基因工程实验共25页文档
基因工程实验报告
基因工程实验报告一、实验目的：本实验旨在掌握基因工程的基本操作技能，了解DNA的提取、PCR扩增和基因克隆等基本实验过程，并通过实际操作检测转基因植物的存在。
二、实验原理：1.DNA提取：采用传统的CTAB法提取植物基因组DNA，目的是获得待测植物样品中的基因组DNA。
2.PCR扩增：选用合适的引物，利用PCR技术将待测基因扩增出来。
PCR反应中需要设置阳性对照、阴性对照和试验样品，以确定PCR扩增结果的可靠性。
3.基因克隆：将PCR扩增得到的目标基因与质粒载体进行连接，再将重组质粒导入大肠杆菌进行转化培养，最后通过酶切和测序等方法验证目标基因的克隆成功与否。
三、实验步骤：1.DNA提取：将待测植物样品加入CTAB提取缓冲液中，酶解并脱脂植物细胞，通过乙酰酚/氯仿法提取总DNA。
2. PCR扩增：设计合适的引物，进行PCR反应。
反应条件通常为94℃预变性5min，然后循环20-35次，每次循环包括94℃变性30s、56-68℃退火30s、72℃延伸1-2min，最后72℃延伸10min。
3.基因克隆：将PCR扩增得到的目标基因进行酶切，并与质粒载体进行连接，然后转化大肠杆菌进行培养。
通过PCR重放大和酶切验证目标基因是否成功克隆。
4.验证目标基因：通过测序等方法对目标基因进行验证，判断基因克隆是否成功。
四、实验结果与分析：1.DNA提取：从待测植物样品中成功提取到总DNA，并进行酶切分析，可见DNA带状条带。
2.PCR扩增：通过PCR扩增，得到了目标基因的特异性条带，并且也验证了阳性对照和阴性对照的准确性。
3.基因克隆：通过酶切和重放大等方法验证了目标基因的成功克隆。
4.验证目标基因：通过测序结果，确认目标基因与已知序列一致，说明基因克隆成功。
五、实验结论：通过本实验，我们掌握了基因工程的基本操作技能，成功进行了DNA提取、PCR扩增和基因克隆等实验过程，并通过测序等方法验证了目标基因的克隆成功。
基因工程实验报告
基因工程实验报告摘要：提取小麦的总的RNA通过RT—PCR扩增出GAPDH截短体基因ｃDNA，ＰＣＲ扩增ｃDNA获得大量目的基因，对目的基因和表达载体p ＧＥＸ４Ｔ－１进行双酶切，通过电泳分离条带胶回收酶切的目的基因和载体，然后载体和目的基因连接构建表达载体，重组载体转入大肠杆菌top10中大量复制目的基因；提取质粒，转入大肠杆菌bl21，通过ＩＰＴＧ诱导目的基因的表达；通过ＳＤＳ染色和Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交检验目的蛋白是否表达。
实验流程：小麦幼苗总ＲＮＡ提取ＲＴ＿ＰＣＲ扩增目的基因表达载体构建表达菌株转化（ｔｏｐ１０）从ｔｏｐ１０转入ＢＬ２１诱导表达Ｗｅｓｅｒｎ杂交一．目的基因的获得１．小麦总ｒｎａ的提取（Ｔｒｉｚｏｌ法）１在研钵中加入液氮，再将小麦剪成小片段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的钥匙取１００ｕｌ粉末于已加入１ｍｌ的ｔｒｉｚｏｌ的ＥＰ管中，充分混匀。
２室温放置５ｍｉｎ，然后加入２ｏｏｕｌ的氯仿，剧烈震荡。
３１２０００ｒｐｍ离心１０分钟，取上清于新的ＥＰ管，加入500ul异丙醇，温和颠倒，室温放置10分钟，12000rpm离心10分钟。
4小心弃上清，加入75%乙醇，混匀，4度12000rpm离心5分钟。
5重复46弃上清，室温干燥5-10分钟，用30uldepc溶解rna。
2.rna电泳检测是否提取出rna（10ulrna+1ul buffer）图中出现明显的亮的条带的即表示提取出rna，其中我们提取的rna比较少条带不明显，可能是操作过程中被污染，所以在提取rna是一定要注意防止rna降解，因为空气中随处都是rna酶，所以要带上手套，快速操作，尽量不要暴露在空气中，使用处理过的试管，器材。
3.RT-PCR扩增目的基因cDNA3.1 rna反转录Total RNA 6ulOligo dt primer 1ulH2o 5ul65℃5min,补加下列试剂5×reaction buffer 4ulRibolock rnase inhibitor 1ul10mM dntp mix 2ulRevertaid m-mulv reverse transcripase 1ul42℃ 60min70℃ 5min3.2 PCR扩增目的基因（表达引物扩增 25ul)2×pcr mix 12.5ul 95℃1mincDNA 1ul 95℃10s引物GAPDH1-1 1ul 58℃ 20s 35cycle引物GAPDH1-2 1ul 72℃45sH2O 9.5ul 72℃10min通过图片的条带可以看出pcr扩增的产物；通过RT-PCR获得的目的片段，为连续表达的基因片段，去除了真核基因中的内含子序列，通过重组质粒载体的构建可以直接在宿主大肠杆菌中克隆和表达。
基因工程实验报告
基因工程实验报告引言基因工程是现代生物技术的一个重要分支，通过对生物体基因的修改和重组，可以创造出具有特定功能的生物体。
本次实验旨在探究基因工程在农业、医学等领域的应用，以及可能带来的潜在风险和争议。
实验方法1. 筛选目标基因：首先，我们在实验中选择了对叶绿体功能有重要影响的一个基因作为目标基因。
2. 基因克隆：通过PCR技术，将目标基因从细菌DNA中放大，然后将其插入载体DNA中。
3. 转化目标生物体：将重组的载体DNA转入植物叶片细胞中，借助几丁质体、热激冲击等方法促使基因转化成功。
4. 筛选阳性转化率：通过筛选培养基中的抗性选择制剂，筛选出转化成功的阳性细胞。
5. 验证目标基因的表达：通过PCR扩增和基因芯片技术验证目标基因在转化植物中的表达情况。
实验结果1. 实验结果显示：我们成功将目标基因插入到植物叶片细胞的染色体中，并且获得了一定比率的阳性转化植株。
2. 鉴定转化植株：对转化植株进行证实鉴定，确保目标基因已经整合到植株基因组中，且稳定表达。
3. 表达验证：通过PCR扩增和基因芯片分析，确定目标基因在转化植物中得到了表达，并且表达量较高。
4. 性状鉴定：对转化植物进行生长发育、形态结构、生理生化等方面的综合性状鉴定，结果显示转化植物与野生型无显著差异。
讨论基因工程技术的应用：本次实验展示了基因工程技术在农业生产中的应用前景，通过将具有耐逆性、抗病虫害等功能基因导入植物，可以提高植物的产量和抗逆性。
潜在风险和争议：但是，基因工程也伴随着一系列争议和风险，如转基因植物可能对环境造成影响，转基因食品可能对人体健康产生潜在影响，因此需要严格的监管和评估。
结论通过本次实验，我们成功地验证了基因工程技术的可行性，展示了其在农业和生命科学领域的广阔应用前景。
然而，我们也要看到基因工程技术所带来的潜在风险和争议，需要谨慎评估和监管。
基因工程是一把双刃剑，只有正确使用才能实现其最大的利益。
愿基因工程技术为人类带来更多福祉。
基因工程实验_biochemlab
实验二
一、实验目的
基因组总ＤＮＡ提取
掌握酚氯仿法提取ＤＮＡ的原理和操作。
二、实验原理
生物的大部分或几乎全部ＤＮＡ都集中在细胞核或类 核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对 DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此 需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯 仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经 苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相 与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧 密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少 量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的 RNase去除RNA污染。
• 生物化学资料网
三、实验用具及试剂
• 水浴锅，培养箱，枪头，冰盒，超净台，微量加样器， 制冰机，牙签
• DH5α 感受态细胞，连接产物，LB Amp-液体培养基， LB Amp+液体培养基，LB Amp+ 培养基平板
四、实验步骤
1.5ul连接液加100ul感受态细胞（-70℃取出），置冰上，加后轻轻旋动 2.冰上静置30min 3.42℃水浴90s热休克，冰上3min 4.加10ul LB （Amp-）至菌液，混匀（颠倒） 5.37℃烘箱30min 6.37℃，摇床 30min 180rpm 7.涂平板 100ul/板， 37℃培养12~16h
8.
9.
加入700ul RinseB 12000rpm 30s弃滤液
同8
பைடு நூலகம்
10. 将spin coloumn安置于新的1.5ml EP管中 在spin coloumn膜中央加25ulElution Buffer 放入烘箱1min 12000rpm 1min 保存1.5ml EP管1%胶检测 11. 链接反应（冰上操作）
基因工程实验
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五、实验注意事项
1 用微波煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的 1/3，否则易溢出
2 煮好的胶应冷却至50℃左右时再倒，以免制胶板变 形，并减少漏胶的机会
加入等体积的氯仿， 12000rpm，离心5分钟，取上清
加入1/10体积的3MNaAc，加2倍体积的预冷的无水乙 醇，混匀。
置于-70℃冰箱约10min以上或者-20℃冰箱30min至 数个小时
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12000rpm离心15分钟（4℃），倒掉酒精，离心几秒，
用移液枪尽可能除去酒精
用0.5ml70 %酒精洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉 酒精
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当加入中性缓冲液调和时，变性的质粒 DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA 不能复性，它们之间交联形成不溶性网状 结构，并与细胞碎片、蛋白质、SDS等结 合沉淀下来。
通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA 及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA 及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂 的RNA可用RNaseA消除。再用酚／氯仿 处理，可除残留蛋白质
真核生物的基因组DNA为双螺旋结构，在在碱性溶 液中，双链DNA氢键断裂，双螺旋结构遭破坏而发生 变形，而基因组DNA分子量相对较大，在碱性PH条 件下其线性的大分子量基因组DNA不能复性，而形成 缠连的网状结构与蛋白质等共沉淀。
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2 异丙醇和无水乙醇对核酸沉淀的优缺点 答：异丙醇和乙醇都能与与任意比例的水相混合。异 丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，乙醇可以去 盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。 异丙醇沉淀量多，但杂质也多，增加了后续实 验风险。其优点为：所需容积小且速度快，适用于 浓度低，而体积大的DNA样品的沉淀。一般不需要 在低温条件下长时间放置。缺点为：易使盐类（如 NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙 醇难以挥发除去 乙醇是沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐 类沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处， 不影响以后的实验。在适当的盐浓度下，2倍样品 容积的95％乙醇可有效沉淀DNA。其缺点是总体积 较大。需在-20放置很长时间，30分钟-1小时，同 时DNA微溶于乙醇，使用乙醇沉淀会使部分DNA溶 解损失
基因工程实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握基因工程的基本原理和操作技术；2. 熟悉基因克隆、表达、检测等实验操作；3. 培养实验操作技能和科学思维能力。
二、实验原理基因工程是利用分子生物学和生物化学原理，通过人工手段对生物的遗传物质进行改造，以达到改变生物特性、提高生物产量、生产新生物制品等目的的技术。
实验中主要涉及以下原理：1. 限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）：能够识别特定的核苷酸序列，并在该序列的特定位置切割DNA链；2. DNA连接酶（DNA ligase）：能够将两个DNA片段连接起来；3. 转化：将外源DNA片段导入受体细胞；4. 转录和翻译：将目的基因转录成mRNA，再翻译成蛋白质。
三、实验材料1. 质粒载体：pET-28a、pUC19等；2. 限制性核酸内切酶：EcoRI、HindIII等；3. DNA连接酶：T4 DNA连接酶；4. 转化试剂：钙离子、转染试剂等；5. 实验试剂：Tris-HCl缓冲液、NaCl、KCl、MgCl2、DNA模板、引物、dNTPs、PCR试剂等；6. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、超净工作台等。
四、实验步骤1. 设计实验方案：根据实验目的，设计实验步骤，包括目的基因的克隆、表达、检测等。
2. DNA提取：采用CTAB法提取质粒DNA。
3. 限制性核酸内切酶酶切：将质粒DNA和目的基因片段分别进行EcoRI、HindIII酶切，酶切产物进行电泳鉴定。
4. DNA连接：将酶切后的质粒DNA和目的基因片段进行连接，连接产物进行电泳鉴定。
5. 转化：将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，筛选阳性克隆。
6. 阳性克隆的鉴定：通过PCR、测序等方法对阳性克隆进行鉴定。
7. 重组质粒的提取：提取重组质粒，进行电泳鉴定。
8. 重组质粒的表达：将重组质粒转化到大肠杆菌表达系统中，进行诱导表达。
9. 目的蛋白的纯化：采用离子交换层析、亲和层析等方法对目的蛋白进行纯化。
基因工程实验设计
基因工程实验设计实验目的：研究基因A对植物生长和抗逆能力的影响。
实验设计：1. 选取模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)作为实验材料。
这是因为拟南芥具有短的生命周期和相对较小的基因组，易于操作和研究，更适合用于基因工程实验。
2.首先，从拟南芥中提取基因A的DNA序列，并利用PCR技术扩增得到基因A的片段。
此外，还需要设计引物，引导基因A的扩增。
同时，设计一个空载体作为对照组。
3.将扩增得到的基因A片段与基因工程载体连接，形成重组载体。
将重组载体转入大肠杆菌中，利用大肠杆菌的复制和表达机制，大量复制和表达基因A。
4.鉴定大肠杆菌中的重组载体，通过PCR、酶切和测序等方法确认基因A已经成功插入载体。
5.利用凝胶电泳和转形方法将基因A载体转入拟南芥的叶片细胞中。
将转化得到的拟南芥幼苗移栽到含有基本培养基和适当浓度抗生素的培养基中，以筛选带有基因A的转基因植株。
6.对转基因植株进行PCR检测，确认基因A已经整合到拟南芥的基因组中。
7.比较转基因植株和野生型植株的生长情况，包括根长、茎长和叶片数量等方面。
利用统计学方法对结果进行分析。
8.在正常条件下进行水分、盐分和低温等逆境胁迫试验，比较转基因植株和野生型植株的抗逆能力。
利用统计学方法对结果进行分析。
9.可选的可以在抗逆胁迫下收集转基因植株和野生型植株的RNA样品，利用实时荧光定量PCR（qPCR）技术检测基因A的表达水平，并进一步分析基因A在抗逆过程中的作用。
10.结果分析：根据实验数据和统计学分析，比较转基因植株和野生型植株的生长情况和抗逆能力，评估基因A在植物生长和抗逆过程中的作用。
最后，通过以上实验设计，可以得到对基因A在植物生长和抗逆能力中的作用有一定了解的结果。
实验结果可以为进一步研究基因A功能、植物育种等领域提供理论和实验依据。
同时，也有助于理解基因工程技术在农业、生物医学和环境等方面的应用。
基因工程试验(综合).
实验一大肠杆菌基因组DNA提取与检测、目的要求1．学习并掌握用试剂盒提取细菌基因组DNA；2. 学习使用分光光度计检测基因组DNA浓度二、基本原理本实验利用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0 试剂盒提取大肠杆菌基因组DNA。
该试剂盒采用了溶菌酶裂解细胞，由细胞裂解液裂解细胞释放基因组DNA，然后使用特殊的相分离法除去蛋白质、多糖、脂质等杂质，再结合DNA制备膜技术纯化细菌基因组DNA。
三、实验材料1. 实验菌株：大肠杆菌TG12. 实验试剂：LB液体培养基TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0 试剂盒无水乙醇3. 实验仪器：移液枪，低温离心机，水浴锅，eppedorf t,振荡器四、操作步骤1. 大肠杆菌的培养：从平板培养基上挑选单菌落接种至1〜4 ml 的液体培养基中过夜培养。
2. 取1〜4 ml的过夜培养菌液，10,000 rpm 离心2分钟，弃上清。
3. 用150 pl的SP Buffer （含RNase A1 ）充分悬浮细菌沉淀。
注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使菌体充分悬浮。
4. 加入20 p的Lysozyme溶液，均匀混合后室温静置5分钟。
5. 加入30 p的EDTA Buffer ，均匀混合后室温静置5分钟。
6. 加入200 p的Solution A，剧烈振荡后65 C保温10分钟。
注）① 若Solution Ab现沉淀，请于65C加热溶解，待恢复至室温后使用。
② 65E保温1（分钟后，溶液将由乳浊液变成透明液。
如果此时溶液没有变成透明，说明细菌没有裂解，基因组DNA各不能释放。
7.加入400 M的Solution B ，剧烈振荡15秒。
注）若Solution出现沉淀，请于65C加热溶解，待恢复至室温后使用。
基因工程实验方案实验
基因工程实验方案实验一、实验目的本实验旨在利用基因工程技术对大肠杆菌进行基因改造，使其能够表达外源蛋白。
具体来说，我们将利用质粒载体将感兴趣的外源基因导入大肠杆菌，并通过PCR、酶切、连接、转染等技术，构建表达载体，使其能够在大肠杆菌中表达外源蛋白。
通过本实验，我们希望能够探究基因工程技术在微生物工程中的应用，并为后续的基因改造研究提供实验基础。
二、实验材料1. 大肠杆菌菌种2. 质粒载体3. PCR试剂盒4. 酶切试剂盒5. 连接试剂盒6. DNA电泳仪7. 热循环仪8. 紫外可见分光光度计9. 转染试剂三、实验步骤1. 质粒载体提取首先，从实验室常用菌株中提取质粒载体。
我们选择一株质粒带有多克隆位点的大肠杆菌附着菌株，通过菌株复苏、培养、质粒提取等步骤，从中提取目标质粒载体。
2. PCR扩增外源基因根据我们感兴趣的外源基因序列，设计相应的引物，利用PCR技术扩增目标基因。
在PCR反应过程中，我们需要控制PCR反应的条件和时间，确保外源基因能够被充分扩增。
3. 酶切及连接将目标基因和质粒载体分别进行酶切处理，然后进行连接。
酶切及连接过程中需要保证实验操作无菌、操作准确，以确保目标基因能够成功插入质粒载体中。
4. 构建表达载体通过连接实验，成功将外源基因插入质粒载体中，构建表达载体。
之后，通过DNA电泳、酶切鉴定等技术手段，对构建的表达载体进行验证和鉴定。
5. 大肠杆菌转染将构建的表达载体转染至大肠杆菌，使其内源化。
转染过程中需要严格控制转染条件，保证外源基因能够成功表达。
6. 蛋白表达检测经过转染后，我们将进行蛋白表达检测。
通过蛋白印迹、Western blot、质谱等技术手段，对外源蛋白的表达情况进行检测和分析。
7. 结果分析最后，对实验结果进行分析，包括目标基因的扩增情况、质粒构建情况、大肠杆菌转染情况以及蛋白表达情况等，总结实验结果。
四、实验注意事项1. 实验操作需严格遵守无菌操作规范，确保操作台面、设备、试剂均处于无菌状态。
基因工程实验报告 4 1 最终版
《基因工程》实验报告一、实验目的1.学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。
2.学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法，检测质粒DNA的浓度与分子量。
3.了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。
4.学习利用限制性内切酶切割DNA的方法，并通过电泳检测酶切的效果。
5.学习DNA重组技术中的核心步骤，DNA片段之间的体外连接方法。
6.学习制备感受态细胞并将体外重组DNA引入受体细胞的技术。
7.掌握利用蓝白斑筛选出转化子的方法。
二、实验原理（1）质粒DNA的小量制备在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液调时，变性质粒DNA又恢复到原来的构型；而线性的大分子量的细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物。
通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA 及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。
混杂的RNA可用RNA酶(RNaseA)消除。
再用酚/氯仿处理，可去除残留蛋白质。
（2）琼脂糖凝胶电泳与凝胶中DNA的检测琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。
DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。
不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。
SYBR GoLd 是一种极敏感的染料。
其可与DNA分子形成SYBR GoLd -DNA 复合物，在紫外光照射下发射荧光，且荧光强度与DNA的含量成正比。
用肉眼观察，可检测到20pg以上的DNA。
基因工程实验报告资料
实验报告实验项目名称：基因工程综合实验所属课程名称：基因工程原理班级：12生物工程3班学号：201230620312姓名：李杰锋指导老师：徐学锋目录0.摘要 (1)1.前言 (1)2.实验材料和仪器 (2)2.1 实验材料 (2)2.2 实验仪器 (2)3.实验试剂 (2)3.1DNA提取所需试剂 (2)3.2 PCR实验所需试剂 (2)3.3 双酶切实验所需试剂 (2)4.实验步骤 (3)4.1 质粒DNA提取 (3)4.2 聚合酶链式反应（PCR） (3)4.3 质粒DNA的双酶切分析 (4)4.4 琼脂糖凝胶制备 (4)5.实验结果与分析 (5)5.1质粒DNA提取所得凝胶电泳结果 (5)5.2 PCR扩增实验结果 (5)5.3质粒DNA的双酶切分析结果 (6)摘要：本实验包括质粒DNA的提取、DNA的凝胶电泳、质粒DNA中靶基因的酶切分析及质粒DNA中重组进的靶DNA序列的PCR扩增。
通过本综合实验，进一步理解质粒DNA的提取原理、凝胶电泳中DNA分离的机理、限制性内切酶的工作原理及PCR是如何实现DNA扩增的，也掌握了DNA的提取技术、凝胶电泳技术、DNA酶切分析技术及靶基因的体外快速扩增技术，进而了解实验中出现的现象并学会分析与解决实验中出现的有关问题。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA或RNA的地方。
关键词：凝胶电泳限制线内切酶DNA质粒1 前言本次实验对象为含有重组了1kb DNA片段的PET32.a表达质粒。
该表达质粒中长度约6kb。
首先采用离心破碎法破碎细胞，再使用碱裂解法提取质粒DNA。
基因工程实验报告
基因工程实验技术实验报告百度ID：龍吟EX炫1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 实验对象实验室提供的小鼠；含pGEX 4T-1质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)，大肠杆菌Top10。
1.1.2 试剂LB液体培养基，LB固体培养基，0.1% DEPC水，无水乙醇，氯仿，异丙醇，Trizol，Olig(dT)18，反转录缓冲液，dNTP，M-MULV反转录酶，RNA抑制剂，2×PCR Mix，Olig(dT)18引物，表达引物EB3、EB4，5×TBE缓冲液，10×Loading buffer，核酸染料Super Gel Red，琼脂糖，Bam H I，Sal I，Bam H I buffer，10×ligation缓冲液，T4 DNA连接酶，ddH2O，氨苄青霉素，IPTG，30%丙烯酰胺，1.5mol/L和0.5mol/L Tris-HCl，10% SDS，10%过硫酸铵溶液，染色液，脱色液，TEMED，Tween-20，DAB工作液、显色液，TIANGEN胶回收试剂盒，TIANGEN质粒提取试剂盒。
1.1.3 仪器高速冷冻离心机，核酸电泳设备，PCR扩增仪，恒温水浴锅，凝胶成像系统，蓝光切胶仪，无菌操作台，恒温摇床，蛋白电泳设备，电转移设备，移液枪1.2 方法1.2.1 实验材料的处理对小鼠进行处死，解剖并取出肝脏组织，备用。
1.2.2 Trizol法提取总RNA将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，取50～100mg加入已盛有1ml Trizol离心管中，轻轻混合以排除气体，再充分混匀；室温放置5min，然后加入200μl氯仿，盖紧离心管，并剧烈摇荡15秒钟；12,000rpm离心10min，取上层水相到新的离心管中，加入500μl异丙醇，温和颠倒混匀。
室温放置10min后12,000rpm离心10min；小心地弃去上清液，加入1ml DEPC水配制的75%乙醇，颠倒混匀，12,000rpm离心5min，再重复一次上述操作；弃去上清液，室温或真空干燥3～5min，后用30μl DEPC水溶解RNA。
基因工程实验
实验一从植物中提取DNA【实验目的】1、掌握提取DNA的技术及原理2、学习DNA提取的方法【实验原理】首先研磨粉碎的植物组织在LP缓冲液裂解完全，基因组DNA被释放出来。
在加入DA缓冲液沉淀后，去除大部分杂质。
然后，由于加入的P Binding缓冲液中适当的盐分及pH值得作用下，DNA被特异吸附于Biospin膜上。
通过洗涤，可将蛋白质等残留的杂质去除。
最后使用Elution Buffer将DNA从膜上洗脱下来，从而获得基因组DNA。
【实验材料】自己采取某种植物的叶子1. 实验试剂植物DNA提取试剂盒【实验操作】1.剪取约0.2-0.5g叶片于冷研钵后，迅速倒入液氮用玻棒研磨成为粉末，分装到1.5ml的离心管中。
2.加入450μl LP缓冲液，并混合均匀。
3.于65℃环境下温浴15分钟，温浴中可间或震荡离心管2-3次，然后移出。
4.加入150μlDA缓冲液，混合均匀后于冰浴中放置5分钟。
5.将混合物全部转移至Shredder spin colum，于离心机中3分钟。
6. 将滤液转移至一个新的1.5ml离心管。
7. 加750μl P Binding缓冲液，并混合均匀。
8. 将混合液转移至Spin column。
于离心机离心1分钟，弃去接液管中的液体。
9. 向Spin column中加入500μl的G Binding Buffer。
离心30秒，弃去接液管中液体。
10. 向Spin column中加入600μl的Wash Buffer。
离心30秒，弃去接液管中液体。
11. 重复步骤10一次。
12. 再次将Spin column离心1分钟，并将Spin column 转移至一个新的1.5ml离心管中。
13. 向Spin column中加入100μl的 Elution Buffer，并于室温温育1分钟。
离心1分钟，取离心管中的液体含有DNA。
实验二 PCR扩增 DNA【实验目的】1、掌握 PCR扩增 DNA的技术及原理2、学习 PCR扩增仪的使用【实验原理】聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外 DNA扩增技术，1985年由 Mullis 等人创立。
（整理）基因工程试验.
（整理）基因⼯程试验.基因⼯程实验流程实验⼀丹参总DNA的提取实验⽬的：掌握从植物或动物的组织（细胞）中抽提DNA的⽅法。
实验材料：丹参叶⽚实验器材：台式离⼼机，恒温⽔浴锅，电泳仪，研钵和杵，离⼼管，微量移液器，枪头实验步骤：第⼀次使⽤前请先在漂洗液WB和结合液PQ中加⼊指定量的⽆⽔⼄醇，充分混匀，加⼊后请及时在⽅框打钩标记已加⼊⼄醇，以免多次加⼊!取所需适量裂解液PL放置在65℃预热，使⽤前加⼊β-巯基⼄醇到终浓度2%。
1.取适量植物组织（新鲜组织100mg 或⼲重组织30 mg）在研钵中加⼊液氮充分碾磨成细粉。
2.转移细粉到⼀个1.5ml离⼼管，不要解冻，加600µl 65℃预热的裂解液PL (确认已加⼊β-巯基⼄醇⾄2%)，剧烈涡旋振荡混匀，⽤⼤⼝径枪头轻柔吹打帮助裂解。
如果组织裂解困难，可根据需要加⼀个轻柔匀浆10秒的步骤帮助裂解。
3.65℃⽔浴20-60分钟，在⽔浴过程中颠倒离⼼管以混合样品数次。
可选如果组织⼲燥或者产量低，可以适当延长⽔浴时间。
如RNA残留多，可在⽔浴前加⼊6µlRNA酶（20mg/ml）。
4.加⼊700µl氯仿/异戊醇（体积⽐24：1混合），颠倒充分混匀⼏分钟（或者涡旋混匀），13,000rpm 离⼼5分钟。
若提取的植物组织富含多糖多酚，可以在第4步前⽤等体积酚/氯仿（1：1）抽提⼀遍。
5.⼩⼼吸取上清到⼀个新的1.5ml离⼼管，注意不要吸到界⾯物质。
如上清⽐较浑浊，则需要重复步骤4⼀遍，直到得到透亮上清。
6.较精确估算上清量，加⼊1.5倍体积结合液PQ （请先检查是否已加⼊⽆⽔⼄醇!）后⽴刻涡旋，充分混匀。
此时可能出现沉淀，但不影响实验结果。
7.将上⼀步所得混合物（包括可能出现的沉淀）加⼊⼀个吸附柱AC中，（吸附柱放- 5 - ⼊收集管中）13,000rpm离⼼30秒，倒掉收集管中的废液（先加700µl离⼼，弃废液，再加⼊剩余的溶液，再次离⼼）。
基因工程实验报告模板
《基因工程实验》报告姓名学号分院(系)生物与化学工程分院专业班级生物技术08级1班指导教师王进波一、实验项目名称：质粒载体DNA的提取二、实验时间：2011年9月日三、实验目的：用小四号字，汉字用宋体，英文字母及阿拉伯数字用Times New Roman字体，行间距1.5倍；段前0.5行，段后0行。
（注：格式要求在正式报告中删除）四、实验步骤：用小四号字，汉字用宋体，英文字母及阿拉伯数字用Times New Roman字体，行间距1.5倍；段前0.5行，段后0行。
（注：格式要求在正式报告中删除）五、实验结果与讨论：用小四号字，汉字用宋体，英文字母及阿拉伯数字用Times New Roman字体，行间距1.5倍；段前0.5行，段后0行。
本部分内容应当是报告的重点，各位同学在写报告时，一定要将结果写清楚，无论成功还是失败，都必须展开讨论；同组的同学实验结果可以相同，但讨论是绝不可以雷同的！！！（注：格式要求在正式报告中删除）提醒各位同学（正式报告中应当删除该部分提醒内容）：（1）报告必须严格按照格式要求，打印完成。
（2）请各位同学于9月15日前完成报告，由课代表或班长将报告交到NE206办公室。
（3）严禁抄袭，每个人的讨论部分是绝不允许雷同的！一、实验项目名称：目的基因的PCR扩增二、实验时间：2011年9月日三、实验目的：用小四号字，汉字用宋体，英文字母及阿拉伯数字用Times New Roman字体，行间距1.5倍；段前0.5行，段后0行。
（注：格式要求在正式报告中删除）四、实验步骤：用小四号字，汉字用宋体，英文字母及阿拉伯数字用Times New Roman字体，行间距1.5倍；段前0.5行，段后0行。
（注：格式要求在正式报告中删除）五、实验结果与讨论：用小四号字，汉字用宋体，英文字母及阿拉伯数字用Times New Roman字体，行间距1.5倍；段前0.5行，段后0行。
本部分内容应当是报告的重点，各位同学在写报告时，一定要将结果写清楚，无论成功还是失败，都必须展开讨论；同组的同学实验结果可以相同，但讨论是绝不可以雷同的！！！（注：格式要求在正式报告中删除）提醒各位同学（正式报告中应当删除该部分提醒内容）：（1）报告必须严格按照格式要求，打印完成。
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影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的因素： DNA的分子大小； 琼脂糖浓度； DNA构象； 电场强度； 碱基组成与温度； 嵌入染料的存在； 电泳缓冲液的组成。
三、实验材料与设备：
1、用品与与仪器： 超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、恒温振荡器、
Ⅰ、Ⅱ、III型三大类，Ⅰ类和III类限制性内切酶，在同一蛋 白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。 Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，但却随机地切割回
转到被结合处的DNA。Ⅲ类限Ⅲ限制酶在基因工程中基本 不用，II类酶在分子克隆中使用广泛，其基本特点如下：
二、实验原理
1、感受态细胞制备:所谓感受态是指受体细胞处于容易吸 收外源DNA的一种生理状态，可以通过物理与化学方法诱导 形成，也可以自然形成，在基因工程技术中通常采用诱导的 方法。用于转化的受体菌细胞一般是限制-修饰系统 （Restriction-Modification）缺陷的变异株，以防止对导入的 外源DNA的切割，用符号R-M-表示。其基本原理是：细菌处 于0℃的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性 发生变化，转化混合物中的质粒DNA形成抗DNase的羟基-钙 磷酸复合物黏附于细胞表面，经过42℃短时间的热激处理，
(1)、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如EcoR I识 别与切割序列为5`····GAATTC····3`
3`····CTTAAG····5` (2) 、识别的核苷酸数目大多数为4～6个，少数识别8～13 个； (3)、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大多数酶 产生的是具有凸出的粘性末端：
小与孔隙度的固体基质 (密度与琼脂糖浓度相关)；而生理条件下，核酸分子 的糖-磷酸骨架中磷酸基团呈离子化状态，因此将核酸分子置于电场中时， 它们会向正极迁移，由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性，相同数量的双链 DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构 象。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子，具有较紧密的构 型，所以其电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线
2、试剂： LB培养基:蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L， NaCl
10g/L，琼脂粉 15g/L（固体培养基），用10 mol/L的NaOH 调节pH为7.0，高压灭菌；
氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg／mL； 含有抗菌素的LB平板培养基：将配置好的LB固体培养基 高压灭菌后，冷却到60度左右，加入氨苄青霉素（终浓度为 50µg／mL浓度50-100µg／mL）；
促进细胞吸收DNA复合物，在丰富的培养基上生长数小时后，
球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化 子。
2、碱裂解法小量制备质粒DNA：碱裂解法是基于线性大 分子染色体DNA与小分子环形质粒DNA的变性、复性的差异 达到分离目的的，在pH12.0～12.6的碱性环境中，线型染色体 DNA和环型质粒DNA氢键会发生断裂，双链解开而变性，但 质粒DNA由于其闭合环型结构，氢键仅发生部分断裂，而且 其互补链不完全分离；当将pH值调节到中性并在高盐浓度下， 已分开的染色体DNA互补链不能复性而交联形成不溶的网状 结构，通过离心，大部分染色体DNA、不稳定的大分子RNA 和蛋白
溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用)； 溶液III: 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml 冰醋酸，28.5mL H2O)； RNase A： 10mg/ml； TE缓冲液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA，pH 8.0；
一、 实验目的和要求
1、通过本实验了解和掌握氯化钙法制备大肠杆菌感 受态细胞和质粒DNA转化受体菌细胞的原理与技术； 2、了解质粒DNA的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌细 胞中分离、提取质粒DNA的方法； 3、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳 的操作方法；
通过本实验了解大肠杆菌感受态细胞制备、DNA 转化、限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作 用。
质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合 环状的质粒DNA在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型， 呈可溶性状态保存与溶液中，离心后上清中便含有所需要的 质粒DNA。
3、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一类能 识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪 切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。根据限制 酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为
(4)、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列，甚至切割的位点也相同，称 为同裂酶或异源同工酶，如Hpa II与Msp I；有的识别位点不同，但对DNA切割后可 产生相同的粘性末端，称为同尾酶，如BamH I与Bgl II。
影响核酸限制性内切酶活性的因素： DNA的纯度； DNA的甲基化程度； 酶切消化反应的温度； DNA的分子结构； 溶液中离子浓度及种类； 缓冲液的 pH值。 4、琼脂糖凝胶电泳: 琼脂糖溶化再凝固后能形成带具有一定形状、大
移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、电泳仪、 电泳槽、紫外透射仪，凝胶成像仪、冰箱、制冰机等；
1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、tip头 、烧杯、量筒
镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、 吸水 纸，一次性塑料手套等；
E.coli DH5α受体菌(R-M-)， pTRE2hyg质粒(AmpR)
0.1mol/LCaCl2：称取1.1g进口无水CaCl2，溶于70mL双蒸 水中，定容到100mL，过滤后灭菌；
0.1mol/LCaCl2 15％甘油：100ml 0.1mol/L CaCl2 溶液内 含有15ml甘油，高压灭菌；
溶液I: 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA (pH8.0)， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)；