荧光原理
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荧光技术原理及应用
陶 亮
中山医学院药理学教研室
光的基本知识
一、光的本质：光是一种可见的电磁波，是能量的辐射形式 光的波长越长，光子的能量越小 光波 γ射线 X线 远紫外 紫外 可见光 红外 远红外 微波 无线电波 波长 10-5～10-3nM 10-4～0.1nM 10 ～20nM 200～400nM 400～760nM 0.76～50μM 50～1000μM 0.1～100cM 1～100M
荧光染料的发展简史
1838年 1852年 1903年 1911年 1935年 Brewster首次描述了荧光现象 Stokes发现并描述荧光物质（荧光染料） Wood设计出可选择透过紫外光的滤光片 Reicherl发明荧光显微镜 Haitinger 将荧光物质用于固定的细胞和 组织，活细胞染色
新的荧光探针，新的检测技术不断出现
化学荧光在有生命的生物体中产生 — 生物发光
无论那种荧光，其发光机理是相同的
3.荧光素(荧光物质，荧光染料，荧光探针)
—
能够产生荧光的化合物
发射荧光的光量子数 荧光效率= —————————— 吸收光的光量子数 反应物质将吸收的光能转变成荧光的效率—越大越好
荧光素的荧光效率>0.35
斯托克斯位移（Stokes shift）
• 物质在激发过程中吸收的能量，要高于荧光发射的能量。
• 荧光素的发射波长总是大于其激发波长。 • 两者的差值 — 斯托克斯位移（Stokes shift）； — 激发到发射过程中存在能量损失
hvEX— hvEM = 荧光效率
利用斯托克斯位移现象，分离激发光和发射光
4. 荧光素的性质
（1）激发光波长和发射光波长 激发光波长——近紫外区域，可见光区域 荧光素 发射光波长——可见光区域
GFP的应用：
GFP, CFP, BFP, YFP商品化质粒
1. 转基因动物: Green mouse
2. 外源基因的报告基因: 将外源基因与GFP DNA 相连, 可实时监测外源基因的表达.
3. 检测细胞能否表达某一基因: 将待测基因的启动子与 GFP DNA 相连, 可实时监测细胞能否表达兴趣基因.
Emission Spectrum
λ
EX
Wavelength
λ
EM
激发光谱和发射光谱的用途
激发光谱—确定荧光素适宜的激发波长的依据
最大激发波长 λEX
发射光谱—确定荧光素检测波长的依据
最大发射波长λEM
激发光谱和发射光谱可用来鉴别荧光物质 — 每一种荧光物质都有其特定的激发光谱和发射光谱
（3）荧光强度
4. GFP-蛋白融合技术: 将结构蛋白基因与GFP DNA 相 连可实时监测结构蛋白的表达亚细胞结构的形成
荧光检测仪器
1. 荧光分光光度计
用于大容积样本（ul,ml)的测量
2. 荧Βιβλιοθήκη Baidu显微镜（激光共聚焦荧光显微镜）
用于具有三维立体形状的样本（如细胞、组织切片等）的测量 荧光显微镜
激光共聚焦荧光显微镜
二. 细胞骨架荧光探针
F-肌动蛋白荧光探针— BONIPY FL, BONIPY 558/568 G-肌动蛋白荧光探针—DNase I+荧光素 Alexa Fluor 488 Oregon Green 488 Texas Red
微管蛋白荧光探针 —
秋水仙减+荧光素 DAPI DCVJ Bis-ANS Flutax-2 BODIPY FL Placlitaxel BODIPY 564/570 Placlitaxel
KCL诱导的细胞外Ca++内流测量
KCL
KCL
发射光波长 > 激发光波长
根据荧光素的激发光波长和发射光波长选择光源和滤光片
（2）激发光谱和发射光谱
荧光素的激发光谱和发射光谱反映了该荧光素的光化学性质
激发光谱 — 荧光素的荧光发射强度随激发光波长变化的光谱 吸收光谱
发射光谱 — 荧光素的荧光发射强度随发射光波长变化的光谱
Excitation Spectrum
荧光强度 —— 荧光素发射荧光的光量子数
决定荧光素检测的灵敏度
荧光素的荧光效率决定其荧光强度
（4）荧光寿命
荧光寿命（激发态寿命）—电子在激发态的平均停留时间
荧光寿命长 — 检测特异性和灵敏度高
（5）荧光漂白
荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失
—— 漂白 （6）自发荧光
组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光 — 自发荧光
光的吸收具有选择性 — 一定能量的光量子辐射只能被一定结构的物质吸收
滤光片— 吸收一定波长范围的光，允许特定波长的光通过
三.荧光的基本知识
（一）荧光 — 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为 高能状态，再回到低能状态时释放出的光
荧光是冷光，颜色为蓝、绿、红和黄色
2. 荧光产生的原理
由光激发的荧光 — 光致荧光 由化学反应引起的荧光 — 化学荧光 由X射线引起的荧光 — X射线荧光 由激光引起的荧光 — 激光荧光
荧光技术已用于整体、器官、细胞、分子水平生命现象的研究
常用的荧光染料（探针）
一. 细胞器荧光探针
—— 能渗透到细胞内，选择性地与细胞器结合的荧光物质。 可用于固定和活细胞细胞器的染色 线粒体荧光探针——JC-1, Rhodamine 123 溶酶体荧光探针——DAMP，Neutral Red 内质网荧光探针—— Dioc6(3),Dioc5（3）,Dioc16(3) 高尔基体荧光探针—— NBD Ceramide, BODIPY Ceramide
蓝色荧光
GFP
绿色荧光
GFP的特性与优点
GFP的特性： 1.GFP的光谱特性 — 最大激发波长— 460-490 nm 发射波长 — 500-550 nm 2. GFP的分子量小（20kDa）—当与其它蛋白组成融合蛋白 时，不影响结合蛋白的功能 GFP的优点： 1.可溶性蛋白，性质稳定 2.荧光强，易加工到其它蛋白质序列上 3.无进入细胞问题，标记可靠 4.表达GFP融合物的细胞，可在生活状态下进行实验和检测 5.对细胞无毒
微管选择性紫杉醇探针—
三.研究钙调节和活性的荧光探针
钙调蛋白荧光探针 — 钙的类似物三氯化忒
PKC荧光探针—用BODIPY标记的佛波酯或乙酰辅酶A荧光探针 Quin-2-AM 紫外光激活 Fura-2-AM Fura-3-AM — 可见光激活
钙离子荧光探针
三.核酸荧光探针
能以非共价键与DNA/RNA结合，用于DNA/RNA的定性、定量分析 SYTO AO Hoechst DAPI EB和PI PO-PRO和BO-PRO AAD ACMA
二. 光的性质：
粒子性 —— 光子（光量子） 波动性 —— 光沿直线传播，在与它前进方向垂直的平面内呈波形振动 波长 — 光的颜色 振幅 — 光的亮度
波长
波长长（频率低）— 光子能量小 波长短（频率高）— 光子能量大
振 幅
三. 光的吸收
光进入某物质后，部分或全部的光能可被物质的分子或原子 所吸收。 物质吸收能量后进入激发态，当物质从激发态回到基态时， 以电磁辐射的形式（或热）放出所吸收的能量——发射光。
3.流式细胞仪（FCM）
对处在快速直线流动细胞状态中的细胞或生物颗粒进
行快速定量分析和分选；用于把指定参数参量的细胞
亚群从整群细胞中分选出来。
4.小动物活体成像系统
对荧光素标记的生物分子和细胞在整体水平进行检测
活细胞内离子动态变化测量
可变换波长的荧光分光光度计 可变换波长的荧光显微镜 激光共聚焦显微系统
胞膜透过性核酸荧光探针 — 用于细胞染色
非透过性核酸荧光探针—用于DNA琼脂凝胶电泳
受体 酶
四. 其它荧光探针
生长因子
离子通道
等等……
绿色荧光蛋白（GFP）及其衍生物
1.GFP的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一
种水母发光蛋白 (aequoren)，该蛋白与钙和
肠腔素结合后可产生蓝色荧光。 Ca2+ Aequoren + 肠腔素 然而水母整体提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在 另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP）
陶 亮
中山医学院药理学教研室
光的基本知识
一、光的本质：光是一种可见的电磁波，是能量的辐射形式 光的波长越长，光子的能量越小 光波 γ射线 X线 远紫外 紫外 可见光 红外 远红外 微波 无线电波 波长 10-5～10-3nM 10-4～0.1nM 10 ～20nM 200～400nM 400～760nM 0.76～50μM 50～1000μM 0.1～100cM 1～100M
荧光染料的发展简史
1838年 1852年 1903年 1911年 1935年 Brewster首次描述了荧光现象 Stokes发现并描述荧光物质（荧光染料） Wood设计出可选择透过紫外光的滤光片 Reicherl发明荧光显微镜 Haitinger 将荧光物质用于固定的细胞和 组织，活细胞染色
新的荧光探针，新的检测技术不断出现
化学荧光在有生命的生物体中产生 — 生物发光
无论那种荧光，其发光机理是相同的
3.荧光素(荧光物质，荧光染料，荧光探针)
—
能够产生荧光的化合物
发射荧光的光量子数 荧光效率= —————————— 吸收光的光量子数 反应物质将吸收的光能转变成荧光的效率—越大越好
荧光素的荧光效率>0.35
斯托克斯位移（Stokes shift）
• 物质在激发过程中吸收的能量，要高于荧光发射的能量。
• 荧光素的发射波长总是大于其激发波长。 • 两者的差值 — 斯托克斯位移（Stokes shift）； — 激发到发射过程中存在能量损失
hvEX— hvEM = 荧光效率
利用斯托克斯位移现象，分离激发光和发射光
4. 荧光素的性质
（1）激发光波长和发射光波长 激发光波长——近紫外区域，可见光区域 荧光素 发射光波长——可见光区域
GFP的应用：
GFP, CFP, BFP, YFP商品化质粒
1. 转基因动物: Green mouse
2. 外源基因的报告基因: 将外源基因与GFP DNA 相连, 可实时监测外源基因的表达.
3. 检测细胞能否表达某一基因: 将待测基因的启动子与 GFP DNA 相连, 可实时监测细胞能否表达兴趣基因.
Emission Spectrum
λ
EX
Wavelength
λ
EM
激发光谱和发射光谱的用途
激发光谱—确定荧光素适宜的激发波长的依据
最大激发波长 λEX
发射光谱—确定荧光素检测波长的依据
最大发射波长λEM
激发光谱和发射光谱可用来鉴别荧光物质 — 每一种荧光物质都有其特定的激发光谱和发射光谱
（3）荧光强度
4. GFP-蛋白融合技术: 将结构蛋白基因与GFP DNA 相 连可实时监测结构蛋白的表达亚细胞结构的形成
荧光检测仪器
1. 荧光分光光度计
用于大容积样本（ul,ml)的测量
2. 荧Βιβλιοθήκη Baidu显微镜（激光共聚焦荧光显微镜）
用于具有三维立体形状的样本（如细胞、组织切片等）的测量 荧光显微镜
激光共聚焦荧光显微镜
二. 细胞骨架荧光探针
F-肌动蛋白荧光探针— BONIPY FL, BONIPY 558/568 G-肌动蛋白荧光探针—DNase I+荧光素 Alexa Fluor 488 Oregon Green 488 Texas Red
微管蛋白荧光探针 —
秋水仙减+荧光素 DAPI DCVJ Bis-ANS Flutax-2 BODIPY FL Placlitaxel BODIPY 564/570 Placlitaxel
KCL诱导的细胞外Ca++内流测量
KCL
KCL
发射光波长 > 激发光波长
根据荧光素的激发光波长和发射光波长选择光源和滤光片
（2）激发光谱和发射光谱
荧光素的激发光谱和发射光谱反映了该荧光素的光化学性质
激发光谱 — 荧光素的荧光发射强度随激发光波长变化的光谱 吸收光谱
发射光谱 — 荧光素的荧光发射强度随发射光波长变化的光谱
Excitation Spectrum
荧光强度 —— 荧光素发射荧光的光量子数
决定荧光素检测的灵敏度
荧光素的荧光效率决定其荧光强度
（4）荧光寿命
荧光寿命（激发态寿命）—电子在激发态的平均停留时间
荧光寿命长 — 检测特异性和灵敏度高
（5）荧光漂白
荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失
—— 漂白 （6）自发荧光
组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光 — 自发荧光
光的吸收具有选择性 — 一定能量的光量子辐射只能被一定结构的物质吸收
滤光片— 吸收一定波长范围的光，允许特定波长的光通过
三.荧光的基本知识
（一）荧光 — 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为 高能状态，再回到低能状态时释放出的光
荧光是冷光，颜色为蓝、绿、红和黄色
2. 荧光产生的原理
由光激发的荧光 — 光致荧光 由化学反应引起的荧光 — 化学荧光 由X射线引起的荧光 — X射线荧光 由激光引起的荧光 — 激光荧光
荧光技术已用于整体、器官、细胞、分子水平生命现象的研究
常用的荧光染料（探针）
一. 细胞器荧光探针
—— 能渗透到细胞内，选择性地与细胞器结合的荧光物质。 可用于固定和活细胞细胞器的染色 线粒体荧光探针——JC-1, Rhodamine 123 溶酶体荧光探针——DAMP，Neutral Red 内质网荧光探针—— Dioc6(3),Dioc5（3）,Dioc16(3) 高尔基体荧光探针—— NBD Ceramide, BODIPY Ceramide
蓝色荧光
GFP
绿色荧光
GFP的特性与优点
GFP的特性： 1.GFP的光谱特性 — 最大激发波长— 460-490 nm 发射波长 — 500-550 nm 2. GFP的分子量小（20kDa）—当与其它蛋白组成融合蛋白 时，不影响结合蛋白的功能 GFP的优点： 1.可溶性蛋白，性质稳定 2.荧光强，易加工到其它蛋白质序列上 3.无进入细胞问题，标记可靠 4.表达GFP融合物的细胞，可在生活状态下进行实验和检测 5.对细胞无毒
微管选择性紫杉醇探针—
三.研究钙调节和活性的荧光探针
钙调蛋白荧光探针 — 钙的类似物三氯化忒
PKC荧光探针—用BODIPY标记的佛波酯或乙酰辅酶A荧光探针 Quin-2-AM 紫外光激活 Fura-2-AM Fura-3-AM — 可见光激活
钙离子荧光探针
三.核酸荧光探针
能以非共价键与DNA/RNA结合，用于DNA/RNA的定性、定量分析 SYTO AO Hoechst DAPI EB和PI PO-PRO和BO-PRO AAD ACMA
二. 光的性质：
粒子性 —— 光子（光量子） 波动性 —— 光沿直线传播，在与它前进方向垂直的平面内呈波形振动 波长 — 光的颜色 振幅 — 光的亮度
波长
波长长（频率低）— 光子能量小 波长短（频率高）— 光子能量大
振 幅
三. 光的吸收
光进入某物质后，部分或全部的光能可被物质的分子或原子 所吸收。 物质吸收能量后进入激发态，当物质从激发态回到基态时， 以电磁辐射的形式（或热）放出所吸收的能量——发射光。
3.流式细胞仪（FCM）
对处在快速直线流动细胞状态中的细胞或生物颗粒进
行快速定量分析和分选；用于把指定参数参量的细胞
亚群从整群细胞中分选出来。
4.小动物活体成像系统
对荧光素标记的生物分子和细胞在整体水平进行检测
活细胞内离子动态变化测量
可变换波长的荧光分光光度计 可变换波长的荧光显微镜 激光共聚焦显微系统
胞膜透过性核酸荧光探针 — 用于细胞染色
非透过性核酸荧光探针—用于DNA琼脂凝胶电泳
受体 酶
四. 其它荧光探针
生长因子
离子通道
等等……
绿色荧光蛋白（GFP）及其衍生物
1.GFP的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一
种水母发光蛋白 (aequoren)，该蛋白与钙和
肠腔素结合后可产生蓝色荧光。 Ca2+ Aequoren + 肠腔素 然而水母整体提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在 另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP）