激光共聚焦显微镜样品制备51页PPT
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共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理ppt课件
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• 〔2〕多光束扫描
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• 奥林巴斯Fluo View300 激光共聚焦扫描系统
强度调整密度塔
激发发 射和射 柱准直 仪
光电倍增器
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ电源
双色镜
X-Y检流计镜扫描 控制器
激发和 发射滤 波滑动 器
出入口透 镜系统
;
同样可以实现 X—Z轴，Y—Z轴扫描
;
• 通常的方法是经过计算机控制的马达以预 先设定的步距挪动显微镜的镜台然后采集 图像。
配置照明效率低，而且扫描速度更快。其中旋 转盘扫描仪有数百个孔，其功能作为照明和探 测的针孔。由于磁盘扫描显微镜构成的实像， 可以直接位于CCD照相机的图像平面中。虽然 这方面的优势，它允许实时聚焦和成像的动态 过程，有几个缺陷限制了磁盘扫描共聚焦系统 的实践成效。其中最严重的是典型的依赖于传 统的广谱光源，和在磁盘发生极端的光损失。
共聚焦激光扫描荧光显微镜 〔LaserscanningConfocalMicrosco py，LSCM 〕
以激光作为光源，采用光源针孔 共与聚检焦系测统针孔共轭聚焦技术，对样本进 展细断胞层CT 扫描，以获得高分辨率光学切 片的荧光显微镜系统
;
荧光和荧光显微镜
一、荧光的根底术语 荧光物质：
488nm 520nm
双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。
488nm
520nm
阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490
;
450nm
490nm
FITC
荧光显微镜的缺乏:
1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实 现多重荧光的同时采集及共定位。
2.荧光散射光太强，呵斥实践分辨率的大大下 降。
3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。 4.无法对样品进展断层扫描,完成3D的任务。 5.滤镜对荧光信号衰减大,灵敏度—荧光强度
• 〔2〕多光束扫描
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• 奥林巴斯Fluo View300 激光共聚焦扫描系统
强度调整密度塔
激发发 射和射 柱准直 仪
光电倍增器
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ电源
双色镜
X-Y检流计镜扫描 控制器
激发和 发射滤 波滑动 器
出入口透 镜系统
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同样可以实现 X—Z轴，Y—Z轴扫描
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• 通常的方法是经过计算机控制的马达以预 先设定的步距挪动显微镜的镜台然后采集 图像。
配置照明效率低，而且扫描速度更快。其中旋 转盘扫描仪有数百个孔，其功能作为照明和探 测的针孔。由于磁盘扫描显微镜构成的实像， 可以直接位于CCD照相机的图像平面中。虽然 这方面的优势，它允许实时聚焦和成像的动态 过程，有几个缺陷限制了磁盘扫描共聚焦系统 的实践成效。其中最严重的是典型的依赖于传 统的广谱光源，和在磁盘发生极端的光损失。
共聚焦激光扫描荧光显微镜 〔LaserscanningConfocalMicrosco py，LSCM 〕
以激光作为光源，采用光源针孔 共与聚检焦系测统针孔共轭聚焦技术，对样本进 展细断胞层CT 扫描，以获得高分辨率光学切 片的荧光显微镜系统
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荧光和荧光显微镜
一、荧光的根底术语 荧光物质：
488nm 520nm
双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。
488nm
520nm
阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490
;
450nm
490nm
FITC
荧光显微镜的缺乏:
1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实 现多重荧光的同时采集及共定位。
2.荧光散射光太强，呵斥实践分辨率的大大下 降。
3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。 4.无法对样品进展断层扫描,完成3D的任务。 5.滤镜对荧光信号衰减大,灵敏度—荧光强度
激光共聚焦显微镜样品制备方法讲解
电子显微学报J.Chin.Eleetr.Microse.Soc.第29卷图I气体CO:冷冻装置。
Fig.1Gas C02frozen equipment.镜下操作后,置于干冰上(临时无干冰,也可置于一80℃冰箱,待冷冻完全后,将样品移至冷冻切片机中,温度平衡后,将样品从冷冻包埋模具中取出,进行冷冻切片。
冷冻包埋模具见图2。
图2冷冻包埋模具。
Fig.2Frozen embedding mold.液氮冷冻法:成年小鼠和大鼠的脑及稍大一些的组织块也可采用此方法冷冻。
将组织块置于样品台的OCT中,为防止组织块爆裂,先在液氮中迅速浸提几次,时间从1s开始逐渐增加,直至样品温度与液氮温度平衡,之后移至冷冻切片机中,使温度与切片机箱体温度一致,进行冷冻切片。
直接冷冻法:将样品直接粘着在涂有OCT的样品台上,于冷冻切片机(箱体温度在一20℃以下中直接冷冻。
3冷冻组织切片的免疫荧光标记将冷冻组织切片从一80℃冰箱中取出,室温放置10min,待切片回温并干燥,浸于PBS中10min 洗去OCT,可以无需Triton处理,即可进行免疫荧光抗体标记,操作步骤与培养细胞反应方法相同口]。
反应在避光湿盒中进行,反应结束时用无荧光封固剂封片,4oC保存。
先用荧光显微镜观察,确认标记成功,移至激光共聚焦显微镜扫描成像。
4荧光染料及荧光蛋白传统应用于荧光标记的染料如异硫氰酸荧光素(fluoreseinisothiocyanate,FITC,ex490nm/em520 nm、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC,ex550nm//em 620am、罗丹明(Rhodamine,ex560nm/em540~ 660nnl、四甲基罗丹明(tetramethyl rhodamine, TMR,ex570nm/em595—600nm、德克萨斯红(Texas red,ex592nm/em610rim、氨甲基香豆素(Aminomethylcoumarin aceticacid,AMCA,ex345 nm/em425am等,结合激光共聚焦显微镜技术的发展,这些经典的荧光染料逐渐被层出不穷的新的荧光染料所替代。
激光扫描共聚焦显微镜.完整版PPT资料
细胞膜静息膜电位容易与线粒体亲和，为线粒体膜电位探针
五.荧光漂白恢复(FRAP: Fluorescence Recover after
photobleaching）
%F
Intense laser Beam
Bleaches Fluorescence
20.00
0.00
200.00
Physiology Chart (Time: 11:40:49)
400.00
600.00
800.00
1000.00
1200.00
s
400.00
600.00
800.00
1000.00
1200.00
s
•程序化测量：用timelapse中的编程按钮可进行不同时间
•序列的扫描测量
测多个被标记物
Fluorescent Microscope Confocal Microscope
Arc Lamp
Laser
Excitation Diaphragm Excitation Filter
Ocular
Excitation Pinhole
Excitation Filter PMT
Objective
线粒体膜电位：-150mV
3D reconstruction
Bleaches Fluorescence
光学显微镜分辨率：0.
荧光能量共振转移的条件
•相对 测量
Channel 1
Int.
160.00
120.00
80.00
40.00
0.00
200.00
Channel 2
Int.
80.00
60.00
激光扫描共聚焦显微镜(研究生)1ppt课件
Pathway415、 Pathway435 800系列
CARVⅡ C1 TCS-SP2 FV300
FV1000 尼Ul康tra（Vnieikwo™n）C1-plus
IN Cell Analyzer 3000
TauMap
LSM 510 SYSTEM LSM 510 PASCAL SYSTEM
精选课件PPT
精选课件PPT
35
荧光光谱
精选课件PPT
36
精选课件PPT
37
分隔发射的荧光
精选课件PPT
38
Separation of fluorescence emissions by means of dichroic filters
精选课件PPT
39
（四）计算机系统
控制硬件的软件功能：
①控制电动显微镜； ②选择激光波长，调节激光强度； ③拍摄2-5维图像； ④选择光谱拍摄范围，分辨率，激发光 挡片位置。
（10）、可即时或延时进行扫描
ROI(region of interesting，感兴趣区域） 实时（real time）显示
（11）、有线和帧方式的多重扫描功能
精选课件PPT
27
（12）、在改变扫描分辨率及扫描速度等后，无 须很复杂地对仪器参数重新设置
（13）、有记忆功能
（14）、有专用的图象数据库 （15）、系统采用模块化设计，便于整个系统 的扩展和升级换代
有多种方式选择，支持盲法拆分，方便用户使用；
⑾具有专业的FRAP（荧光漂白），FRET（荧光能
量共振转移）软件包。 精选课件PPT
41
精选课件PPT
42
三、激光扫描共聚焦显微镜的使用步骤
（一）样品制备
激光共聚焦技术优秀课件
荧光样品的制备要求
荧光标记反应的特异性强、荧光定位准确 保持样品应有的结构形态完整性 荧光信号的响应准确、灵敏、具有可重复性 荧光强度适宜 荧光稳定性好 样品的荧光分布均匀 两种及两种以上的荧光信号之间荧光光谱交叉
可以消除 图象背景干净、干扰杂质少
荧光探针的种类及应用
原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚 细胞形态结构
图3-9 pA7-TTG1重组质粒酶切鉴定及PCR鉴定 酶切：重组质粒酶切产物；M：Marker DL 2000；PCR：重组质粒PCR产物
目的蛋白细胞器定位观察
含TTG1的瞬时表达载体转入洋葱表皮细胞
(1)将提取好的的含有目的基因的瞬时表达载体以及pA7-GFP载体约20 μL分别 加入1.5 mL离心管中，分别加入500 μL的蒸馏水，两管分别标号P1，P2。 (2) 分别取4片约1.5 cm*1.5 cm大小的洋葱表皮放入P1，P2。 (3)将P1，P2管管盖打开，用封口膜将其封上，扎两到三个小孔。 (4)将P1，P2管进行抽真空，抽到刚刚沸腾为止，一共抽三次。 (5)取MS培养基并在其上铺上一层滤纸。 (6)取出P1，P2管中的洋葱表皮，将其铺在MS培养基的滤纸上，加少量的水 培养16小时。
激光共聚焦显微镜基本操作
获取共焦图像的步骤
在 VIS 模式中观察样品 装入 LSM 配置 扫描图像 保存图像
不同厚度光切图像
Z轴扫描
Z轴扫描、时间系列扫描
时间系列扫描
Z轴扫描＋时间系列扫描
组织和细胞样品中荧光的来源
自发荧光 荧光染色 免疫荧光－荧光抗体法产生荧光 外源性荧光物质进入组织细胞内产生荧光 酶致荧光
成为形态学、分子细胞生物学、神经 科学、药理学和遗传学等领域中新的 有力研究工具。
《激光共聚焦简化》课件
显微镜设置与校准
激光器选择
根据所使用的荧光染料选 择适当的激光器波长。
滤色片配置
选择合适的滤色片以减少 背景噪声并提高信噪比。
校准与调整
确保显微镜的焦距、放大 倍数和视野等参数设置正 确，以便获得清晰的图像 。
图像采集与处理
采集模式选择
图像处理
根据观察需求选择单帧采集、多帧平 均或实时扫描模式。
技术培训
参加相关技术培训，提高操作和维护显微镜的能 力。
05 案例展示与解析
细胞生物学研究案例
细胞骨架结构观察
利用激光共聚焦显微镜技术观察细胞 骨架的动态变化，解析细胞生长、分 裂和迁移过程中的骨架重构过程。
细胞器定位与功能研究
通过共聚焦显微镜对细胞内特定细胞 器进行高分辨率成像，分析其在细胞 代谢、信号转导等方面的功能。
《激光共聚焦显微镜技术简 化操作与解析》
contents
目录
• 激光共聚焦显微镜简介 • 激光共聚焦显微镜操作流程 • 激光共聚焦显微镜解析技术 • 激光共聚焦显微镜的维护与保养 • 案例展示与解析
01 激光共聚焦显微 镜简介
定义与工作原理
定义
激光共聚焦显微镜是一种光学显微镜技术，利用激光作为光 源，通过共聚焦方式获取样品的高分辨率、高对比度图像。
优点
色彩复原技术能够提供高对比度和高 分辨率的图像，同时能够选择性地标 记和染色细胞或组织的特定结构，有 助于研究者更深入地了解细胞或组织 的生理和病理变化。
缺点
由于荧光染料可能会对细胞或组织产 生一定的毒性作用，因此需要严格控 制染料的浓度和作用时间。
定量分析技术
01 02
定量分析技术
利用激光共聚焦显微镜的定量分析软件，对获取的图像进行定量分析和 数据提取。这种技术能够提供更准确和可靠的实验数据，有助于研究者 更深入地了解细胞或组织的生理和病理变化。
激光共聚焦显微镜的样本PPT学习教案
仪器特点
1、光源 用激光做光源，从理论上消除了色差
。因为激光的单色性强、光源波束集中、 波长相同。
2、采用了共扼聚焦技术 在物镜的焦平面上放置了一个小孔，
将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差 。
第21页/共42页
仪器特点
3、点与面扫描技术 共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空 间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源） 逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合， 最后得到一个整体平面的或立体的像。
第23页共42页石蜡切片冰冻切片涂片印片铺片培养的粘附细胞悬浮细胞各种染色非染色荧光标记的组织包括活组织第24页共42页高清晰成像高清晰成像半定量荧光强度分析半定量荧光强度分析荧光探针表达量测定荧光探针表达量测定分层扫描分层扫描多种荧光标记同时检测多种荧光标记同时检测第25页共42页激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的光线被抑激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的光线被抑制减少了成像的干扰以及使用光色较纯的激光所以制减少了成像的干扰以及使用光色较纯的激光所以成像分辨率可达普通光学显微镜的成像分辨率可达普通光学显微镜的1414倍
仪 器 型 号 ： OLYMPUS IX73 研 究 级 倒 置 荧光显 微镜
第2页/共42页
显微镜参数
1．主机功能：系统具有明场、相差、微分干涉、荧光观察功能； 2．透射光光源：外置电源供应器100W卤素灯透射光照明装置； 3．物镜：长工作距离万能平场半复消色差相差（荧光）物镜：4×
（数值孔径N.A.≥0.13）、10×（N.A.≥0.3），20×（N.A.≥0.7）、 40×（N.A.≥0.6），60X×（N.A.≥0.7） 4．物镜转盘：6孔以上编码型物镜转盘,与软件连接后能够保存物镜 信息，随物镜转换能够自动校准标尺； 5．载物台：精确定位功能手动载物台；具备XY锁定和复位功能, 可 重现标本位置，游标尺的精度≤100μm； 6．聚光镜：超长工作距离万能聚光镜，孔位数≥5；
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
扫描速度与分辨率设置
根据实验需求，调整扫描速度和分辨率以确 保图像质量。
图像采集
校准
确保显微镜处于校准状态，避 免图像出现畸变或失真。
采集参数设置
设置合适的曝光时间、增益和 数字位数等参数，以确保图像 质量。
多区域采集
如需观察大范围样品，可设置 多个采集区域，并确保各区域 间无缝拼接。
实时预览
在采集过程中实时预览图像， 确保图像质量满足要求。
特点
高分辨率、高对比度、高灵敏度 、无损检测、能够观察活细胞等 。
工作原理
01
激光束通过显微物镜照 射到样品上，形成光斑 ；
02
光斑通过扫描器在样品 表面进行扫描，同时收 集反射光或荧光；
03
反射光或荧光通过共聚 焦系统汇聚到光电倍增 管上，转换成电信号；
04
电信号经过处理后形成 图像，显示在计算机屏 幕上。
根据实验需求设置采集参数，如曝光 时间、增益等，以获取高质量的图像 。
CHAPTER 04
激光扫描共聚焦显微镜实验 案例
细胞膜流动性研究
总结词
通过观察细胞膜荧光标记物的扩散和 分布，了解细胞膜的流动性。
详细描述
利用荧光染料标记细胞膜，在激光扫 描共聚焦显微镜下观察标记物的动态 变化，通过分析荧光强度和分布的变 化，可以了解细胞膜的流动性。
高速成像
研发更快的扫描速度和数据处理能力，实现实时动态观察 ，缩短实验时间，提高实验效率。
多维成像
拓展激光扫描共聚焦显微镜的成像维度，从二维平面扩展 到三维立体成像，甚至包括时间序列的四维成像，以更全 面地揭示细胞活动和分子交互过程。
应用领域的拓展
临床诊断
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 临床诊断，通过观察活体组织样 本，为疾病诊断和治疗提供更准
根据实验需求，调整扫描速度和分辨率以确 保图像质量。
图像采集
校准
确保显微镜处于校准状态，避 免图像出现畸变或失真。
采集参数设置
设置合适的曝光时间、增益和 数字位数等参数，以确保图像 质量。
多区域采集
如需观察大范围样品，可设置 多个采集区域，并确保各区域 间无缝拼接。
实时预览
在采集过程中实时预览图像， 确保图像质量满足要求。
特点
高分辨率、高对比度、高灵敏度 、无损检测、能够观察活细胞等 。
工作原理
01
激光束通过显微物镜照 射到样品上，形成光斑 ；
02
光斑通过扫描器在样品 表面进行扫描，同时收 集反射光或荧光；
03
反射光或荧光通过共聚 焦系统汇聚到光电倍增 管上，转换成电信号；
04
电信号经过处理后形成 图像，显示在计算机屏 幕上。
根据实验需求设置采集参数，如曝光 时间、增益等，以获取高质量的图像 。
CHAPTER 04
激光扫描共聚焦显微镜实验 案例
细胞膜流动性研究
总结词
通过观察细胞膜荧光标记物的扩散和 分布，了解细胞膜的流动性。
详细描述
利用荧光染料标记细胞膜，在激光扫 描共聚焦显微镜下观察标记物的动态 变化，通过分析荧光强度和分布的变 化，可以了解细胞膜的流动性。
高速成像
研发更快的扫描速度和数据处理能力，实现实时动态观察 ，缩短实验时间，提高实验效率。
多维成像
拓展激光扫描共聚焦显微镜的成像维度，从二维平面扩展 到三维立体成像，甚至包括时间序列的四维成像，以更全 面地揭示细胞活动和分子交互过程。
应用领域的拓展
临床诊断
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 临床诊断，通过观察活体组织样 本，为疾病诊断和治疗提供更准
共聚焦激光扫描显微术ppt课件
放
四．细胞内PH值的测定，脑缺血，损伤时细 胞内PH变化
荧光漂白恢复技术(FRAP)与细胞间通讯研究
Gap junction的分布，密度，调控因素，网络阻断剂(Othanol , Dieldrin)
6. 激光手术切除神经细胞突起 光陷阱技术，套除细胞器，移动染色体
7. 神经细胞编程性死亡(programmed cell death,PCD) 与细胞内钙的关系
通过基团修饰以掩蔽生物活性分子，使其以惰性前体形式 存在。通常是可逆的。
原理：紫外线照射→共价键断裂→释放生物活性分子
PART ONE
锁化合物的两种光化学反应原理： 氮苯的光致同分异构作用和硝基甲苯的光 分解作用
#2022
偶氮苯衍生物：
邻硝基甲 苯衍生物：
01.
目前应用最广泛的笼锁化合物系利用硝基甲苯 的光敏性质合成。
髓，否则容易造成观者的阅读压 力，适得其反。正如我们都希望 改变世界，希望给别人带去光明，
但更多时候我们只需要播下一颗
种子，自然有微风吹拂，雨露滋
养。恰如其分地表达观点，往往
事半功倍。
二、基本原理
1.光学成像
激光器产生的激光经物镜聚焦到 样品上
反射光或荧光经目镜汇聚于探测 器
探检测器前有一小孔(Pinhole) 汇聚光束
五、在神经 生物学的应 用
1.神经细胞参数测定及三维重建
细胞外形 浦肯野氏细胞及其突起的投射 神经细胞轴突走向及神经支配的研究 神经骨架重组的研究
二．神经递质、调质及细胞内活性物质受体 的荧光定位
三．细胞内钙离子的测定
○ 细胞内信号传导的研究 ○ 钙内流与神经递质释放的关系 ○ 微环境变化，受体激活，电刺激与钙的释
0.00
四．细胞内PH值的测定，脑缺血，损伤时细 胞内PH变化
荧光漂白恢复技术(FRAP)与细胞间通讯研究
Gap junction的分布，密度，调控因素，网络阻断剂(Othanol , Dieldrin)
6. 激光手术切除神经细胞突起 光陷阱技术，套除细胞器，移动染色体
7. 神经细胞编程性死亡(programmed cell death,PCD) 与细胞内钙的关系
通过基团修饰以掩蔽生物活性分子，使其以惰性前体形式 存在。通常是可逆的。
原理：紫外线照射→共价键断裂→释放生物活性分子
PART ONE
锁化合物的两种光化学反应原理： 氮苯的光致同分异构作用和硝基甲苯的光 分解作用
#2022
偶氮苯衍生物：
邻硝基甲 苯衍生物：
01.
目前应用最广泛的笼锁化合物系利用硝基甲苯 的光敏性质合成。
髓，否则容易造成观者的阅读压 力，适得其反。正如我们都希望 改变世界，希望给别人带去光明，
但更多时候我们只需要播下一颗
种子，自然有微风吹拂，雨露滋
养。恰如其分地表达观点，往往
事半功倍。
二、基本原理
1.光学成像
激光器产生的激光经物镜聚焦到 样品上
反射光或荧光经目镜汇聚于探测 器
探检测器前有一小孔(Pinhole) 汇聚光束
五、在神经 生物学的应 用
1.神经细胞参数测定及三维重建
细胞外形 浦肯野氏细胞及其突起的投射 神经细胞轴突走向及神经支配的研究 神经骨架重组的研究
二．神经递质、调质及细胞内活性物质受体 的荧光定位
三．细胞内钙离子的测定
○ 细胞内信号传导的研究 ○ 钙内流与神经递质释放的关系 ○ 微环境变化，受体激活，电刺激与钙的释
0.00
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
缺点
昂贵
激光扫描共聚焦显微镜的价格相对 较高，不是所有的实验室都能够负
担得起。
需要专业操作
使用该显微镜需要一定的专业知识 和技能，对操作者的要求较高。
样本制备要求高
由于该显微镜对样本的厚度和折射 率等参数敏感，因此需要精心制备 样本。
维护成本高
激光扫描共聚焦显微镜的维护成本 也相对较高，需要定期检查和保养 。
04
激光扫描共聚焦显微镜的 优缺点
优点
高分辨率
激光扫描共聚焦显微镜利用激光束进行 扫描，可以实现比传统显微镜更高的分 辨率。
灵敏度高
由于激光束的强度高，该显微镜对样本 的灵敏度也相应提高，可以检测到较弱 的荧光信号。
减少光损伤
共聚焦技术只对焦点处的样本进行照明 ，有效减少了光损伤。
三维成像
激光扫描共聚焦显微镜可以采集样本的 三维图像。
仪器清洁
清洁显微镜的透镜和其他部件，以确保观察的清晰度和准确 性。
图像获取
参数设置
在获取图像前，需要设置激光扫描共聚焦显微镜的参数，如扫描速度、扫描分辨 率、激光波长等。
图像获取
通过激光扫描共聚焦显微镜获取细胞样本的图像。
数据分析
对获取的图像进行处理，以提 高其清晰度和对比度。
02
数据测量
01
图像处理
显微镜控制和分析软件。
02
基于图形用户界面，方便用户进行样本观察、图像获
取和数据分析。
03
支持多种组织样本类型，包括免疫荧光、荧光原位杂
交等。
Definiens Developer
一种基于规则和智能图像分析软 件，用于构建细胞和组织图像分
析流程。
提供强大的图像处理和分析工具 ，包括图像预处理、特征提取、
《激光共聚焦技术》课件
多模态成像技术结合
将激光共聚焦技术与其它成像技术（如超声、MRI等）相 结合，可以实现多模态、多尺度的成像，为科学研究提供 更多信息。
人工智能与大数据分析
结合人工智能和大数据分析技术，对激光共聚焦图像进行 深度挖掘和定量分析，提高实验结果的可靠性和可重复性 。
05
实验操作与注意事项
实验前的准备
实验材料
将激光束转换为扫描线，并控 制显微镜的X和Y轴移动。
检测器
用于检测荧光信号，并将信号 转换为电信号。
激光器
用于产生激发光，常用波长为 405nm、488nm、561nm和 640nm。
物镜
用于将激光束聚焦到样品上， 并收集荧光信号。
计算机
用于控制扫描头、物镜和检测 器，并收集和处理荧光信号。
性能指标
光漂白与光毒性
强激光束可能会引起荧光分子的光漂 白和光毒性，影响实验结果和细胞活 性。
未来发展与展望
提高成像速度
未来可以通过改进扫描技术和提高探测器性能来提高激光 共聚焦技术的成像速度，以适应更多动态观察的需求。
拓展应用领域
随着技术的进步和应用需求的增加，激光共聚焦技术有望 在更多领域得到应用，如医学诊断、药物研发等。
细胞生物学研究
细胞形态与结构研究
利用激光共聚焦技术观察细胞形态、细胞器结构以及细胞骨架等，有助于深入 了解细胞生物学特性。
细胞分子定位与相互作用
通过荧光标记技术，对特定分子进行定位和追踪，研究分子在细胞内的分布、 动态变化以及与其他分子的相互作用。
医学诊断与治疗
疾病诊断
利用激光共聚焦技术对活体组织进行无创检测，有助于早期发现和诊断肿瘤、炎 症等疾病。
显微镜设置
根据实验需求，设置 激光波长、扫描速度 、分辨率等参数。
激光共聚焦简化版ppt课件
序列扫描的方法排除荧光串色
如图所示是使用序列扫描的方法排除荧光串色的例子： 使用 DAPI （蓝色）来标记细胞核、Cy2 （绿色）来标记 Na+/K+ ATPase、Alexa 568 phallodin （红色）来标记 F-actin。 未使用序列扫描的时，DAPI 的信号串到了 Cy2 通道，Cy2 的信号又串到了 Alexa 569 通道。 同一个标本使用序列扫描后，所有的颜色都被清楚的分开，排除了荧光串色的影响。
紫外 蓝 绿
高压汞灯
被荧光探针染色的生物样本
激发
被标记结构的荧光光学图像
光学 成像
滤镜 分光
488nm 520nm
FITC
450nm 490nm
普通荧光显微镜是广视场显微镜
普通荧光显微镜是广视场显微镜
荧光相互干扰－－图象清晰度降低
激发的特异性差－－背景荧光高
显微镜＋
各种染色 标记技术
荧光标记技术
优点：1.灵敏度高，比常规免疫组织化学的灵 敏度高1000倍。 2.通过不同颜色荧光标记可以清楚的观 察多种物质的共定位。 3.可以观察活细胞中离子或蛋白的动态 变化
荧光串色是指两种或多种荧光染料的发射光谱互相重迭的现象：当使用多种荧光染料标记标本时，或当标本具有很强的自发荧光时，很容易产生串色现象。
最简单的用来确定有无荧光串色的方法是使用单荧光标记的标本作对照： 首先观察第一种荧光染料单标记的标本，使用第一种荧光染料的激发光，在第二种荧光染料的探测通道上观察有无荧光串色；然后观察第二种荧光染料单标记的另一个标本，使用第二种荧光染料的激发光，在第一种染料的探测通道上观察有无荧光串色。 如果发现有荧光串色，则根据不同情况，使用序列扫描或光谱扫描的方法来排除串色的影响。
如图所示是使用序列扫描的方法排除荧光串色的例子： 使用 DAPI （蓝色）来标记细胞核、Cy2 （绿色）来标记 Na+/K+ ATPase、Alexa 568 phallodin （红色）来标记 F-actin。 未使用序列扫描的时，DAPI 的信号串到了 Cy2 通道，Cy2 的信号又串到了 Alexa 569 通道。 同一个标本使用序列扫描后，所有的颜色都被清楚的分开，排除了荧光串色的影响。
紫外 蓝 绿
高压汞灯
被荧光探针染色的生物样本
激发
被标记结构的荧光光学图像
光学 成像
滤镜 分光
488nm 520nm
FITC
450nm 490nm
普通荧光显微镜是广视场显微镜
普通荧光显微镜是广视场显微镜
荧光相互干扰－－图象清晰度降低
激发的特异性差－－背景荧光高
显微镜＋
各种染色 标记技术
荧光标记技术
优点：1.灵敏度高，比常规免疫组织化学的灵 敏度高1000倍。 2.通过不同颜色荧光标记可以清楚的观 察多种物质的共定位。 3.可以观察活细胞中离子或蛋白的动态 变化
荧光串色是指两种或多种荧光染料的发射光谱互相重迭的现象：当使用多种荧光染料标记标本时，或当标本具有很强的自发荧光时，很容易产生串色现象。
最简单的用来确定有无荧光串色的方法是使用单荧光标记的标本作对照： 首先观察第一种荧光染料单标记的标本，使用第一种荧光染料的激发光，在第二种荧光染料的探测通道上观察有无荧光串色；然后观察第二种荧光染料单标记的另一个标本，使用第二种荧光染料的激发光，在第一种染料的探测通道上观察有无荧光串色。 如果发现有荧光串色，则根据不同情况，使用序列扫描或光谱扫描的方法来排除串色的影响。
荧光共聚焦 激光扫描共聚焦ppt课件
7
只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动 到共焦平面上，样品的新层面又成像在显色器上。
分辨率：0.18μm
点照明，具有照明点和探测点，具有扫描系统，逐点扫描 成像
具有四个荧光通道，可同时探测多个被标记物，一个透射 光道，同时采集透射光图像（非共焦图像）
8 8
弧灯 膜
目镜
孔
9
02 应用
4
荧光显微镜
• 利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和 分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。
• 自发荧光：组织，细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所 呈现的荧光。
• 继发性荧光：组织，细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的 某种成分结合后而呈现的荧光。
荧光共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦荧光显微镜 (laser scanning confocal microscopy,LSCM)
1
2
目录
01 原理 02 应用
2
01 原理
3
4
荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。 当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射 线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发 出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波 段）；很多荧光物质一旦停止入射光，发光现象也随之立 即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
17
18
Conversion of azide to primary amine via Staudinger
reaction in metal-organic fracile conversion of azide to primary amine in metalorganic frameworks (MOFs) was accomplished by Staudinger reduction. After the reaction, MOFs retained high crystallinity confirmed by X-ray diffraction patterns, meaning a high usability of this method for postsynthetic modification of MOFs. Bulky phosphine groups provided surface-selective modification of MOFs via a reaction between resulting amine groups of MOF and activated ester with fluorescein, illustrated by confocal laser scanning microscope (CLSM) observation. This method opens up new possibilities for the preparation of MOFs having core-shell structures.
只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动 到共焦平面上，样品的新层面又成像在显色器上。
分辨率：0.18μm
点照明，具有照明点和探测点，具有扫描系统，逐点扫描 成像
具有四个荧光通道，可同时探测多个被标记物，一个透射 光道，同时采集透射光图像（非共焦图像）
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弧灯 膜
目镜
孔
9
02 应用
4
荧光显微镜
• 利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和 分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。
• 自发荧光：组织，细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所 呈现的荧光。
• 继发性荧光：组织，细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的 某种成分结合后而呈现的荧光。
荧光共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦荧光显微镜 (laser scanning confocal microscopy,LSCM)
1
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目录
01 原理 02 应用
2
01 原理
3
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荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。 当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射 线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发 出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波 段）；很多荧光物质一旦停止入射光，发光现象也随之立 即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
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Conversion of azide to primary amine via Staudinger
reaction in metal-organic fracile conversion of azide to primary amine in metalorganic frameworks (MOFs) was accomplished by Staudinger reduction. After the reaction, MOFs retained high crystallinity confirmed by X-ray diffraction patterns, meaning a high usability of this method for postsynthetic modification of MOFs. Bulky phosphine groups provided surface-selective modification of MOFs via a reaction between resulting amine groups of MOF and activated ester with fluorescein, illustrated by confocal laser scanning microscope (CLSM) observation. This method opens up new possibilities for the preparation of MOFs having core-shell structures.
激光共聚焦显微拉曼光谱仪PPT课件
操作步骤
1、打开电脑。 2、开机：插上电源插头，将Laser至On，长按power打开仪器，power蓝色灯亮。 3、打开OMNIC软件，点击实验设置，在光学台下打开激光，激光预热，预热完毕后，出现对话框，点击 休息两次，此时激光灯亮，点击实验设置中ok，实验设置完毕。 4、准直聚焦：如果仪器换激光器，如532nm换成780nm或仪器移动需做准直，方法选择10倍物镜，然后 22目观察，在x轴和y轴方向上移动光学台，旋动至黄色小光斑在十字交叉处。 5、校准仪器（检查光斑是否在中心）：如果光斑不在中心，可以通过移动光学台，使光斑在中心。 6、采集样品，采集完成后，点击文件另存为，在图谱文件CVS下保存，采样完成。 7、关机：点击实验设置，在光学台下关闭激光，将Laser至off，长按power关闭仪器，power熄灭，拔 下电源插头，关闭OMNIC软件，关闭电脑。
3、显微镜厂家原装透射、反射照明。附送备用照明灯2个。
4、自动XYZ平台，最小步长不大于0.1 um，可进行分散的多点、 线、面扫描和共焦深度的扫描。系统软件能帮助自动聚焦。系 统无反向间隙，能保证位置原始点的良好重复性。
5、采用真共焦光路设计，空间分辨率方面，100X物镜下，xy 分辨率 <= 1 um ，z轴方向分辨率<= 2微米，共焦深度连续可 调。
4、为适应不同样品测量要求以及防止激光功率过高烧坏样品， 要求激光输出功率可调。同时，激光光斑尺寸可调。
共焦显微镜
1、专业的高端科研型显微镜，10X原装目镜，20X、50X、100X、 长焦50X物镜， 包括可同时安装5个镜头的镜头架。其中长焦 50X的焦距都要求大于或接近10mm。
2、彩色摄像机。
写在最后
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More