第一节 工具酶(限制性内切酶)
06+常用工具酶
可选择甲基化酶缺失的大肠 杆菌菌株制备质粒DNA
3.酶切消化反应的温度
大多数RE的最佳反应温度是37°C
实际操作中常采用水浴锅，但由于离心
管底部与顶部温度不同，反应体系会蒸 发，引起酶反应条件改变，可能会造成 酶产生星活力； 酶反应时间较短（2h左右)时可在水浴锅 内进行，如时间较长，最好在培养箱内 进行反应
酶切操作过程： 根据RE说明书，建立酶切反应体系
加样：依次加入水、缓冲液、DNA、酶 混匀 一定温度下保温一定时间 终止反应
电泳检测酶切结果
六、影响限制性酶切反应的因素
1. 2. 3. 4. 5. DNA样品纯度及分子结构 DNA甲基化程度 酶切反应温度 缓冲液 操作注意事项
1.DNA样品的纯度和分子结构：
如:Sam I(CCC GGG)和Xma I(C CCGGG)
同尾酶：不同RE识别不同序列,但切割后能 产生相同的粘性末端，可以连接起来; 如:Bcl I和BamH I
↓
↓
同尾酶：
Bcl I
TGATCA ACTAGT
BamH I
GGATCC CCTAGG
T ACTAG
GATCC G
五、限制性核酸内切酶的反应条件
1962年W.Arber提出细菌限制修饰的原理： 菌体中含有2种以上功能不同的酶； 一种（RE）能识别特定核酸序列，切断外来 DNA分子，限制其繁殖，是菌体的防御系统； 一种（修饰酶）也能识别RE所识别的序列， 其作用是通过使特定碱基甲基化而保护核酸， 避免被RE降解，是菌体的自身保护系统
属名 种名 株名
嗜血流感杆菌d株
Haemophilus influenzae d
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．类型：来自原核生物，有三种类型。
Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。
Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。
另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。
同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。
与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。
三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。
基因工程基因工程工具酶
基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。
在基因工程的过程中，基因工程工具酶发挥着关键的作用。
本文将介绍几种常用的基因工程工具酶，包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。
一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一类具有特异性切割DNA双链的酶。
它可以识别并切割DNA的特定序列，通常这个序列是对称的，在切割后会产生特定的片段。
1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。
它们通常识别的序列是4到8个碱基对长，具有一定的对称性。
一旦内切酶与特定序列结合，它会切断DNA的链，在特定的位置形成断裂，从而将DNA切割成特定的片段。
1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。
它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。
通过选择适当的限制性内切酶，可以对DNA进行特定的切割和连接，从而实现对目标基因的定向操作。
二、连接酶2.1 定义连接酶（Ligase）是一种酶类，能够将两条DNA片段连接起来。
在基因工程中，连接酶通常被用于连接目标基因和载体。
2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。
它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。
2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。
它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。
通过连接酶的作用，可以将多个DNA片段连接起来，构建出符合需要的重组DNA分子。
三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。
在基因工程中，修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。
3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。
它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。
3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。
它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。
常用工具酶
1962年，W．Arber提出一个假设来解释上述现象，就是细菌的 限制（限制酶）-修饰（甲基化酶）系统。
当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异 识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在 这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷 甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基 ，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。
CCG GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ CCG AT AGCCT GGCTATCGGA CCGATAGCCT GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ CCGATAGCCT GGCTATCGGA CCGATAGCCT GGCTA Pol I + Mg2+ CCGATAGCCT T GGCTA
4.识别位点在DNA分子上出现的频率
推测酶切割位点出现的频率对于推断DNA酶切片段大小很有 用。假定4种核苷酸在DNA分子上出现的频率相同，那么靶 序列为6个核苷酸的内切酶在每46（=4096）个核苷酸中酶 切位点就有一次出现机会。据此推算，一条49000bp长的 DNA中有12个6核苷酸识别序列的酶切位点（49000/4096） 。但事实上并非真正如此，因为DNA分子中4种碱基的出现 频率并不均等。
二、连接酶的类型
大肠杆菌DNA连接酶：由大肠杆菌基因组DNA编码Байду номын сангаас，以NAD+作为能源辅助因子； T4 DNA连接酶：由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，以 ATP作为能源辅助因子，是基因工程中常用的连 接酶。
三、DNA连接反应的条件
连接反应最佳温度为37℃，但是此时粘性末端间氢键结合 不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，EcoRI 粘性 末端连接部位只有4个碱基对，很容易断开，所以通常在 4-15℃连接。
分子克隆中常用的四种工具酶及其应用
分子克隆中常用的四种工具酶及其应用分子克隆是利用分子生物学技术对目标DNA进行扩增及克隆的过程。
在分子克隆的过程中，常常需要使用许多酶类工具来完成不同的任务。
以下介绍了分子克隆过程中最常用的四种酶类工具及其应用。
1. 限制性内切酶限制性内切酶（Restriction endonuclease）又称限制酶，是一类可特异性切割DNA特定序列的酶。
它可以在DNA的特定位置切割成不同的碎片，而不会破坏DNA的结构。
因此，限制酶被广泛应用于DNA的纯化、分析和重组等领域。
在分子克隆中，限制酶通常用于切割DNA的特定序列，以获得所需的DNA片段。
同时，也可以用于制备载体DNA的端部修饰，方便插入外来DNA片段。
此外，限制酶还可以用于分析DNA序列的变异和同源性等特征。
2. DNA连接酶DNA连接酶（DNA ligase）是一种催化DNA连结软帽酶，用于连接具有互补末端的DNA片段。
连接酶广泛应用于DNA重组、引物连接、克隆和测序等领域。
在分子克隆中，DNA连接酶通常使用于将外来DNA片段连接到载体 DNA 上。
此外，为了克隆具有完整DNA序列的目标基因，连接酶还可以用于连接PCR扩增出来的目标DNA序列。
3. PCR酶聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）是一种快速、有效、敏感的DNA扩增技术。
在PCR过程中，通过PCR酶催化下的DNA扩增反应，能够在很短的时间内扩增目标DNA的数量。
在分子克隆中，PCR酶通常用于扩增目标DNA片段。
利用PCR技术，可以选择性增加目标DNA的数量并在容易处理的基本DNA片段之间产生特定的限制酶切断部位，为后续分子克隆实验提供方便。
4. 接头酶接头酶（T4 DNA ligase）是一种针对DNA单链断裂或缺口进行修复和连接的酶。
在分子克隆中，接头酶主要用于将外来DNA片段和载体DNA粘到一起。
在分子克隆的过程中，外来DNA片段和载体DNA之间通常存在一些不兼容的末端或过于短的重叠部分。
分子生物学第四章--基因工程常用工具酶
同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。
同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。
B．以切出片段末端性质不同可分，粘性末端和平末端。
粘性末端：（Cohesive Ends）两个突出末端可退火互补— — DNA是分子重组的基础
15
同裂酶
又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别 序列。 在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平 头末端，称为同识同切； 切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端， 称为同识异切。
第四章 基因工程常用工具酶
1
Manipulating Genes
- Transferring Genes
Restriction Ligation Extract DNA
Transformation
Selection
Culturing
2
重组DNA实验中常见的主要工具酶
3
我们的基本目的是：把外源基因与载体 连接在一起形成重组DNA分子，最少需要以 下两类工具酶：
23
如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时，
产生相同的末端，混合后“退火”，这两种不同的
DNA分子彼此可以连接，形成重组DNA分子。
24
限制性内切酶的剪切方式
25
Yu Zheng, et al. Using shotgun sequence data to find active restriction enzyme genes. Nucleic Acids Res., 2009, 37: e1. Whole genome shotgun sequence analysis has become the standard method for beginning to determine a genome sequence. The preparation of the shotgun sequence clones is, in fact, a biological experiment. It determines which segments of the genome can be cloned into Escherichia coli and which cannot. By analyzing the complete set of sequences from such an experiment, it is possible to identify genes lethal to E. coli.
基因操作工具酶PPT课件
α- 32P-dATP
EcoR I 酶切末端
同位素标记的EcoR I 酶切末端
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3.3 Taq DNA聚合酶
显著特点：热稳定性。70℃反应2h残留活性90 %； 93℃ 反应 2 h残留活性60% ；94℃ 反应 2 h残 留活性40%。
应用：（1）对DNA的特定片段进行体外扩增； （2） DNA序列测定。
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2 DNA连接酶
2.1 定义及功能 2.2 种类及作用机理 2.3 使用时的注意事项
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2.1 定义及功能
DNA连接酶（DNA ligase）： 可使一段DNA 3`-OH末端和5`-P 末端
形成3`,5`-磷酸二酯键，把两DNA片段 连在一起封闭双链上形成的切口的酶。
OH P
5`
• 若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个 字母（大写）
• 若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先 后顺序用罗马字母表示。
例如：EcoRⅠ 从大肠杆菌R株分离的第一种限制酶命名为 EcoRⅠ， 其中E 代表属名（Escherichia)，co 代表种名（coli)， R 代表株系（RY13），Ⅰ 代表该菌株中首次分离到。
应用：缺口平移法制备DNA分子杂交探针
缺口
DNase I DNA聚合酶 I
DNA聚合酶 I dNTP*
缺口
缺口平移法制备DNA分子探针 Back
3.2 Klenow聚合酶
活性： 5`→3`聚合活性，3`→5` 外切酶活性，无5`→3`
外切酶活性。 用途： （1）填补或标记DNA的3`隐蔽末端； （2）催化合成cDNA第二链； （3）DNA序列测定
5-7 bp非对称序 列
工具酶(限制性内切酶)优秀PPT
Ⅱ型限制性内切酶
1. 能在其识别序列内部或附近特异地切开 DNA 链。它们产 生确定的限制性片段和凝胶电泳条带，因此是唯一一类用 于 DNA分析和克隆的限制性内切酶。
2. Ⅱ型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组 成，因而它们的氨基酸序列可能截然不同。
3. 它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称 序列；
嗜血流感细菌还具有另一个Ⅱ型的限制酶 Hind Ⅲ，而且含量很大。幸 运的是，Hind Ⅲ不切割T7 DNA，因此 Hind Ⅱ制剂中可能混有的 Hind Ⅲ将不产生任何问题（Old 等，1975）。
在发现 HindⅡ后不久，又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶，并分 析了它们的性质，EcoRⅠ是其中最重要的一个（Hedgepeth 等， 1972）。它们随即迅速用于最初的重组 DNA 实验中。
• 这类酶很少能达到完全切割。
11
某些识别和切割独特的酶
12
BsmBⅠ
13
Ⅳ 型限制性内切酶
• 识别经典甲基化的和修饰的 DNA。以 E. coli 的 McrBC 和 Mrr 系统为代表。
14
15
• 限制性内切酶切割后产生一个 3' -羟基和一 个 5' -磷酸基。只有当镁离子存在时，它们 才有切割活性，相应的修饰酶则需要 S- 腺 苷甲硫氨酸的存在。这些酶一般都比较小， 亚基约 200-350 个氨基酸。
16
某些识别和切割独特的酶
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限制性内切酶命名
• 由于发现了大量的限制和修饰酶，所以需要一个统 一的命名体系。Smith 和 Nathans（1973）提出 了一个合适的体系，人们今天使用的就是这个体系 的一个简化版。其主要特征是：
分子克隆常用工具酶
离纯化的依赖DNA的DNA聚合酶，最适温度75℃-80℃ 需要Mg2+(10 mmol／L)，在低浓度Mn2+(2 mmol/L)中有 低活性，Ca2+使其完全失活，一价阳离子高至0.1 moI ／L对活性无影响，而最适浓度NaCl为40 mmol/L，KCl 为60 mmol/L 最适pH7.8(Tris-HCl)，与大肠杆菌DNA聚合酶相比，其 最大特性是耐高温和无核酸酶活性
第二章 分子克隆常用工具酶
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DNA 的基本结构
Structure and features
• 每一单链具有 5’-3’极性
• 两条单链间以氢键连接 • 两条单链，极性相反，反向平行 • 以中心为轴，向右盘旋
植物基因工程
植物基因工程
Replication
2)平末端DNA片段的连接
a. 直接用T4 DNA连接酶连接：效率不高，较少采用。 b. 同聚物加尾连接平末端DNA片段：先用末端核苷酸转
移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA 连接酶进行连接 c. 用衔接物连接平末端DNA分子：目的是在平末端分子 上构建限制性核酸内切酶酶切位点，经酶切后产生 特异的粘性末端，从而与具有互补末端的DNA连接
以RNA分子为模板合成互补的cDNA链
将同聚物尾巴加到线性双链 或单链DNA分子的3'-OH末端或DNA的3'-末 端标记dNTP 降解单链DNA或RNA，产生带5'磷酸的单核苷酸或寡聚核苷酸，同时也 可切割双链核酸分子的单链 能在高温（72℃）下的单链DNA为模板，从5'→3'方向合成新生的互补 链
第一节工具酶限制性内切酶
限制和修饰现象
• 在 20 世纪 60 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。该 研究工作在 Me-selson 和 Yuan（1968）纯化得到了大肠杆菌 K12 的限制 性内切酶时达到高峰。因为这个内切酶可以把未修饰的 DNA 切割成大的分 离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。从而提供了对 DNA 进行可控操 作的前景。但不幸的是，K12 内切酶不具备人们希望的性质。虽然它确实是 结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机”发生的 （Yuan 等，1980）。
酶的星号活性
• 在极端的条件下（如高 pH 和低离子强度下），限 制性内切酶可以切割类似但不同于其特定识别序列 的序列，这种改变的特异性称为星号活性。
• 最常见的一类活性改变是允许碱基替代和识别序列 中碱基的缺失。例如，EcoR Ⅰ（EcoR Ⅰ星号活 性）切割序列 N /AATTN，此处 N 为任意碱基，而 EcoR Ⅰ切割序列为 GAATTC。
Ⅱ型限制内切酶的发现
突破性的进展始于 Hamilton Smith 的发现，他从嗜血流感细菌 （Haemophilus influenzae）菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶 （Smith & Wilcox，1970），并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的 核苷酸序列（Kelly & Smith，1970）。这个酶现在命名为 Hind Ⅱ。
4. 只有当镁离子存在时，它们才有切割活性，
最常见的 Ⅱ 型限制性内切酶
1. 在特异性识别序列内部切割 DNA，如 HhaI、HindIII 和 NotI，商业化 酶多属此类。它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称 序列；
ch2-1-工具酶-限制性内切酶
Restriction/Modification Systems
Restriction endonucleases are categorized into one of four general groups (Types I, II, III, and homing endonucleases based on their subunit structure, cofactor requirements, specificity of cleavage, and associated methylase activity.
4. 限制性核酸内切酶（Restriction Endonuclease) 是一类能够识别双链DNA中特殊的核苷酸序列，并使 每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶 (endo-deoxyribonuclease)。
Structure of the homodimeric restriction enzyme EcoRI (cyan and green cartoon diagram) bound to double stranded DNA (brown tubes).Two catalytic manganese ions (one from each monomer) are shown as magenta spheres and are adjacent to the cleaved sites in the DNA made by the enzyme (depicted as gaps in the DNA backbone).
基化状态发挥相应的酶活性，或修饰或切割。切割位点
与识别位点相隔1-5kb。 4） I类限制性内切酶的种类较少，研究的较多的有大肠杆 菌的EcoK和EcoB。
基因工程中常用的工具酶
五、影响限制性内切酶活性的因素 1.DNA的纯度 2. DNA的甲基化 （1）基因工程使用失去甲基化酶的大肠杆菌 （2）研究基因工程DNA的甲基化程度 （3）改变限制酶的识别特性 3.温度 4.分子结构 5.限制酶的缓冲液 星号活性 EcoRⅠ切 GAATTC EcoRⅠ*切 pupuATpypy 或AATT
第一节限制性核酸内切酶与dna分子的体外切割第二节dna连接酶和dna分子的体外连接第三节其他工具酶第一节第一节限制性核酸内切酶与限制性核酸内切酶与dnadna分子的体切割分子的体切割限制性核酸内切酶是一类能够识别双链dna分子中的某种特定核苷酸序列并由此切割dna双链结构的核酸内切酶
二、基因工程的基本程序 a b 剪切 b
载体质粒
A 外源DNA片段 A b 引入宿 主细胞 选出含有重 组DNA的细 胞扩增表达
外源DNA插入
第二章
基因工程中常用的工具酶
第一节 限制性核酸内切酶与DNA 分子的体外切割 第二节 DNA连接酶和DNA分子的 体外连接 第三节 其他工具酶
第一节
限制性核酸内切酶与DNA 分子的体切割
一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
1.三种活性 （1）5’-3’聚合酶活性（在有dNTP时） （2）3’外切酶活性 （无dNTP时大亚基活性） （3）5’外切核酸酶活性（无dNTP时小亚基活性） 2.在基因工程中的应用 ：缺口平移标记技术。
二、DNA聚合酶Ⅰ大片段 （Klenow酶）
1.DNA聚合酶活性 （切除小亚基，保留大亚基） 2. 3’外切酶活性（无dNTP时） 3. 在基因工程中的应用
（1）标记粘性末端. -32P—dNTP 标记平末端 -32P—dNTP （2）将5’端伸出的末端填平 （3）可用来反转录合成双链cDNA。 （4）补平粘性末端。
分子克隆工具酶
5、同尾酶(isocaudarner) 不同的 限制酶切割DNA产生的末端是相同的， 且是对称的，即它们可产生相同的黏性末端。
BamH I : G ↓ GATCC Bgl II : A ↓ GATCT
6、归位内切酶(homing endonuclease) 内含子编码的内切酶。
四、DNA末端长度对限制酶切割的影响
H in d I Haemophilus influenzae
REBASE(The Restriction Enzyme Database) New England Biolabs
3.限制与修饰系统的种类
酶分子 识别位点 切割位点
II（93%） 内切酶与甲基化酶 分子不在一起
3、非对称突出末端
许多限制酶切割DNA产生非对称突出端。当识别 序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端
是 不 同 的 ， 如 BbvCⅠ ， 它 的 识 别 切 割 位 点
CC↓TCAGC GGAGT↑CG
有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几
种是非对称的。如AccⅠ，它的识别切割位点如
下，GT↓AT/CGAC CATA/GC↑TG
4-6位点
限制反应与 分开的反应 甲基化反应
限制反应是 否 否需要ATP
I（1%） 三亚基双功 能酶 二分非对称
无特异性， 在识别位点 外1000bp 互斥
是
III（1%） 二亚基双功 能酶
5-7bp非对 称
在识别位点 下游2426bp 同时竞争
是
5‘内切酶 3‘内切酶
AAC(N)6GTGC和GCAC(N)6GTT序列中A的N6 位置。
4、Sss I甲基化酶，来源于原核螺原体，可使CG
序列中的C在C5位置上甲基化。
基因工程复习资料
第二章分子克隆工具酶基因工程工具酶⏹限制性内切酶——主要用于DNA分子的特异切割⏹DNA甲基化酶——用于DNA分子的甲基化⏹核酸酶——用于DNA和RNA的非特异性切割⏹核酸聚合酶——用于DNA和RNA的合成⏹核酸连接酶——用于DNA和RNA的连接⏹核酸末端修饰酶——用于DNA和RNA的末端修饰⏹其它酶类——用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。
第一节限制性核酸内切酶(restriction enzyme)一、限制性内切酶的发现历史核酸酶：催化核酸酯键的水解核酸外切酶：作用于核酸链的末端(3′或5 ′),逐个水解核苷酸。
核酸内切酶：从核酸分子内部切断3′，5′磷酸二酯键。
限制性核酸内切酶：在细菌细胞内存在的一类能识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶。
1、细菌的限制——修饰现象细菌的限制——修饰作用发现细菌的限制（restriction）现象：寄主控制的专一性phageλKR-M 系统的作用:R-M 系统是细菌安内御外的积极措施。
保护自身的DNA不受制；破坏外源DNA使之迅速降解细菌R-M 系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA 的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA 则会被降解。
个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。
限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。
由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。
2、限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶(restriction endonuelease)是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。
它是可以将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。
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某些识别和切割独特的酶
限制性内切酶命名
• 由于发现了大量的限制和修饰酶，所以需要一个统 由于发现了大量的限制和修饰酶， 一的命名体系。 一的命名体系。Smith 和 Nathans（1973）提出 （ ） 了一个合适的体系， 了一个合适的体系，人们今天使用的就是这个体系 的一个简化版。其主要特征是： 的一个简化版。其主要特征是：
限制和修饰现象
• 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。 在 20 世纪 60 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。该 研究工作在 Me-selson 和 Yuan（1968）纯化得到了大肠杆菌 K12 的限制 （ ） 性内切酶时达到高峰。 性内切酶时达到高峰。因为这个内切酶可以把未修饰的 DNA 切割成大的分 离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。 离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。从而提供了对 DNA 进行可控操 作的前景。但不幸的是， 内切酶不具备人们希望的性质。 作的前景。但不幸的是，K12 内切酶不具备人们希望的性质。虽然它确实是 结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机” 结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机”发生的 （Yuan 等，1980）。 ）。
限制性内切酶命名
• 以限制性内切酶来源的微生物的学名来命名，多采用三个字母。 ① 以限制性内切酶来源的微生物的学名来命名，多采用三个字母。微生物属 名的首字母大写，种名的前两个字母小写。 名的首字母大写，种名的前两个字母小写。 若该微生物有不同的变种或品系，则再加上该变种或品系的第一个字母, ② 若该微生物有不同的变种或品系，则再加上该变种或品系的第一个字母 但需大写；从同一种微生物中发现的多种限制性内切酶， 但需大写；从同一种微生物中发现的多种限制性内切酶，依发现和分离的前 后顺序用罗马数字区分。 后顺序用罗马数字区分。 限制性内切酶名称的前三个字母用斜体表示，后面的字母、 ③ 限制性内切酶名称的前三个字母用斜体表示，后面的字母、罗马数字等均 为正体。同时，字母之间、罗马数字与前面的字母之间不应有空格(由于在现 为正体。同时，字母之间、罗马数字与前面的字母之间不应有空格 由于在现 有的大多数软件排版时， 有的大多数软件排版时，当输入罗马数字时其会自动与前面的字母之间拉开 半个汉字的空格， 半个汉字的空格，故在印刷体的书刊中就会看到罗马数字与前面的字母之间 有空格)。 有空格 。
一、工具酶
• 到 20 世纪 60 年代中期，人们已经认定限制 年代中期， 和修饰是细菌遗传学领域中最重要和最有趣 的现象（例子可见 Hayes，1968），但是谁 ），但是谁 的现象（ ， ）， 会预见到限制酶将对生物学产生的巨大影响 会预见到限制酶将对生物学产生的巨大影响 限制酶 呢？ • 那么，什么是限制酶？限制酶来自哪里呢？ 那么，什么是限制酶？限制酶来自哪里呢？ 限制酶
粘性末端的意义
• 限制性核酸内切酶通常可产生两种不同的粘 性末端，一种是形成带有凸出的 ′ 性末端，一种是形成带有凸出的5′磷酸基 团的粘性末端， 团的粘性末端，如EcoRⅠ；另一种形成带有 Ⅰ 凸出的3′羟基基团的粘性末端， 凸出的 ′羟基基团的粘性末端，如PstⅠ。 Ⅰ
同裂酶和新裂酶
• 偶尔人们会发现识别新的特异性 DNA 序列 的酶， 的酶，但已经证明大部分酶的特异性都与已 知的酶相同。 知的酶相同。具有相同的序列特异性和切割 位点的限制酶称为同裂酶 同裂酶。 位点的限制酶称为同裂酶。 • 识别相同序列，但切割位点不同的酶，例如 识别相同序列，但切割位点不同的酶， SmaⅠ（CCC/GGG）和 XmaⅠ Ⅰ ） Ⅰ ），有时称为新裂酶。 （C/CCGGG），有时称为新裂酶。 ），有时称为新裂酶
酶的星号活性
• 在极端的条件下（如高 pH 和低离子强度下），限 在极端的条件下（ 和低离子强度下），限 ）， 制性内切酶可以切割类似但不同于其特定识别序列 的序列，这种改变的特异性称为星号活性。 的序列，这种改变的特异性称为星号活性。 星号活性 • 最常见的一类活性改变是允许碱基替代和识别序列 中碱基的缺失。例如， 中碱基的缺失。例如，EcoR Ⅰ（EcoR Ⅰ星号活 为任意碱基， 性）切割序列 N /AATTN，此处 N 为任意碱基，而 ， EcoR Ⅰ切割序列为 GAATTC。 。
Ⅱ型限制性内切酶
1. 能在其识别序列内部或附近特异地切开 DNA 链。它们产 生确定的限制性片段和凝胶电泳条带， 生确定的限制性片段和凝胶电泳条带，因此是唯一一类用 分析和克隆的限制性内切酶。 于 DNA分析和克隆的限制性内切酶。 分析和克隆的限制性内切酶 2. Ⅱ型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组 因而它们的氨基酸序列可能截然不同。 成，因而它们的氨基酸序列可能截然不同。 3. 它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称 序列； 序列； 4. 只有当镁离子存在时，它们才有切割活性， 只有当镁离子存在时，它们才有切割活性，
FokI
Ⅲ 型限制性内切酶
• 也是一类较大的兼有限制 修饰两种功能的酶。 也是一类较大的兼有限制-修饰两种功能的酶。 修饰两种功能的酶 它们在识别位点之外切开 DNA 链，并且要 求同一 DNA分子中存在两个反向的识别序列 分子中存在两个反向的识别序列 以完成切割。 以完成切割。 • 这类酶很少能达到完全切割。 这类酶很少能达到完全切割。
Ⅱ型限制内切酶的发现
的发现， 突破性的进展始于 Hamilton Smith 的发现，他从嗜血流感细菌 （Haemophilus influenzae）菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶 ） 中找到了一种限制性内切酶 ），并阐明了它在噬菌体 （Smith & Wilcox，1970），并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的 ， ）， 核苷酸序列（ ）。这个酶现在命名为 核苷酸序列（Kelly & Smith，1970）。这个酶现在命名为 Hind Ⅱ。 ， ）。 嗜血流感细菌还具有另一个Ⅱ 而且含量很大。 嗜血流感细菌还具有另一个Ⅱ型的限制酶 Hind Ⅲ，而且含量很大。幸 运的是， 不切割T7 运的是，Hind Ⅲ不切割 DNA，因此 Hind Ⅱ制剂中可能混有的 ， Hind Ⅲ将不产生任何问题（Old 等，1975）。 将不产生任何问题（ ）。 在发现 HindⅡ后不久，又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶，并分 Ⅱ后不久，又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶， 析了它们的性质， 析了它们的性质，EcoRⅠ是其中最重要的一个（Hedgepeth 等， Ⅰ是其中最重要的一个（ 1972）。它们随即迅速用于最初的重组 DNA 实验中。 ）。它们随即迅速用于最初的重组 实验中。 ）。
另一种比较常见的 Ⅱ 型限制性内切酶
• 所谓的Ⅱ 型酶， 所谓的ⅡS 型酶，如 FokI 和 AlwI，它们在识别位点之外切开 DNA。这些酶大 ， 。 小居中， 个氨基酸， 的功能域组成。 小居中，约 400-650 个氨基酸，由 DNA 结合域和切割 DNA 的功能域组成。 它们识别连续的非对称序列。 它们识别连续的非对称序列。 • 一般认为这些酶主要以单体的形式结合到 DNA 上，与邻近酶分子的切割功能 域结合成二聚体，协同切开 DNA链。因此一些ⅡS 型酶在切割含有多个识别位 域结合成二聚体， 链 因此一些Ⅱ 分子时活性更高。 点的 DNA 分子时活性更高。
某些识别和切割独特的酶
BsmBⅠ
Ⅳ 型限制性内切酶
• 识别经典甲基化的和修饰的 DNA。以 E. 。 coli 的 McrBC 和 Mrr 系统为代表。 系统为代表。
• 限制性内切酶切割后产生一个 3' -羟基和一 羟基和一 磷酸基。 个 5' -磷酸基。只有当镁离子存在时，它们 磷酸基 只有当镁离子存在时， 才有切割活性， 才有切割活性，相应的修饰酶则需要 S- 腺 苷甲硫氨酸的存在。这些酶一般都比较小， 苷甲硫氨酸的存在。这些酶一般都比较小， 个氨基酸。 亚基约 200-350 个氨基酸。
Ⅰ型限制性内切酶
• 是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多亚基蛋 白复合体。 白复合体。它们可在远离识别位点处任意切割 DNA 链。 • 以前认为Ⅰ型限制性内切酶很稀有，但基因组测序 以前认为Ⅰ型限制性内切酶很稀有， 分析发现这类酶其实很常见。尽管Ⅰ 分析发现这类酶其实很常见。尽管Ⅰ型酶在生化研 究中很有意义， 究中很有意义，但其不 • 能产生确定的限制片段和明确的凝胶电泳条带，因 能产生确定的限制片段和明确的凝胶电泳条带， 而不具备实用性。 而不具备实用性。
同尾酶
同尾酶是与同裂酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异， 同尾酶是与同裂酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异， 识别的靶序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端。 识别的靶序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端。 常用的限 制 酶 BamHⅠ、BglⅡ、BclⅠ、Sau3AⅠ、 Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅰ XhoⅡ就是一组同尾酶，它们切割 DNA之后都形成由 DNA之后都形成由 之后都形成由GATC Ⅱ就是一组同尾酶， 个核苷酸组成的粘性末端。显而易见， 4个核苷酸组成的粘性末端。显而易见，由同尾酶产生的 DNA 片段， 片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起 来的,因此在基因工程操作中很有用处。 来的,因此在基因工程操作中很有用处。 由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点， 由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特 称之“杂种位点”但这类杂种位点形成之后， 称之“杂种位点”但这类杂种位点形成之后，一般不能再被 原来的任何一种同尾酶所识别。 原来的任何一种同尾酶所识别。
限制和修饰（ 限制和修饰（R -M ）的类型至少存在 4 种不同类型的 R M 系统：类型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。它们之间的主要差异总结 系统：类型Ⅰ 在表 3.1 中。按照亚基组成、酶切位置、识别位点和辅助因子等不同，
传统上将限制性内切酶分为四大类。然而，蛋白测序的结果表明，限制性内 切酶的变化多种多样，若从分子水平上分类，则远远不止四类。