酶联免疫吸附试验

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酶和底物：主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶，还有 β-半乳糖苷酶、尿酶等。
1. 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP) 应用最广泛。是从辣根菜中提取的酶类，由糖 蛋白和辅基（含铁血红素）构成，辅基为酶活性中心所在，在 403nm 波长处有最大吸收峰，糖 蛋白在 275nm 波长有最大吸收峰，故用 A403nm 与 A275nm 比值代表纯度（reinheir zahl,RZ）。 用于酶免疫技术的 HRP，其 RZ 值应大于 3.0。但注意酶纯度不代表酶活力，酶变性后，RZ 不变 但活力下降。
基本原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物， 再用酶标二抗(针对受检抗体的抗体，如羊抗人 IgG 抗体)与固相免疫复合物中的抗体结合，形成 固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。 【操作步骤】
竞争法 ELISA 可用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行检测。 方法和特点: ①酶标记抗原（抗体）与样品或标准体中的非标记抗原或抗体具有相同的与固相抗体 （抗原）结合的能力 ②反应体系中，固相抗体（抗原）和酶标抗原（抗体）是固定限量，且前者的结合位 点少于酶标记与非标记抗原（抗体）的分子量和 ③免疫反应后，结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原（抗体）的量（酶活性） 与样品或标准品中非标记抗原（抗体）的浓度成反比
免疫吸附剂的制备
免疫吸附剂的制备（点击播放）
免疫吸附剂的制备：固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂，将抗原或抗体固相化的过程称为包被 (coating)，若以聚苯乙烯为载体，包被方法是：将抗原或抗体溶于缓冲液（最常用的为 pH9.6 的 碳酸盐缓冲液）中， 加入 ELISA 板孔中在 4℃过夜后甩弃孔内液体，用洗涤液清洗即可。如果 包被液中蛋白浓度过低，固相载体表面不能被此蛋白完全覆盖，其后加入的血清标本和酶结合物 中的蛋白也会部分地吸附于固相载体表面，最后产生非特异性显色而导致本底偏高。在这种情况 下，如在包被后再用 1%～5%牛血清白蛋白包被一次，可以消除这种干扰。这一过程称为封闭 (blocking)。
2. 碱性磷酸酶（alkaline phospharase,AP） 可从大肠杆菌或小牛肠粘膜中提取，敏感性高，空 白值低。
AP 不溶性底物：
① 硝基蓝四氮唑（NBT）和 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸（BCIP）混合液，是 AP 最敏感的底物，呈紫色； ② 坚牢红和萘酚 ASMX 混合液，呈红色
AP 可溶性底物一般采用对硝基苯磷酸酯（P-nitrophenyl phosphate,P-NPP），产物呈黄 色，测定波长为 405nm。
① 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ② 使抗原或抗体与某重酶连接成酶标抗原或抗体，且既保留其免疫活性又保留酶的活性。 ③ 标本中的抗原或抗体、标记抗原或抗体能按一定的次序与固相载体表面的抗体酶免疫技术的分类：
一、按检测对象的不同一般分为两类：
酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)的基本原理
方法类型及反应原理、试剂制备和临床意义
酶免疫技术是三大经典标记免疫技术之一，是以酶标记抗体或抗原为主要试剂的一种标记免 疫分析技术。随着相关新技术的不断问世，如杂交瘤单克隆抗体技术（使各种对抗原决定簇高度 特异的单克隆抗体可以在体外批量生产）、生物素－亲和素放大系统的应用以及与化学发光和电 化学发光技术的偶联等，明显地提高民分析和测定方法的特异性、灵敏度及其自动化程度，使酶 免疫技术不断更新，应用范围不断拓宽。当前，酶免疫技术已与形式各异、各具特点和用途的定 位、定量和超微量测定的标记免疫分析技术融合发展，在医学和生物学中的应用日益广泛，是取 代放射免疫技术的主要方法之一。
HRP 的底物有可溶性和不溶性两种。
不溶性底物用于酶免疫组化技术：
① 3，3`-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB），显色时呈棕黄色；
② 3-氧基-9-乙基卡唑，呈红色； ③ α-萘酚；④ 4-氯-1-萘酚，呈灰蓝色；
可溶性底物用于酶免疫测定技术：
① 邻苯二胺（OPD），呈橙红色，测定波长为 492nm，敏感性高，颜色稳定可维持数小时，对光敏感； ② 四甲基联苯胺（TMB），呈黄色，测定波长为 450nm； ③ 5-氨基水杨酸（5-ASA），呈棕色，测定波长为 550nm；
1.酶免疫组织化学技术（enzyme immunohisto chemistry,EIH）: 用于检测组织切片或细胞涂片中 的抗原或抗体。
2.酶免疫测定技术(enzyme immunoassay,EIA): 用于检测体液样本中可溶性抗原或抗体。
二、根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的和游离的酶标记物，可分为： 1. 均相法（homogenous）：不需要分离结合和游离的酶标记物，直接进行测定。 2. 异相法(heterogenous)：需要分离结合和游离的酶标记物后才能进行测定。
双抗原夹心法，属于非竞争结合测定。它是检测抗体的 ELISA。 工作原理是：利用连接于固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子上两个抗
原结合位点结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗原免疫复合物。由于反应系统中固相抗原和酶标抗 原的量相对于待测抗体是过量的,因此复合物的形成量与待测抗体的含量成正比(在方法可检测 范围内)。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD 值)，即可确定待测抗体 含量。若采用固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合，则是双抗原夹心 法。 双抗原夹心法 - 操作步骤：
2. 固相载体的常规检查：以一定浓度的人 IgG（一般为 10ug/L）包被 ELISA 各孔后，每孔加 入适当稀释的酶标抗人 IgG 抗体，按 ELISA 的操作步骤进行保温、洗涤、显色、终止反应，测 定每孔的吸光度，计算平均值和 CV%，CV%应小于 10%。
抗原和抗体 抗原和抗体：要求抗原纯度高，抗体效价高、亲和力强。
⑴ 将特异性抗原包被固相载体。孵育一定时间，使形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原和 杂质。
⑵ 加待检标本，孵育，使标本中的抗体与固相载体上的抗原充分反应，形成固相抗原抗体复 合物。洗涤除去其他未结合物质。
⑶ 加酶标抗原，孵育，使形成固相抗原-待测抗体-酶标抗原夹心复合物。洗涤除去未结合酶标 抗原。
⑷ 加底物显色。固相上的酶催化底物产生有色产物,通过比色,测标本中抗体的量。 间接法 此法是测定抗体最常用的方法,属非竞争结合试验。
的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比(在方法可检测范 围内)。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD 值)，即可确定待测抗原含 量。 若固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同的抗原决定簇结 合，则属于双位点夹心法。若采用固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结 合，则是双抗原夹心法。 【操作步骤】
酶免疫技 术
酶免疫组 化
酶免疫测 定
均相酶免疫测定 固相酶免疫测定
异相酶免疫测定 液相酶免疫测定
必备试剂：
① 固相抗原或抗体------免疫吸附剂 ② 酶标记的抗原或抗体------酶结合物 ③ 酶反应的底物------底物
酶联试剂
阳性对照
酶标记物
显色液 A
终止液
反应板
显色液 B 浓缩洗涤液 加样枪与吸头 阴性对照
酶标记物的制备
酶标记物的制备：抗原由于化学结构的不同，可用不同的方法与酶结合，如为蛋白质，可参照 抗体酶标记的方法，酶标记抗体的制备一般用戊二醛法和过碘酸盐法。
1. 戊二醛法：戊二醛是一种双功能团的交联剂，分别与酶分子和免疫球蛋白分子上的氨基结 合。戊二醛交联可用一步法（如连接 AP），也可用二步法（如连接 HRP）。
【操作步骤】
捕获法
捕获法（亦称反向间接法）ELISA，主要用于血清中某种抗体亚型成分（如 IgM）的测定。以 目前最常用的 IgM 测定为例，因血清中针对某种抗原的特异性 IgM 和 IgG 同时存在，则后者可 干扰 IgM 的测定。
工作原理：先将针对 IgM 的第二抗体（如羊抗人 IgMµ 链抗体）连接于固相载体，用以结合（“捕 获”）样品中所有 IgM（特异或非特异），洗涤出去 IgG 等无关物质，然后加入特异抗原与待检 IgM 结合；再加入抗原特异的酶标抗体，最后形成固相二抗- IgM-抗原-酶标抗体复合物，加酶 底物作用显色后，即可对样品中待检 IgM 是否存在及其含量进行测定。
⑴ 一步法：将 2～5mg 纯抗体与 5mgAP 混合于 0.1mol/L pH 6.8 的磷酸盐缓冲液 1ml 中，4 ℃下用同上缓冲液透析平衡。磁力搅拌下加入 1%戊二醛 0.05ml，在室温下放置 2h，在 4℃下用 0.05mol/L pH 8.0 Tris 缓冲液透析平衡，即可。
⑵ 二步法：第一步将过量的戊二醛与酶反应，使酶仅与戊二醛结合；第二步是除去多余的戊 二醛分子，加入免疫球蛋白，使球蛋白上的氨基与已结合酶的戊二醛分子上的另一活性基团结合， 形成一分子酶和一分子免疫球蛋白结合物。
酶免疫技术的特点
酶免疫技术是以酶标记抗原或酶标记抗体为主要试剂，通过复合物中的酶催化底物呈色而对被 测物进行定性或定量的标记免疫技术。
基本原理是：将酶与试剂抗原或抗体用交联剂结合起来，此种酶标记抗原或抗体与标本中相应 抗体或抗原发生特异反应，并牢固结合，在加入相应的酶的底物时，底物被酶催化生成呈色产物， 在免疫组化染色时可指示待测反应物的存在和定位，在酶免疫测定中，则可根据呈色物的有无和 呈色深浅作定性或定量观察。由于此技术是建立在抗原抗体反应和酶的高效催化作用的基础上， 故而该技术具有检测灵敏度高、特异性强、准确性好等特点，而且，可与其他技术偶联而衍生出 适用范围更广的新方法。
双抗体夹心法，属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用的 ELISA，适用于检测分子中具有 至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。