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体而血中游离HBV DNA很少或缺乏。
过高温变性、低温退火、适温延伸三个步骤在3个小时内
反复循环25-30次，把特定的DNA片段扩增1000万倍。 • 每个PCR体系含4种主要成分：含有待扩增序列的DNA模板 、引物、TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核酸三磷酸（dNTP）
荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入 ，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过 对PCR终产物的分析，最终实现对未知的起始
乙肝的治疗 目前尚无一种能迅速、直接杀死清除乙肝病毒的
药物，最好的抗病毒药物疗效也仅能达到50％左右。
目前国际医学界公认的治疗慢性乙肝有确切疗效的抗 病毒药物主要有两大类： 干扰素：重组人α -1b干扰素、α - 2a、 α -2b干扰素等。
核苷类似物：拉米夫定、阿德福韦。
乙肝的治疗
主要包括
、免疫调节、抗炎保肝、抗纤维化等
一般不存在于血循环中
HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM
提示HBV处于复制状态
HBeAg：HBV复制及强感染性的指标 HBeAb：有一定的保护作用，预后良好
乙肝病毒的感染
（二） HBV-DNA与“两对半”
1. “两对半” ：机体的免疫反应状态；
FQ-PCR：检测的是HBV本身的遗传物质—DNA，是 病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。
对于HBV
DNA≥105的患者应进行抗病毒治疗