基因工程实验共25页文档
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Ⅰ、Ⅱ、III型三大类，Ⅰ类和III类限制性内切酶，在同一蛋 白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。 Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，但却随机地切割回
转到被结合处的DNA。Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割， 然后从底物上解离下来。故Ⅰ类和Ⅲ限制酶在基因工程中基本 不用，II类酶在分子克隆中使用广泛，其基本特点如下：
溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用)； 溶液III: 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml 冰醋酸，28.5mL H2O)； RNase A： 10mg/ml； TE缓冲液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA，pH 8.0；
质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合 环状的质粒DNA在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型， 呈可溶性状态保存与溶液中，离心后上清中便含有所需要的 质粒DNA。
3、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一类能 识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪 切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。根据限制 酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为
(4)、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列，甚至切割的位点也相同，称 为同裂酶或异源同工酶，如Hpa II与Msp I；有的识别位点不同，但对DNA切割后可 产生相同的粘性末端，称为同尾酶，如BamH I与Bgl II。
影响核酸限制性内切酶活性的因素： DNA的纯度； DNA的甲基化程度； 酶切消化反应的温度； DNA的分子结构； 溶液中离子浓度及种类； 缓冲液的 pH值。 4、琼脂糖凝胶电泳: 琼脂糖溶化再凝固后能形成带具有一定形状、大
0.1mol/LCaCl2：称取1.1g进口无水CaCl2，溶于70mL双蒸 水中，定容到100mL，过滤后灭菌；
0.1mol/LCaCl2 15％甘油：100ml 0.1mol/L CaCl2 溶液内 含有15ml甘油，高压灭菌；
溶液I: 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA (pH8.0)， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)；
(1)、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如EcoR I识 别与切割序列为5`····GAATTC····3`
3`····CTTAAG····5` (2) 、识别的核苷酸数目大多数为4～6个，少数识别8～13 个； (3)、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大多数酶 产生的是具有凸出的粘性末端：
移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、电泳仪、 电泳槽、紫外透射仪，凝胶成像仪、冰箱、制冰机等；
1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、tip头 、烧杯、量筒
镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、 吸水 纸，一次性塑料手套等；
E.coli DH5α受体菌(R-M-)， pTRE2hyg质粒(AmpR)
2、试剂： LB培养基:蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L， NaCl
10g/L，琼脂粉 15g/L（固体培养基），用10 mol/L的NaOH 调节pH为7.0，高压灭菌；
氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg／mL； 含有抗菌素的LB平板培养基：将配置好的LB固体培养基 高压灭菌后，冷却到60度左右，加入氨苄青霉素（终浓度为 50µg／mL浓度50-100µg／mL）；
小与孔隙度的固体基质 (密度与琼脂糖浓度相关)；而生理条件下，核酸分子 的糖-磷酸骨架中磷酸基团呈离子化状态，因此将核酸分子置于电场中时， 它们会向正极迁移，由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性，相同数量的双链 DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构 象。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子，具有较紧密的构 型，所以其电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线
促进细胞吸收DNA复合物，在丰富的培养基上生长数小时后，
球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化 子。
2、碱裂解法小量制备质粒DNA：碱裂解法是基于线性大 分子染色体DNA与小分子环形质粒DNA的变性、复性的差异 达到分离目的的，在pH12.0～12.6的碱性环境中，线型染色体 DNA和环型质粒DNA氢键会发生断裂，双链解开而变性，但 质粒DNA由于其闭合环型结构，氢键仅发生部分断裂，而且 其互补链不完全分离；当将pH值调节到中性并在高盐浓度下， 已分开的染色体DNA互补链不能复性而交联形成不溶的网状 结构，通过离心，大部分染色体DNA、不稳定的大分子RNA 和蛋白
性DNA分子要快。直接用低浓度的EB进行染色，可确定DNA在胶中的位置。
影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的因素： DNA的分子大小； 琼脂糖浓度； DNA构象； 电场强度； 碱基组成与温度； 嵌入染料的存在； 电泳缓冲液的组成。
三、实验材料与设备：
1、用品与与仪器： 超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、恒温振荡器、
二、实验原理
1、感受态细胞制备:所谓感受态是指受体细胞处于容易吸 收外源DNA的一种生理状态，可以通过物理与化学方法诱导 形成，也可以自然形成，在基因工程技术中通常采用诱导的 方法。用于ห้องสมุดไป่ตู้化的受体菌细胞一般是限制-修饰系统 （Restriction-Modification）缺陷的变异株，以防止对导入的 外源DNA的切割，用符号R-M-表示。其基本原理是：细菌处 于0℃的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性 发生变化，转化混合物中的质粒DNA形成抗DNase的羟基-钙 磷酸复合物黏附于细胞表面，经过42℃短时间的热激处理，
一、 实验目的和要求
1、通过本实验了解和掌握氯化钙法制备大肠杆菌感 受态细胞和质粒DNA转化受体菌细胞的原理与技术； 2、了解质粒DNA的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌细 胞中分离、提取质粒DNA的方法； 3、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳 的操作方法；
通过本实验了解大肠杆菌感受态细胞制备、DNA 转化、限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作 用。
转到被结合处的DNA。Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割， 然后从底物上解离下来。故Ⅰ类和Ⅲ限制酶在基因工程中基本 不用，II类酶在分子克隆中使用广泛，其基本特点如下：
溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用)； 溶液III: 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml 冰醋酸，28.5mL H2O)； RNase A： 10mg/ml； TE缓冲液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA，pH 8.0；
质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合 环状的质粒DNA在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型， 呈可溶性状态保存与溶液中，离心后上清中便含有所需要的 质粒DNA。
3、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一类能 识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪 切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。根据限制 酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为
(4)、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列，甚至切割的位点也相同，称 为同裂酶或异源同工酶，如Hpa II与Msp I；有的识别位点不同，但对DNA切割后可 产生相同的粘性末端，称为同尾酶，如BamH I与Bgl II。
影响核酸限制性内切酶活性的因素： DNA的纯度； DNA的甲基化程度； 酶切消化反应的温度； DNA的分子结构； 溶液中离子浓度及种类； 缓冲液的 pH值。 4、琼脂糖凝胶电泳: 琼脂糖溶化再凝固后能形成带具有一定形状、大
0.1mol/LCaCl2：称取1.1g进口无水CaCl2，溶于70mL双蒸 水中，定容到100mL，过滤后灭菌；
0.1mol/LCaCl2 15％甘油：100ml 0.1mol/L CaCl2 溶液内 含有15ml甘油，高压灭菌；
溶液I: 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA (pH8.0)， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)；
(1)、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如EcoR I识 别与切割序列为5`····GAATTC····3`
3`····CTTAAG····5` (2) 、识别的核苷酸数目大多数为4～6个，少数识别8～13 个； (3)、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大多数酶 产生的是具有凸出的粘性末端：
移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、电泳仪、 电泳槽、紫外透射仪，凝胶成像仪、冰箱、制冰机等；
1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、tip头 、烧杯、量筒
镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、 吸水 纸，一次性塑料手套等；
E.coli DH5α受体菌(R-M-)， pTRE2hyg质粒(AmpR)
2、试剂： LB培养基:蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L， NaCl
10g/L，琼脂粉 15g/L（固体培养基），用10 mol/L的NaOH 调节pH为7.0，高压灭菌；
氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg／mL； 含有抗菌素的LB平板培养基：将配置好的LB固体培养基 高压灭菌后，冷却到60度左右，加入氨苄青霉素（终浓度为 50µg／mL浓度50-100µg／mL）；
小与孔隙度的固体基质 (密度与琼脂糖浓度相关)；而生理条件下，核酸分子 的糖-磷酸骨架中磷酸基团呈离子化状态，因此将核酸分子置于电场中时， 它们会向正极迁移，由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性，相同数量的双链 DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构 象。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子，具有较紧密的构 型，所以其电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线
促进细胞吸收DNA复合物，在丰富的培养基上生长数小时后，
球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化 子。
2、碱裂解法小量制备质粒DNA：碱裂解法是基于线性大 分子染色体DNA与小分子环形质粒DNA的变性、复性的差异 达到分离目的的，在pH12.0～12.6的碱性环境中，线型染色体 DNA和环型质粒DNA氢键会发生断裂，双链解开而变性，但 质粒DNA由于其闭合环型结构，氢键仅发生部分断裂，而且 其互补链不完全分离；当将pH值调节到中性并在高盐浓度下， 已分开的染色体DNA互补链不能复性而交联形成不溶的网状 结构，通过离心，大部分染色体DNA、不稳定的大分子RNA 和蛋白
性DNA分子要快。直接用低浓度的EB进行染色，可确定DNA在胶中的位置。
影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的因素： DNA的分子大小； 琼脂糖浓度； DNA构象； 电场强度； 碱基组成与温度； 嵌入染料的存在； 电泳缓冲液的组成。
三、实验材料与设备：
1、用品与与仪器： 超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、恒温振荡器、
二、实验原理
1、感受态细胞制备:所谓感受态是指受体细胞处于容易吸 收外源DNA的一种生理状态，可以通过物理与化学方法诱导 形成，也可以自然形成，在基因工程技术中通常采用诱导的 方法。用于ห้องสมุดไป่ตู้化的受体菌细胞一般是限制-修饰系统 （Restriction-Modification）缺陷的变异株，以防止对导入的 外源DNA的切割，用符号R-M-表示。其基本原理是：细菌处 于0℃的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性 发生变化，转化混合物中的质粒DNA形成抗DNase的羟基-钙 磷酸复合物黏附于细胞表面，经过42℃短时间的热激处理，
一、 实验目的和要求
1、通过本实验了解和掌握氯化钙法制备大肠杆菌感 受态细胞和质粒DNA转化受体菌细胞的原理与技术； 2、了解质粒DNA的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌细 胞中分离、提取质粒DNA的方法； 3、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳 的操作方法；
通过本实验了解大肠杆菌感受态细胞制备、DNA 转化、限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作 用。