等温滴定量热法.
等温滴定量热法
等温滴定量热法在一次实验中直接进行关于生物分子亲和力和热力学特性的无标记测定等温滴定量热法（ITC）是用于量化研究各种生物分子相互作用的一种技术。
它可直接测量生物分子结合过程中释放或吸收的热量。
ITC是唯一一种能够在一次试验中同时确定所有结合参数的技术。
ITC可以测定结合配偶体在自然状态下的亲和力，无需通过荧光标记或固定化技术对结合配偶体进行修饰。
通过测量结合过程中的热传递，就能够准确地确定结合常数（K D）、反应化学量（n）、焓（∆H）和熵（ΔS）。
这就提供了有关分子相互作用的完整热力学信息。
ITC不仅可测定结合亲和力，还能阐明潜在分子相互作用的机制。
更深入了解结构－功能关系，让我们能够更加自信地在苗头化合物选择和先导化合物优化方面作出决策。
测量原理：等温滴定量热法用来测定各生物分子之间的反应。
该方法可测定结合亲和力、化学计量以及溶液中结合反应的熵和焓，无需使用标记。
发生结合时，热不是被吸收就是被释放，这是在配体被逐渐滴定到包含目标生物分子的样品池过程中通过灵敏量热计而测得。
工作原理热核心微量热计中有两个池，其中一个含有水，作为参比池，另一个含有样品。
微量热计必须使这两个池保持完全相同的温度。
热敏装置检测发生结合时两个池之间的温差，并反馈给加热器，由加热器来补偿该温差并使两个池恢复到相同的温度。
进行测量参比池和样品池被设定到所需的实验温度。
将配体装入一个非常精确的注射装置上的注射器中。
将注射装置插入包含目标蛋白质的样品池中。
将一系列小份配体试样注入到蛋白质溶液中。
如果有配体与蛋白质结合，则可检测到并测出几百万分之一摄氏度的热量变化。
进行第一次注射时，微量热计测量被释放的所有热量，直到结合反应达到平衡。
测得的热量与结合量成正比。
结果和数据分析在下面的示例中，反应是放热的，这就意味着样品池温度高于参比池并由此导致信号出现下行波峰。
随着两个池的温度恢复到同一水平，信号也回到其起点。
将第二小份配体试样注入到样品池中，同样，微量热计补偿所检测到小幅热量变化。
ITC等温滴定量热法的操作说明
实验总结
实验结果的讨论及其意 义
分析实验结果，讨论相互作 用的特性、结合亲和力等， 并探讨结果对相关研究领域 的意义。
需要改进的方面
总结实验中的不足和问题， 提出改善和优化实验方法的 建议。
ITC 等温滴定量热法的 重要性
介绍ITC等温滴定量热法在生 物研究中的应用和优势，强 调其对解决科学问题的重要 性。
确保样品和配体的纯度和浓度，准备适 当的缓冲液进行滴定实验。
结果分析
信息的含义
通过分析数据，可以获得化学反 应的热效应、平衡常数、热力学 参数等信息。
数据的解释
异常情况处理
根据实验条件和数据分析结果， 解释实验中观察到的现象和趋势， 揭示背后的机理。
记录并分析实验中可能出现的异 常情况，如峰形变异、噪音等， 以确定实验结果的可靠性。
实验步骤
1
实验参数调整
2
根据实验需求，调整参数如温度、浓度、 滴定量等，以优化实验结果。
3
实验过程数据处理
4
将实验中得到的热效应数据转化为相关 参数，并进行数据分析和解释。
操作流程
按照以下步骤进行实验： 1. 样品和配体的准备 2. 初始化仪器 3. 进行等温滴定实验 4. 结束实验并保存数据
样品处理和置换缓冲液
ITC等温滴定量热法的操作说明
I. 简介 A. ITC (等温滴定量热法) 是一种测量在生物分子之间发生的相互作用的热效应的技术。 B. ITC 在生物科学研究中广泛应用，例如研究蛋白质结合、药物相互作用等。 . ITC 的优势包括无需标记物质、直接可测量热效应以及定量分析结果。 II. 实验前准备 A. 准备所需的仪器和试剂，包括等温滴定量热仪、样品和配体等。 B. 检查和准备实验所需设备，如清洗实验容器、校准测温系统等。 C. 遵守实验室的安全操作规程，戴上个人防护装备。
等温滴定量热法
另一个检测对照和环境的热量差。当样品中发生化学反应的时候，释放或者吸
收热量，因此样品和对照的温度差会通过对样品进行增加或者减少热量而稳定
在一个水平，就是baseline。因此那些用来维持ΔT1=常数的热量就被系统检
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▪ 滴定一般在尽可能接近绝热的条件下进行，被滴定物可以是液体或悬 浮的固体；滴定剂可以是液体或气体。温度变化是由滴定剂与被滴定 物间的化学作用或物理作用（例如一种有机分子吸附于固体表面）引 起的。
▪ 实验数据以热谱图形式表示，它提供了有关反应中物质的量（滴定终 点）和反应物质的特性（焓变）的数据。对图进行分析，可以得知反 应容器中发生的反应的类型和数目，以及溶液中存在的各物种的浓度 等信息。这部分内容称为热滴定，同时还可以确定反应的化学计量关 系，计算反应的热力学量,如平衡常数K(ΔG°)、标准状态下的焓变ΔH° 和熵变ΔS°,这部分内容称为滴定量热法。
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ITC系统是通过细胞反馈网络 CFB来分别测量或者补偿样品和对照由于反应所产
生或者吸收的热量。两个硬币状的东西放置在绝热的圆筒中，通过那个细细的
管子与外界联通。有两个热量检测装置。一个用来检测两个样品之间的热量差，
▪ 测温滴定法以热效应为基础,与溶液的许多性质(如粘度、光学透明度、 介电常数、溶剂强度、以及离子强度等)无关,因此可以用于气相、液相、 非水溶液、有色溶液、胶体溶液和粘稠浆状等体系。
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典型的ITC数据
配体溶液20次注射到ITC池的 蛋白溶液中。每个注射峰（上 图）下方的区域与注射所释放 的总热量相等。当这种综合的 热量相对添加到池中的配体摩 尔比作图时，就获得了相互作 用的完整结合等温线（下图）。 用单位点模型来验证数据。化 学计量、结合常数及焓的数值 都显示在框内。
等温滴定量热法浓度优化
等温滴定量热法浓度优化等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC）是一种广泛应用于生物化学、药物研发和生物医学领域的实验技术。
通过测量反应在等温条件下产生或吸收的热量，ITC可以帮助研究人员了解溶液中分子之间的相互作用，如配体和受体的结合、酶催化反应以及protein-protein 相互作用。
通过优化等温滴定量热法的浓度参数，可以提高实验结果的质量和可靠性。
在优化等温滴定量热法的浓度时，有几个关键因素需要考虑。
首先是实验物质的浓度范围。
选择适当的浓度范围可以确保反应产生的热量在仪器检测范围内，同时减少背景噪音的干扰。
一般来说，对于正常的反应热量，推荐使用0.1-2.0 mM的溶液浓度。
然而，对于特殊的反应系统，需要事先进行一些初步实验，以确定最佳的溶液浓度范围。
其次是选择合适的滴定量。
滴定量是指每一次滴加到反应体系中的试剂量。
在进行等温滴定量热法实验时，滴定量的选择将直接影响到实验的敏感性和准确性。
一般来说，滴定量应尽量小，以确保每一次反应的热效应可以被仪器检测到，同时避免反应溶液的剧烈稀释或稀释不足。
通常情况下，滴定量为0.5-2.5 μL。
还需要考虑实验温度和缓冲溶液的选择。
实验温度应根据实验系统的特性和要研究的反应进行合理的选择。
对于生物体系来说，一般选择25℃或37℃作为实验温度。
而对于非生物体系，可根据需要进行调整。
缓冲溶液的选择应该使得反应体系在所选温度下保持稳定，并且不对测量结果产生干扰。
在实施等温滴定量热法浓度优化实验时，以下是一些有效的实践经验和技巧：1. 从简单到复杂地确定浓度范围。
首先可以进行一些初步实验，选择几个不同浓度的溶液进行测试，进而找到适合体系的浓度范围。
可以根据实验结果调整溶液的浓度，并逐渐扩大范围。
2. 手动混匀溶液，确保均匀分布。
在进行实验前，用手动混匀的方法将溶液均匀混合，以确保反应物质在整个试验过程中处于均一的状态。
ITC等温滴定量热法的操作说明资料
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INS
它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一
个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动 力学信息，它已经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法。
可获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数（Ka）、 结合位点数（n）、摩尔结合焓（△H）、摩尔结合熵（△S）、摩尔恒 压热容（△Cp），和动力学参数(如酶促反应的Km和kcat）
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ITC系统是通过细胞反馈网络 CFB来分别测量或者补偿样品和对照由于反应所产 生或者吸收的热量。两个硬币状的东西放置在绝热的圆筒中，通过那个细细的 管子与外界联通。有两个热量检测装置。一个用来检测两个样品之间的热量差， 另一个检测对照和环境的热量差。当样品中发生化学反应的时候，释放或者吸 收热量，因此样品和对照的温度差会通过对样品进行增加或者减少热量而稳定 在一个水平，就是baseline。因此那些用来维持Δ T1=常数的热量就被系统检 7 Page 7 测画作曲线。
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Applications include:
Characterization of molecular interactions of small molecules Lead optimization. Enzyme kinetics.
Assessment of the effect of molecular structure changes on binding mechanisms.
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典型的ITC数据
配体溶液20次注射到ITC池的 蛋白溶液中。每个注射峰（上 图）下方的区域与注射所释放 的总热量相等。当这种综合的 热量相对添加到池中的配体摩 尔比作图时，就获得了相互作 用的完整结合等温线（下图）。 用单位点模型来验证数据。化 学计量、结合常数及焓的数值 都显示在框内。
等温滴定量热法
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滴定一般在尽可能接近绝热的条件下进行，被滴定物可以是液体或悬 浮的固体；滴定剂可以是液体或气体。温度变化是由滴定剂与被滴定 物间的化学作用或物理作用（例如一种有机分子吸附于固体表面）引 起的。 实验数据以热谱图形式表示，它提供了有关反应中物质的量（滴定终 点）和反应物质的特性（焓变）的数据。对图进行分析，可以得知反 应容器中发生的反应的类型和数目，以及溶液中存在的各物种的浓度 等信息。这部分内容称为热滴定，同时还可以确定反应的化学计量关 系，计算反应的热力学量,如平衡常数K(Δ G°)、标准状态下的焓变Δ H° 和熵变Δ S°,这部分内容称为滴定量热法。 测温滴定法以热效应为基础,与溶液的许多性质(如粘度、光学透明度、 介电常数、溶剂强度、以及离子强度等)无关,因此可以用于气相、液相、 非水溶液、有色溶液、胶体溶液和粘稠浆状等体系。
– 实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)， – 操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、 注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin软件分析 ITC得到的数据)。 – 测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还 可以进行后续生化分析。 – 尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异 性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规 律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。
等温滴定量热法
(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)
翟丽婷 2011-10-13
Isothermal Titration Calorimetry, ITC
等温滴定量热技术（ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何
等温滴定量热法
等温滴定量热法等温滴定量热法是由19世纪30年代以来，研究热力学热量的一种常用实验方法。
它是基于利用热力学原理、热质平衡原理，在恒定温度的条件下，通过定量的加热来确定物质在反应过程中所改变的热量。
本文将从热力学原理和实验室实践出发，对等温滴定量热法进行全面和系统性地介绍。
一、热力学原理热力学原理是等温滴定量热法的基础。
热力学是物理学的一个重要分支，研究各种形式的热能之间的转换和改变，以及它们在温度和压力下的变化。
它是可以用来研究物质及其化学反应过程中，物质在实验室中的反应性及其根本特性的理论。
根据热力学的第一定律质量-能量守恒定律，在恒定温度下，物质在化学反应过程中总的能量变化等于反应的热量变化。
测量热量的变化，可以用来研究物质的组成和其化学反应的机制。
二、有关实验室实践等温滴定量热法在实验室实践中，需要准备一套热量测试仪器，包括热电阻、浴槽、滴定秤、恒温槽等，滴定秤用来称取两种物质，一种是反应物，另一种是被测物质，热电阻用来监测温度变化，浴槽用来盛装反应液，恒温槽用来调节温度，保证反应过程恒定温度进行。
在实验室实践中，以滴定的方式将物质添加到浴槽中，测量温度变化并记录其变化值；当物质反应完毕时，根据温度变化值可以求出反应热量值；通过热力学原理，可以推断反应机制以及分析物质的特性。
三、实验结果等温滴定量热法被广泛用于材料的加热和热分析研究，以此用来研究物质的组成及其反应的机制。
实验结果表明，等温滴定量热法可用于精确测量反应中所改变的热量；与其他测定热量的方法相比，具有灵敏及准确的特点，可以提供准确的热量测定结果。
四、总结等温滴定量热法是一种依据热力学原理和恒定温度，运用实验仪器测量反应过程中物质热量变化的实验方法。
等温滴定量热法是一种准确性很高的热量测定方法，给研究材料的反应机制和特性提供了可靠的依据。
ITC
等温滴定量热法（ITC）是用于量化研究各种生物分子相互作用的一种技术。
它可直接测量生物分子结合过程中释放或吸收的热量。
ITC是唯一一种能够在一次试验中同时确定所有结合参数的技术。
ITC可以测定结合配偶体在自然状态下的亲和力，无需通过荧光标记或固定化技术对结合配偶体进行修饰。
通过测量结合过程中的热传递，就能够准确地确定结合常数（K D）、反应化学量（n）、焓（∆H）和熵（ΔS）。
这就提供了有关分子相互作用的完整热力学信息。
ITC不仅可测定结合亲和力，还能阐明潜在分子相互作用的机制。
更深入了解结构－功能关系，让我们能够更加自信地在苗头化合物选择和先导化合物优化方面作出决策。
用途获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数、结合位点数、摩尔结合焓、摩尔结合熵、摩尔恒压热容，和动力学参数（如酶活力、酶促反应米氏常数和酶转换数）。
测量原理：等温滴定量热法用来测定各生物分子之间的反应。
该方法可测定结合亲和力、化学计量以及溶液中结合反应的熵和焓，无需使用标记。
发生结合时，热不是被吸收就是被释放，这是在配体被逐渐滴定到包含目标生物分子的样品池过程中通过灵敏量热计而测得。
热核心微量热计中有两个池，其中一个含有水，作为参比池，另一个含有样品。
微量热计必须使这两个池保持完全相同的温度。
热敏装置检测发生结合时两个池之间的温差，并反馈给加热器，由加热器来补偿该温差并使两个池恢复到相同的温度。
进行测量参比池和样品池被设定到所需的实验温度。
将配体装入一个非常精确的注射装置上的注射器中。
将注射装置插入包含目标蛋白质的样品池中。
将一系列小份配体试样注入到蛋白质溶液中。
如果有配体与蛋白质结合，则可检测到并测出几百万分之一摄氏度的热量变化。
进行第一次注射时，微量热计测量被释放的所有热量，直到结合反应达到平衡。
测得的热量与结合量成正比。
结果和数据分析在下面的示例中，反应是放热的，这就意味着样品池温度高于参比池并由此导致信号出现下行波峰。
等温滴定量热法
等温滴定量热法
等温滴定量热法是一种非常重要的实验方法，它可以用来测量溶液中温度与单位时间内所吸收的热量之间的关系。
自发明以来，它已经成为热力学实验中的一种重要方法，并在诸如热力学、物理化学等学科中得到广泛应用。
等温滴定量热法是一种相对简单的实验方法，它需要根据温度上升和下降的情况，来衡量溶液中的热量吸收情况。
它的实验原理是：在一段时间内，将溶液放置在可控温度的实验箱中，当温度提高时，溶质被溶液吸收的热量会比温度降低时要大，从而可以测量热力学的参数。
等温滴定量热法是一种比较常用的热力学实验方法，它不仅能够测量某一特定溶液的吸热或放热情况，而且可以用于测量热力学参数，如比热容、汽化温度、沸点等。
等温滴定量热法是一种比较有效的实验方法，它的测量结果可以反映出物理化学的实际状况。
它的实验过程比较简单，可以在室温下完成，而且测量的精确度很高，因此在化学、物理、热力学等学科中得到了广泛应用。
另外，等温滴定量热法在现代化工程中也得到了广泛应用。
比如，它可以用来测量热负荷和用于进行蒸汽锅炉安全运行时的安全参数，也可以用于溶剂萃取、蒸发空气冷却、热交换量的测量等，以及热分析中的热容量、热导率和热稳定性的测定等。
因此，等温滴定量热法是实验测量技术中的一种重要方法，它可以用来测量某一特定溶液的吸热或放热情况，以及热力学参数，如比
热容、汽化温度等。
它的简单性、精确度和准确性使其在化学、物理、热力学等学科中非常具有重要的意义，也使得它在现代化工程中得到了广泛的应用。
等温滴定量热技术
等温滴定量热技术等温滴定量热技术是一种能够研究溶解热、反应热、吸附热等反应热效应的实验技术，它可以定量测定物质的热化学性质，包括热力学参数、化学反应动力学参数等，是化学和材料学等领域重要的实验手段。
等温滴定量热技术的基本原理是利用微量热法，即将被测样品在等温条件下加入到反应池中，在一定时间间隔内持续注入滴定液，从而发生显著反应，这种反应释放或吸收能量，导致反应体系温度发生变化，采用高精度量热仪测量反应热效应，从而获得样品的热化学性质。
等温滴定量热技术主要分为平衡热量法和动态热量法两种方法。
平衡热量法是通过将反应池维持在等温状态，在一段时间内等待反应体系达到平衡状态，然后进行滴定，测量反应热量。
这种方法可以减小反应过程中外部因素的影响，同时也可以消除热失控导致的误差。
而动态热量法则是在滴定过程中，实时测量反应体系的温度变化，以获得较高的实验精度。
等温滴定量热技术具有以下优点：首先，利用等温条件进行反应，保证了反应的可重复性。
其次，在不需求外热量或热量损失的情况下，可以实现精确测量反应热，避免了因加热或冷却而导致的额外的误差。
最后，由于等温滴定量热技术对样品量非常少，因此可以进行昂贵或危险的试剂或实验条件下的实验。
应用等温滴定量热技术可以获得广泛的信息，例如热容、热力学参数、化学反应速率、表面化学结构和气体吸附等。
在实践中，等温滴定量热技术用于研究各种类型的化学反应，例如溶解、复分解、离子交换等。
它还可以应用于催化剂、生物大分子、纳米材料等重要领域的研究。
总之，等温滴定量热技术是一种非常强大的实验手段，它可以准确地测定物质的热化学性质，从而为学术研究和工业生产提供关键的信息。
随着技术的不断完善，这种实验技术将会发挥越来越重要的作用。
等温滴定量热法
等温滴定量热法等温滴定量热法是一种利用液体滴定量热时所产生的温度变化来测量液体的热容量的测试方法。
为了更准确的测量液体的热容量，需要采取一些特殊的措施来确保滴定量热和温度测量的准确性，这种方法被称为等温滴定量热法。
等温滴定量热法可以分为实验设备搭建和数据处理两部分。
实验设备搭建方面，需要将液体装入一个可以精确控制温度的容器中，容器需要覆盖一个透明的盖子，以便能够直接观察液体的变化情况。
接下来，需要设置一个精密的热量传感器，将其安装到液体容器上，用于记录每次滴定量热的时间和温度变化情况。
最后，还需要安装一个仪表，用于实时监测液体温度的变化，以便在进行滴定量热实验时能够准确控制温度。
数据处理方面，首先，要确定每次滴定量热的温度变化，并记录每次滴定量热的温度变化；其次，要确定液体的热容量，在这一步，会使用一种称为伊曼纽尔定律的理论，根据每次滴定量热的温度变化，来计算液体的比热容量，从而确定液体的热容量。
等温滴定量热法一般应用于测量液体的比热容量，如水、油、乙醇等，可以精确测量液体的比热容量，提供准确的数据。
这一测试方法有利于实验室和工厂中精准检测液体热容量，是利用物理原理来进行测试的经典实验方法。
此外，等温滴定量热法也常常被用来与其他测试方法进行比较。
比如，它可以与蒸发法进行比较，以对比两种测试方法在测量液体热容量时的准确性。
比较的结果通常会发现等温滴定量热法更加准确，这也说明该方法在测量液体热容量方面有着更广泛的应用价值。
综上所述，等温滴定量热法是一种灵活的、准确的测试方法，可以帮助实验室和工厂精确测量液体的热容量，这一测试方法在许多物理和化学实验中被广泛应用，也为人们提供了更多可能性来研究液体热容量的具体变化情况。
等温滴定量热法(ITC)
等温滴定量热技术摘要：生物大分子可以和很多配体特异性结合，当物质结合时，热量要么产生，要么吸收。
生物大分子与配体相互作用的定量描述需要确定反应过程中热力学参数的变化。
相互作用过程中产生的热量变化可以用量热计定量监测。
等温滴定量热技术（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何化学反应的热力学技术，它已经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法。
它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息，如结合常数（Ka）、结合位点数（n），结合焓（△H）、熵（△S）、恒压热容（△Cp）和动力学数据（如酶促反应的Km和kcat ）。
这些信息提供了生物分子相互作用的真实写照。
由于几乎所有的生化反应过程都有热量变化，所以ITC具有很广泛的应用，它可以应用于蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质折叠/去折叠、蛋白质-小分子相互作用、酶-抑制剂相互作用、酶促反应动力学、药物-DNA/RNA相互作用、RNA折叠、蛋白质-核酸相互作用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用、生物分子-细胞相互作用等方面。
关键字：等温滴定量热技术、相互作用、热力学商业化的测量生物分子相互作用热量的灵敏的量热计出现在上世纪80年代后期[1]。
从此这种技术被广泛应用。
在过去的20年中，等温滴定量热技术（ITC）成为研究相互作用的常用方法。
随着现代ITC仪器的发展，ITC更加灵敏、快速、易用。
分子识别是一个复杂的过程，是生命活动的基础。
生物分子识别过程需要结合反应的热力学参数来阐明。
等温滴定微量量热法可以直接定量检测滴定反应过程中的热量变化，确定反应的结合常数K B 、结合计量比（n）、反应焓变（∆H）、熵变（∆S）、恒压热容（△Cp）和动力学数据（如酶促反应的Km和kcat ）等热力学参数，用来表征生物分子间的相互作用。
ITC(等温量热滴定法)
GE Healthcare 公开技术质料
原始数据
ITC实验
积分结果
• 原始数据： 显示随着滴定进行，补偿加热丝补偿给样品池和参比池的热量速率差
• 积分结果： 将每次滴加所产生的热流差对时间进行积分，并以在对应时间点样品 池内反应物反应物的摩尔比为横轴 实线为最佳拟合曲线
ITC分析法能提供哪些信息？
ITC实验
ITC实验与反应的热力学信息
ITC曲线
ITC曲线积分分析结果
配体溶 液
某生物分 子溶液
逐次、等量滴加
I. 反应完成前：每次滴加 Æ一个ITC峰 随着反应进行，被测分
子逐步被配体饱和， ITC峰减小 II. 反应完成后：ITC峰稳 定，只有稀释热
GE Healthcare 公开技术质料
通过将原始ITC曲线积分， 可计算：
bound-NP cause LP gel-fluid
Proc. Natl. Ac18171–18175
因此，化合物X适于进一步研究
化合物X与TP的ITC结果
GE Healthcare 公开技术质料
ITC应用举例
软凝聚态物理：纳米颗粒（NP）与脂质体（LP）的作用研究
酸性NP + 流动相LP
碱性NP + 凝胶相LP
ITC应用举例
药物研发早期阶段对假正面结果的排除 化合物Y，是否与目标蛋白TP有特异性结合？
与TP（左）：
KD = 120 nM, 但∆H异常（高出103倍） n = 0.01 过低
因此研究Y与BSA作对比 与BSA（右）： KD，∆H，n 均同Y与TP 的接近
与TP
与牛血清白蛋白BSA
Æ Y与TP无特异性结合，不适于进一步研究
等温滴定量热法
等温滴定量热法(I T C)的简易操作流程：①样品的准备，包括滴定物与被滴定物(如DNA滴定蛋白质)。
a.实验前的蛋白质样品需用缓冲溶液透析(注意透析袋的正确使用)，透析时间一般为24小时，buffer体积为1L，且中途注意更换buffer，其目的是为了减少由于溶液组成不同而产生的滴定误差；b.样品的浓度要求，一般要求的浓度为微摩尔级，且滴定物(DNA)的浓度是被滴定物(蛋白质)的十倍左右为宜，且实验前需要再次确认所配样品的浓度是否符合要求；c.在进行滴定实验前，用于空白对照的缓冲液，蛋白样品以及DNA均需抽真空除气泡(15Mins左右为宜)。
②仪器的清洗。
a.在进行真空除气泡前，除气泡用容器均需用超纯水清洗三次左右，且清洗完毕后擦干内壁，防止由于残留缓冲液的稀释而导致样品浓度的改变；b.样品池(sample cell)的清洗，用超纯水清洗15次左右(每次2ml左右)，清洗完毕后，一定要将残留的超纯水吸干净；c.注射器(syringe)的清洗，用超纯水清洗3次以上(专用注射器清洗,此时无需点击open,close和purge选项)，清洗完毕后将注射器的头部擦干，之后清洗装DNA 的小试管，步骤同注射器的清洗。
③设置空白对照试验（DNA滴定缓冲液），将缓冲液置于小试管中(为了防止空气的进入，一般添加样品的量大于其实际所需的量)，打开控制界面，点击open之后，用手动注射器缓慢拉动活塞，此时注射器管中的液面上升，然后点击close, 注射器会自动将小试管中的缓冲液吸入注射器中，当缓冲液完全吸入注射器之后点击pump键，除去气泡；在清洗样品池的同时就设置所需的实验温度（套管温度，一般较反应温度稍低），并输入样品的实际浓度以及实验数据文件名和储存路径等一系列参数（如注射时间，注射次数，注射间隔时间）。
④设置滴定实验，步骤同空白试验，只需将样品池中用于空白对照的缓冲液换成蛋白样品同时修改文件名(先准备样品池中的样品，后准备注射器中的样品)。
等温量热滴定法
滴定量热法也称热滴定法或测温滴定法。
是一种量热或分析技术，即用一种反应物滴定另一种反应物，随着加入滴定剂的数量的变化，测量反应体系温度的变化。
滴定一般在尽可能接近绝热的条件下进行，被滴定物可以是液体或悬浮的固体；滴定剂可以是液体或气体。
温度变化是由滴定剂与被滴定物间的化学作用或物理作用（例如一种有机分子吸附于固体表面）引起的。
实验数据以热谱图形式表示，它提供了有关反应中物质的量（滴定终点）和反应物质的特性（焓变）的数据。
对图进行分析，可以得知反应容器中发生的反应的类型和数目，以及溶液中存在的各物种的浓度等信息。
这部分内容称为热滴定，同时还可以确定反应的化学计量关系，计算反应的热力学量,如平衡常数K(ΔG°)、标准状态下的焓变ΔH°和熵变ΔS°,这部分内容称为滴定量热法。
测温滴定法以热效应为基础,与溶液的许多性质(如粘度、光学透明度、介电常数、溶剂强度、以及离子强度等)无关,因此可以用于气相、液相、非水溶液、有色溶液、胶体溶液和粘稠浆状等体系。
图1为滴定量热计框图。
滴定管内含有一种反应物的滴定剂，可加入到反应容器内，滴定剂的浓度一般为被滴定液的数十倍甚至一百倍左右。
反应产生的温度变化由温度传感器（例如热敏电阻）感知，通过惠斯通电桥电路转换为相应的伏特数或热功率。
这个伏特数由放大电路放大并记录于记录仪上，或者馈入其他的数据采集系统。
反应容器和滴定管置于同一恒温浴中，恒温浴温度由温度控制器控制，并由温度传感器测量。
滴定剂和反应容器的温度必须相等，或者它们之间的温差必须精确知道。
滴定剂的加入方式①连续加入法：滴定剂以恒速加入，可以得到滴定进程中热效应的完整记录。
对于特别复杂的反应，可以从这种记录图中选择任意数目的数据点，用于必要的计算。
连续滴定法要求对温度变化的响应必须够快，并且此法只适用于快速反应。
②分次递增加入法：间歇地每次加入单位增量的滴定剂，在每次加入单位增量前，必须调节反应容器的温度，使回复到起始温度，通过加入许多次增量，也能够得到足够的测量数据，从而绘制成与连续法相似的图线。
等温滴定量热法样本量
等温滴定量热法样本量等温滴定量热法是一种常用的实验方法，用于测定化学反应的热效应。
它通过在恒温条件下，将试剂溶液滴入反应池中，测定反应过程中释放或吸收的热量，从而求得反应的热效应。
在使用等温滴定量热法时，样本量是一个重要的考虑因素。
样本量的选择应该根据实验需求和反应的特性来确定。
如果反应的热效应较大，样本量应该适当减小，以保证实验的精确度。
相反，如果反应的热效应较小，样本量可以适当增加，以提高实验的灵敏度。
样本量的选择还要考虑到反应速率和反应的平衡性。
对于反应速率较快的反应，样本量应该适当减小，以使反应能够在短时间内完成。
而对于反应平衡性较差的反应，样本量应该适当增加，以保证反应能够达到平衡状态。
在实验过程中，样本量的准确控制也是非常重要的。
一方面，样本量的准确称量可以保证实验的精确度。
另一方面，样本量的准确控制可以避免试剂的浪费，提高实验的经济性。
为了准确控制样本量，可以采用各种方法。
常见的方法包括使用精密天平进行称量、使用容量瓶进行定容稀释等。
在进行样本量的控制时，还需要注意去除空气泡的影响，以保证实验的准确性。
除了样本量的控制，实验中还需要注意其他一些因素的影响。
比如，实验过程中的温度控制、试剂的纯度和浓度、反应容器的选择等。
这些因素都可能对实验结果产生影响，需要在实验中予以考虑。
总结一下，等温滴定量热法是一种常用的实验方法，用于测定化学反应的热效应。
在进行实验时，样本量的选择是一个重要的考虑因素。
样本量的选择应该根据实验需求、反应特性、反应速率和反应的平衡性来确定。
在实验过程中，还需要注意其他一些因素的影响，以保证实验的准确性和精确度。
通过合理选择和控制样本量，可以得到准确的实验结果，从而对化学反应的热效应进行研究和分析。
等温滴定量热法 知乎
等温滴定量热法知乎以等温滴定量热法为标题，我们来探讨一下这种方法在热学领域中的应用。
等温滴定量热法是一种用于测量物质热化学反应热效应的实验方法。
它基于热力学第一定律，即能量守恒原理，通过测量反应体系的温度变化来计算反应的热效应。
这种方法广泛应用于化学、生化、制药等领域，对于热效应的研究和反应动力学的分析具有重要意义。
在等温滴定量热法实验中，首先需要准备好反应体系。
通常，我们会准备两种溶液，一种为反应溶液，另一种为滴定溶液。
反应溶液中含有待测物质，而滴定溶液中含有一种已知浓度的试剂。
然后，我们会将这两种溶液分别放入两个反应容器中，并将它们放入等温反应釜中。
在实验开始之前，我们需要对等温反应釜进行校准。
校准的目的是确定釜内温度与外部温度计测得温度之间的关系，以保证实验数据的准确性。
校准过程中，我们会将一定量的热量输入到等温反应釜中，然后测量釜内温度的变化。
通过对比输入的热量与温度变化的关系，我们可以建立起一个温度矫正曲线，以便后续实验中对温度进行修正。
实验开始后，我们会通过滴定器将滴定溶液缓慢滴加到反应溶液中。
滴定过程中，我们会实时测量反应体系的温度变化，并记录下来。
由于反应过程中会有热量的吸收或释放，所以反应体系的温度会发生相应的变化。
通过测量反应体系的温度变化，我们可以计算出反应的热效应。
在计算反应热效应时，我们需要考虑到滴定溶液滴加到反应溶液中所释放的热量。
通常，我们会将滴定溶液中的试剂的热效应事先测定好，并在计算中进行修正。
同时，我们也需要考虑到反应体系的热容量，以保证计算结果的准确性。
通过等温滴定量热法，我们可以得到反应的热效应，即反应在等温条件下释放或吸收的热量。
这对于研究化学反应的能量变化、发展新的化学反应或评估化学反应的可行性都具有重要意义。
此外，等温滴定量热法还可以应用于制药领域，用于药物热效应的研究和药物配方的优化。
等温滴定量热法是一种常用的实验方法，用于测量化学反应的热效应。
通过测量反应体系的温度变化，我们可以计算出反应的热效应，并对反应进行深入分析。
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典型的ITC数据
配体溶液20次注射到ITC池的 蛋白溶液中。每个注射峰（上 图）下方的区域与注射所释放 的总热量相等。当这种综合的 热量相对添加到池中的配体摩 尔比作图时，就获得了相互作 用的完整结合等温线（下图）。 用单位点模型来验证数据。化 学计量、结合常数及焓的数值 都显示在框内。
它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一
个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动 力学信息，它已经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法。
可获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数（Ka）、 结合位点数（n）、摩尔结合焓（△H）、摩尔结合熵（△S）、摩尔恒 压热容（△Cp），和动力学参数(如酶促反应的Km和kcat）
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INS
– 实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)， – 操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、 注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin软件分析 ITC得到的数据)。 – 测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还 可以进行后续生化分析。 – 尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异 性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规 律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。
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ITC系统是通过细胞反馈网络 CFB来分别测量或者补偿样品和对照由于反应所产 生或者吸收的热量。两个硬币状的东西放置在绝热的圆筒中，通过那个细细的 管子与外界联通。有两个热量检测装置。一个用来检测两个样品之间的热量差， 另一个检测对照和环境的热量差。当样品中发生化学反应的时候，释放或者吸 收热量，因此样品和对照的温度差会通过对样品进行增加或者减少热量而稳定 在一个水平，就是baseline。因此那些用来维持Δ T1=常数的热量就被系统检 7 Page 7 测画作曲线。
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滴定一般在尽可能接近绝热的条件下进行，被滴定物可以是液体或悬 浮的固体；滴定剂可以是液体或气体。温度变化是由滴定剂与被滴定 物间的化学作用或物理作用（例如一种有机分子吸附于固体表面）引 起的。 实验数据以热谱图形式表示，它提供了有关反应中物质的量（滴定终 点）和反应物质的特性（焓变）的数据。对图进行分析，可以得知反 应容器中发生的反应的类型和数目，以及溶液中存在的各物种的浓度 等信息。这部分内容称为热滴定，同时还可以确定反应的化学计量关 系，计算反应的热力学量,如平衡常数K(Δ G°)、标准状态下的焓变Δ H° 和熵变Δ S°,这部分内容称为滴定量热法。 测温滴定法以热效应为基础,与溶液的许多性质(如粘度、光学透明度、 介电常数、溶剂强度、以及离子强度等)无关,因此可以用于气相、液相、 非水溶液、有色溶液、胶体溶液和粘稠浆状等体系。
等温滴定量热法
(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)
翟丽婷 2011-10-13
Isothermal Titration Calorimetry, ITC
等温滴定量热技术（ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何
化学反应的热力学技术，即用一种反应物滴定另一种反应物，随着加 入滴定剂的数量的变化，测量反应体系温度的变化
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Applications include:
Characterization of molecular interactions of small molecules Lead optimization. Enzyme kinetics.
Assessment of the effect of molecular structure changes on binding mechanisms.
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独特特点：
– 它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即 具有非特异性的独特优势，
– 样品用量小，方法灵敏度和精确度高(仪器最小可检测热功率2 nW，最小可 检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 ℃ - 80 ℃，滴 定池体积(1.43 ml)。
ITC提供了（△G）以及（△H） 和（△S），产生了结合机理的真 实图像。
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ITC：用生物相关模型系统架起桥梁
ITC的关键优势之一是创建生物相关实验的独特能力。再没有其他技术 能提供完全无标记且液相的分析环境，同时无需靶点高分子或配体的固 定。ITC的应用在相关模型生物系统的建立和验证中起了重要的作用。
Assessment of biological activity.
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在恒温下，注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。当配体 注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比。当池中的 高分子被配体饱和时，热量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。
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10ITC法测量结合/解离常数
ITC可以直接测量焓变△H，结合常数Ka，而不对反应体系产生影响，也不引 12 Page 12 入修饰基团，因此测得的结果更加可信
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作用机理研究与分析开发
（△G）与总的结合亲和力直接 相关，但不能了解结合机理。