城市污水处理厂菌群结构

城市污水处理厂菌群结构

1 引言

强化生物除磷技术(Enhanced Biological Phosphorus Removal，EBPR)由于经济、高效的特点被广泛应用于各大城市污水处理厂.通过分子生物技术已经确认菌群β-Proteobacteria是EBPR活性污泥中的优势聚磷菌(PAOs)，将其命名为C and idatus Accumulibacter(Hesselmann et al., 1999;Crocetti et al., 2000).Accumulibacter 是目前污水生物处理领域广泛认可并且研究最多的一种PAOs(Zilles et al., 2002).ppk1基因可以编码合成poly-P的聚合磷酸盐激酶(PPK1)，其进化速度是16S rRNA 的5倍，是研究Accumulibacter各进化分支很好的基因标记物.McMahon等(2007)基于ppk1的系统发育分析将Type I划分为Type I和Type II，其中，Type I 进一步划分为IA、IB、IC、ID、IE 5个分支;Type II划分为IIA、IIB、IIC、IID、IIE、IIF、IIG 7个分支.

现有研究证实，Accumulibacter在污水厂存在很高的多样性，且主要分布于TypeⅡ，但水厂运行与各分支分布的相关性不清楚.宏基因组的研究也证实了分支多样性，这种多样性与污水处理厂的稳定性有一定关系(Albertsen et al., 2012).Mielczarek等(2013)对丹麦28个污水处理厂的研究发现，IA和IIC分支几乎出现在每个处理厂.Peterson等(2008)对美国几个污水处理厂及一些淡水湖泊、河口沉积物样品进行研究发现，IID存在于大部分的淡水、河口沉积物中及少部分污水处理厂中，有的湖泊淡水中仅发现IID 1个分支.由此可见，来自不同地域的污水处理厂，Accumulibacter进化枝的分布有明显差异.对实际污水处理系统中Accumulibacter的研究主要发现了IA、IIA、IIB、IIC、IID、IIF这6个分支，尤其是前5个分支的研究报道较多(He et al., 2007; Gebremariam et al., 2011; McMahon et al., 2007; Mielczarek et al., 2013)，IIF较少存在.而在本研究中IIF在几个污水处理系统中含量丰富，首次作为重点研究.其他6个分支(IB、IC、ID、IE、IIE、IIG)主要存在于自然界的淡水、湖泊、河流沉积物等地方，很少在实际污水处理厂中出现(McMahon et al., 2007).因此，着重关注IA、IIA、IIB、IIC、IID、IIF这6个分支而不是整体的12个分支.关于中国城市污水处理厂中Accumulibacter 6个分支的菌群结构及定量分析的研究尚未见报道.

近年来，许多研究者针对污水处理系统的运行参数和Accumulibacter各分支的组成分布的关系展开研究.关于电子受体的影响，Kim等(2013)认为所有杆状的Accumulibacter分支，包括分支IIC、 IA和IIF在具有足够的硝酸盐还原活性的污泥中可以成功的利用硝酸盐吸磷.Flowers 等(2009)发现反硝化吸磷时，IA、IIA分别以硝酸盐、亚硝酸盐作电子受体.Flowers等(2013)在最近的研究中发现，在动力学上Clade IIA活性与温度正相关，而IA与温度呈负相关.迄今为止，究竟有哪些因素主导了实际污水处理系统Accumulibacter的种群结构和动态变化仍然没有确切的研究结果.

本研究选择9个具有代表性的大型市政污水处理厂，分析不同运行状况的污水处理厂活性污泥中C and idatus Accumulibacter主要分支(I、IIA、IIB、IIC、IID、IIF)的丰度及分布特点，揭示污水处理厂C and idatus Accumulibacter进化枝水平菌群结构、丰度与工艺运行的相关性.

2 材料与方法

2.1 城市污水处理厂的活性污泥样品

实验所用的污泥样品分别采集于9个污水处理厂，其中有2个水厂各包含2个工艺，共11个工艺.每个工艺取1个污泥样品.其中，针对A2O+纤毛状生物膜(CNR)工艺取2个样品，分别位于加膜区和无膜区，是为了考察加膜对聚磷菌的菌群结构是否有影响，因此，共有12个样品.12个样品依次命名为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K和L.其中，B和C取自同一水厂，I和J 取自同一水厂，E和F取自A2O+纤毛状生物膜工艺的加膜区和无膜区.污水处理厂的运行参数及进出水指标见表 1.

表1 活性污泥样品对应的污水处理系统的运行参数及进出水指

2.2 DNA提取、PCR、克隆测序

用1×PBS(0.01 mol · L-1，pH=7.2~7.4)清洗污泥样品3次，14000×g离心2 min，去除上清液，置于-20 ℃保存.采用试剂盒(Fast DNA Spin kit for soil，MP，USA)对DNA进行提取.提取后的DNA 通过Nanodrop Spectrophotometer ND-1000(Thermo Fisher Scienti c，USA)测量核酸浓度及纯度.

特异性正向引物ppk1-254F(TCACCACCGACGGCAAGAC)和反向引物

ppk1-1376R(ACGATCATCAGCATCTTGGC)用来扩增总C and idatus Accumulibacter ppk1 基因，片段长度为1123 bp.PCR反应采用试剂盒(Promega GoTaq Green Master Mix，USA)，反应体系为25 μL：12.5 μL GoTaq Green Master Mix，1 μL(10 mmol · L-1)正向引物，1 μL(10 mmol · L-1)反向引物，0.5~2 μL DNA模板，剩余体系用纯水补齐.PCR程序包括：95 ℃预变

性10 min;95 ℃变性45 s，61 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环;最后在72 ℃反应5 min.

获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳(Agarose MS-6，TaKaRa，Japan)检测，为单一的目的条带，切胶，用Takara Agarose Gel DNA Puri cation Kit Ver. 2.0(Takara，Dalian，China)纯化.得到的DNA用试剂盒(Zero Background TA Topoisomerase Cloning Kit，Clonesmarter，USA)进行连接转化.连接体系为10 μL，包括1 μL pCloneEZ-TOPO载体，1 μL 10×Enhancer，0.5~8.0 μL DNA，一定量的纯水补齐体系.连接反应完成后将产物加入到感受态细胞DH5a(中美泰和，国产)中进行转化.每个样品随机挑出一定量的阳性克隆子进行测序，构建克隆文库.

2.3 克隆文库建立和系统发育分析

构建文库的序列通过Mothur 软件按照 97%相似度进行 OTU 划分，将每个 OTU 的代表序列与NCBI 数据库中下载的相似性最高最具代表性的菌株序列一起进行比对.采用 MEGA5.0 利用

邻接法(Neighbor Joining Method)进行系统发育分析，通过自举分析方法(Bootstrap)检验系统发育树各分支置信度，重复1000次.

2.4 实时定量PCR(QPCR)

采用特异性引物对C and idatus Accumulibacter主要的6个分支(I、IIA、IIB、IIC、IID、IIF)的ppk1片段和全菌的16S rRNA进行QPCR扩增(He et al., 2007; Ong et al., 2014).反应在Mx3005P实时定量PCR扩增仪(Agilent Technologies，American)上进行，采用TaKaRa SYBR Premix Ex Taq kit进行反应，体系为25 μL包括12.5 μL的SYBR缓冲液，正反向引物各1 μL(10 mmol · L-1)，0.5 μL ROX，DNA模板2 μL，剩余体系用纯水补齐.特异性引物序列及扩增程序见表 2.

表2 QPCR各分支的特异性引物序列及扩增程序