微生物脂肪酶的纯化方法概述

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脂肪酶生产工艺

脂肪酶生产工艺
脂肪酶是一种重要的酶制剂，广泛应用于食品加工、制药、制糖、造纸、皮革、饲料等各个领域。

脂肪酶的生产工艺主要包括菌种筛选、发酵培养、酶液提取与纯化等几个关键步骤。

首先，菌种筛选是脂肪酶生产的起始步骤。

传统的方法是从环境中筛选出产酶能力强、耐受性好的菌株，如大肠杆菌、放线菌等。

随着现代生物技术的进步，可通过基因工程手段改造菌株，使其具有更高的酶活性和稳定性。

接下来是发酵培养，这是脂肪酶生产的核心环节。

首先，将选定的菌株进行预培养，使其进入活跃期。

然后将菌种接种到含有适宜营养物质的培养基中，并调节好温度、pH值、溶解氧和搅拌速度等发酵条件，促使菌株大量繁殖并产生酶。

在发酵过程中，可通过测定培养基中脂肪酶活性的变化，调节发酵条件以提高酶产量。

酶液提取是将发酵液中的酶分离和提取出来的步骤。

首先，通过简单的物理方法如离心、滤过等将固体颗粒去除。

然后，采用适当的预处理方法进行酶的初步分离，如酸碱沉淀、盐析、溶剂抽提等。

最后，通过纯化技术如层析、凝胶过滤、电泳等进一步提纯酶液，去除掉杂质和其他蛋白质。

脂肪酶生产工艺中的关键点在于发酵培养和酶液提取。

发酵培养涉及到菌株的选取和培养条件的优化，需要通过不断试验和改进，提高酶产量和酶活性。

酶液提取则需要采用合适的分离和纯化技术，以达到酶的高效提取和纯度的要求。

总的来说，脂肪酶的生产工艺主要包括菌种筛选、发酵培养和酶液提取等几个关键步骤。

这些步骤需要通过科学合理的操作和技术手段，不断优化提高，才能够实现高效、稳定地生产脂肪酶。

脂肪酶的分离纯化

脂肪酶——来源
脂植物：油料作物的种子
肪
酶的
动物：高等动物的胰脏和脂肪组织
来
源微生物：细菌、酵母菌和霉菌
脂提取法：从动植物器官或组织中提取
肪
酶的提
化学合成法：分析酶的氨基酸组成顺序 ,再用化学方法合成
取
发酵法：利用微生物的生命活力 , 通过人工控制而
获得人们所需的酶--假单胞菌属，黑曲霉，米曲霉
脂肪酶——结构
• 绝大多数脂肪酶的活性中心都由Ser和His参与组成, His，Ser与另一种氨基酸残基(如Glu或Asp 等)
一起构成脂肪酶催化活性中心的三联体。
残基 261 和 257 的羰基氧原子为Ca2+配基;顶端的α螺旋( 浅色的) 表示“盖子”状结构。当脂肪酶与界面相接触时,此盖打开, 通过亲电子域的创造导致脂肪酶的构象改变,此亲电子域在丝氨酸残基周围,由疏水残基的暴露和亲水残基的包埋来完成。这种结构有利于催化过程中底物对活性中心亲和力的提高以及活性中间体的稳定。
• （氮源）大豆粉 2 ％ (NH4)2 SO4 0.1 ％（碳源）玉米浆 5 ％ K2HPO4 5.5 ％聚乙二醇壬基笨醚 0.6 ％
微生物脂肪酶的发酵过程
无菌空气
发酵液
脂肪酶的下游分离提取工艺
预处理过滤菌体水洗
（破碎）
过滤
滤液+ 洗液（含酶稀溶液）
硫铵
超滤
无菌过滤
浓缩液辅料
• “盖子”是两性分子结构，在关闭状态，酶的结构是亲水端面对溶剂，疏水端朝向蛋白质的内部，当酶转变到开放状态时，疏水端会暴露出来，隐藏亲水残基团，在丝氨酸残基周围形成亲电子域，引起脂肪酶的构象改变，增加了酶与脂类底物的亲和性，并稳定了催化过程中过渡态中间产物。酶分子周围通常保留一定量的水分，从而保证了脂肪酶在油/水界面和脂相中的自体激活

脂肪酶的概述及应用

脂肪酶的概述与应用一脂肪酶概述、脂肪酶（Lipase，甘油酯水解酶）隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。

脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物（如霉菌、细菌等）组织中。

包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶。

脂肪酸广泛的应用于食品、药品、皮革、日用化工等方面脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。

植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。

脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。

脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。

脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。

迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同（Veeraragavan等）。

总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性（Schmid等；Kazlauskas等）。

脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv 就发现了这一现象。

溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。

这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。

酯酶（E C3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（≤C8）形成的酯。

脂肪酶的微生物生产技术综述

脂肪酶的微生物生产技术综述脂肪酶是一类催化脂肪水解的酶，在工业生产中具有广泛的应用。

传统的生产方法主要依赖于动物源脂肪提取，但存在成本高、工艺复杂等问题。

近年来，随着微生物生产技术的发展，利用微生物生产脂肪酶成为一种新的制备方法。

本文将对脂肪酶的微生物生产技术进行综述。

脂肪酶的微生物生产技术可以分为两大类：传统培养法和发酵工程法。

传统培养法主要是利用微生物本身产生的脂肪酶，在培养基中添加一定的诱导物质，刺激脂肪酶的合成。

常用的微生物有大肠杆菌、毕赤酵母、真菌等。

通过优化培养基成分、培养条件等因素，可以提高脂肪酶的产量和活性。

发酵工程法主要是通过基因工程手段改造微生物，使其能够高效表达目标脂肪酶的基因。

一般而言，利用真菌、大肠杆菌等基因工程菌株进行转基因技术的研究较多。

基因工程技术可以精确控制脂肪酶基因的表达，从而实现高效产酶。

同时，通过对菌株进行改造，还可以改善酶的稳定性、抗脂肪酸的能力等性能。

在微生物生产脂肪酶的过程中，存在一些关键技术需要克服。

首先是选择适宜的菌株。

不同的菌株对酶的产量和产酶条件有一定的要求，需要根据具体情况选择适宜的菌株。

其次是培养条件的优化。

如温度、pH值、培养基成分等因素对微生物生长和脂肪酶合成有重要影响，需要进行合理的调控。

此外，脂肪酶的分离纯化技术也是关键环节，通常采用离心、超滤、柱层析等方法进行分离纯化。

微生物生产脂肪酶的技术具有许多优点。

首先，可以避免对动物的依赖，减少对环境的影响，同时可持续生产，降低制备成本。

其次，基因工程技术的应用使得脂肪酶的产量和活性大幅度提高，可以满足工业需求。

此外，微生物生产脂肪酶的过程相对简单，易于规模化生产。

总之，微生物生产脂肪酶是一种新的制备方法，具有广阔的应用前景。

在今后的研究和开发中，需要进一步提高产酶菌株的稳定性和活性，改进酶的纯化技术，同时探索更多种类的微生物用于生产脂肪酶。

相信随着技术的发展，微生物生产脂肪酶的工艺将得到进一步完善和优化。

脂肪酶的检测方法

脂肪酶的检测方法1. 引言脂肪酶是一类能催化脂肪酯的水解反应的酶。

脂肪酶在食品工业、医学领域等具有重要的应用价值。

为了准确、快速地检测脂肪酶的活性和浓度，科学家们开发了多种检测方法。

本文将详细介绍脂肪酶的相关概念以及常用的检测方法，并对其优缺点进行比较分析。

2. 脂肪酶的概述脂肪酶是一种水解酶，主要催化脂肪酯的水解反应，将脂肪酯分解为甘油和脂肪酸。

脂肪酶广泛存在于动植物的组织中，如胃液、胆汁、胰液等。

脂肪酶的作用对于人体的脂肪消化和吸收至关重要，但过高或过低的脂肪酶活性都可能对人体健康产生不良影响。

3. 脂肪酶的检测方法概述常见的脂肪酶检测方法包括传统的酶活性测定法、光谱法、电化学法、电镜法等。

下面将分别介绍这些方法的原理、步骤以及优缺点。

3.1 传统的酶活性测定法•原理：该方法通过测定脂肪酶对底物的水解反应，间接反映脂肪酶的活性。

•步骤：1.准备含有脂肪酶的样品和底物溶液。

2.混合样品和底物溶液，并控制反应条件（温度、pH等）。

3.反应一段时间后停止反应。

4.使用比色法、比浊法等方法来测定反应产物（如甘油）的含量。

•优点：方法简单、成本低廉。

•缺点：测定结果受其他干扰物影响较大，灵敏度相对较低。

3.2 光谱法•原理：该方法利用脂肪酶催化反应过程中底物或产物的光学性质变化来检测脂肪酶活性。

•步骤：1.准备含有脂肪酶的样品和底物溶液。

2.在一定时间内记录底物或产物的光谱变化。

3.分析光谱数据，计算脂肪酶活性。

•优点：结果准确、灵敏度较高。

•缺点：需要专用的光谱仪器，成本相对较高。

3.3 电化学法•原理：该方法利用脂肪酶催化反应过程中产生的电流或电势变化来检测脂肪酶活性。

•步骤：1.在电极表面修饰脂肪酶或底物，并固定在电极上。

2.浸入电解质溶液中，建立电化学检测系统。

3.测量电流或电位的变化，并计算脂肪酶活性。

•优点：结果准确、实时监测。

•缺点：需要专用的电化学仪器，操作复杂。

3.4 电镜法•原理：该方法通过电镜观察样品中脂肪酶的形态和数量来评估脂肪酶活性。

脂肪酶综述

中实现表达。
五、脂肪酶的发酵生产及分离纯化
产脂肪酶发酵分两类: 固体发酵和液体发酵法。相对液体发酵法，固体发酵
生产脂肪酶具有简洁，经济的优点。
影响菌株发酵产脂肪酶的因素有：氮源、碳源、底物诱导剂、表面活性剂、矿物质、pH,
培养温度、摇床转速、培养时间、接种量等。
（1）发酵培养基
有机氮源:
大豆粉、大豆饼粉、大豆蛋白、业麻饼粉、奶粉、酪蛋白、蛋白陈、酵母膏、牛肉膏、玉米浸汁和无机氮硫酸钱、硫代硫酸钱、氯化氨、磷酸氢氨、磷酸二氢氨等
碳源
包括13种碳水化合物如葡萄糖、淀粉、麦芽糖、乳糖、甘露糖等和15种油脂如荷荷芭油、玉米油、豆油、棕搁油、橄榄油、业麻油等
表面活性剂
包括吐温系列、Span系列、Triton x-405等
发酵培养基优化
由碳源、氮源诱导物及常见的无机盐等组成。
速效碳源
如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等有利于细菌脂肪酶的形成，而缓效碳源如玉米粉和小麦粉等则有利于真菌脂肪酶的形成。
(2)最适pH及pH稳定性
脂肪酶最适pH受多种因素影响，如来源、底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度等。来源不同脂肪酶，在一定条件下都有其特定最适pH和pH稳定范围。大多数细菌脂肪酶的最适pH值在中性或碱性范围内，稳定范围一般在pH值为4.0-11.0。真菌脂肪酶pH值稳定范围较宽，如红曲酶保持基本活力的pH值范围在pH4.0-6.0，少根根霉脂肪酶的酶活在pH值为6.0-8.0的范围内都较稳定毛根霉脂肪酶的pH值稳定范围为7.0-10.0。
大豆粉大豆饼粉大豆蛋白业麻饼粉奶粉酪蛋白蛋白陈酵母膏牛肉膏玉米浸汁和无机氮硫酸钱硫代硫酸钱氯化氨磷酸氢氨磷酸二碳源包括13种碳水化合物如葡萄糖淀粉麦芽糖乳糖甘露糖等和15种油脂如荷荷芭油玉米油豆油棕搁油橄榄油业麻油等表面活性剂包括吐温系列span系列tritonx405等发酵培养基优化由碳源氮源诱导物及常见的无机盐等组成速效碳源如葡萄糖蔗糖麦芽糖等有利于细菌脂肪酶的形成而缓效碳源如玉米粉和小麦粉等则有利于真菌脂肪酶的形成

微生物发酵生产脂肪酶的研究进展

微生物发酵生产脂肪酶的研究进展脂肪酶是一种通过加速脂肪的加水分解而使其水解成胆固醇、甘油、游离脂肪酸等组分的生物催化剂。

脂肪酶已经广泛应用于食品、乳制品、制药、皮革等行业，因此其生产研究具有重要意义。

微生物发酵是目前最主要的脂肪酶生产方法之一，本文详细介绍了微生物发酵生产脂肪酶的研究进展。

1. 常用微生物种类微生物发酵生产脂肪酶常用的微生物种类有真菌、细菌、放线菌、酵母等。

其中最常用的微生物是霉菌和细菌。

霉菌对不同类型的底物都具有良好的酶活性，但是其生长速度较慢，反应时间长。

细菌则生长速度快，能够迅速产生大量的酶，但是它们的适应能力较差。

2. 脂肪酶生产工艺流程微生物发酵法生产脂肪酶的具体工艺流程大致分为以下几个步骤。

（1）培养基的制备：首先需要制备含有所需营养物质的培养基。

一般来说，优质的培养基含有碳源、氮源、微量元素、维生素等。

（2）微生物的接种：将所选的微生物菌株接种到培养基中，并进行预培养。

（3）发酵过程中的条件调控：这一步的关键在于对发酵过程的控制，包括温度、pH 值、培养时间等因素。

（4）分离纯化：分离、纯化和测量酶的本质是为了得到高纯度、活性较高的脂肪酶产品。

3. 研究进展（1）发酵条件的优化脂肪酶活性的提高对生产工艺的产率和经济效益都有着重要的意义。

为此，研究者通过对发酵温度、pH值、氮源等条件进行优化，成功提高了脂肪酶的产量和酶活。

例如，Jamil Khaskheli等发现，酵母菌Candida rugosa生产脂肪酶的酶活性受到温度影响较大，并在32℃的条件下达到最大值。

（2）遗传工程改造遗传工程技术在脂肪酶生产领域也已经得到广泛应用。

相关研究表明，基于DNA重组技术可以对脂肪酶的生产菌株进行改造，提高酶的稳定性和催化效率。

例如，一项由瑞典Karolinska Institute的研究人员完成的研究表明，通过在大肠杆菌中表达脂肪酶基因，可以显著提高脂肪酶的产量和催化效率。

（3）新型菌株的筛选与发现是时候采用新型菌株用于脂肪酶生产。

脂肪酶的微生物生产技术综述(优选参考)

脂肪酶的微生物生产技术综述By 夏远川脂肪酶是一种普遍存在于动植物和微生物体内的酶，也是最早研究的酶类之一，早在1834年就有关于兔胰腺脂肪酶活性的报道。

[1]脂肪酶是一类特殊酯键水解酶，一般用于催化水解和合成反应，在油水界面上，它催化三酰甘油的酯键的水解，生成甘油一酯、甘油二酯或直接生成甘油和脂肪酸。

[2]脂肪酶还可催化酯类化合物的醇解、酯化、酯交换等反应，且不需要辅酶，在工业生产和研究工作中均有广泛应用。

[3]脂肪酶按作用时的适应温度可分为高温脂肪酶、中温脂肪酶、低温脂肪酶；按适宜pH可分为碱性脂肪酶、中性脂肪酶、酸性脂肪酶。

脂肪酶的主要工业应用方向：1、洗涤工业：在洗涤剂中添加脂肪酶可使洗涤剂对脂质类污渍的去除效果大大提高，并可减少表面活性剂及无机助剂（尤其是三聚磷酸钠）的用量，大大减少洗涤剂带来的环境污染。

用于洗涤剂的脂肪酶为碱性脂肪酶，在碱性范围内有活性、活性不受表面活性剂影响、对氧系漂白剂稳定、热稳定性好，并且由于大多数加酶洗涤剂都适当配有蛋白酶，因此用于洗涤剂的脂肪酶还应具抗蛋白酶降解的能力。

[4]1988年，丹麦NOVO公司将碱性脂肪酶应用于洗涤剂中并推向市场。

1992年，这家公司构建了商业上第一株产脂肪酶菌株。

[1]2、食品工业：油脂改性是食品加工过程中的一个重要环节，脂肪酶可通过催化酯交换、酯转移、水解等反应，改变油脂的的物理化学性质，使便宜的、营养价值低的油脂升级为昂贵的、营养价值高的油脂；此外脂肪酶还可用于合成广泛应用于食品工业的糖酯类产品、合成不带副产物或毒性物质的芳香味酯类化合物、合成抗坏血酸酯类抗氧化剂如异抗坏血酸等。

[5]3、造纸工业：使用脂肪酶处理纸浆可减少胶黏物（绝大多数胶黏物都含有大量酯键）对造纸毛毯网间空隙的堵塞，提高纸机的运行效率和成纸品质，并降低环境污染，减少废水处理的负荷。

此外脂肪酶脱墨技术在废纸利用方面也起到非常大的作用，与传统脱墨技术相比脱墨效果更好环境污染更低，具有很大的优势。

脂肪酶的生产原理及应用

脂肪酶的生产原理及应用前言脂肪酶是一种酶类，其主要作用是加速脂肪的降解反应。

脂肪酶的生产原理和应用在生物技术领域中具有重要的意义。

本文将介绍脂肪酶的生产原理以及其在食品、医药和环境等方面的应用。

生产原理脂肪酶的生产主要通过微生物发酵得到。

下面将介绍脂肪酶的生产原理。

1.微生物选择：选择合适的微生物菌株对脂肪酶的生产至关重要。

常用的微生物菌株有放线菌、毛霉、酵母等。

2.培养基配方：合理的培养基配方是脂肪酶生产的基础。

培养基中应提供合适的碳源、氮源、矿物盐和生长因子。

3.发酵条件控制：合理的发酵条件对脂肪酶的生产影响巨大。

发酵温度、pH值和发酵时间是影响脂肪酶生产的关键因素。

一般来说，脂肪酶在温度为30-40℃，pH值为7-8的条件下生产效果较好。

4.酶提取和纯化：经过发酵得到的发酵液中含有脂肪酶，需要提取和纯化以得到高纯度的酶。

常用的方法有沉淀法、超滤法等。

脂肪酶的应用脂肪酶在食品、医药和环境等领域具有广泛的应用。

下面将介绍脂肪酶在不同领域中的应用情况。

食品领域1.食品加工：脂肪酶可用于食品加工过程中的油脂酯化反应和水解反应，用于改善食品的质地、口感和保鲜性。

2.乳制品工业：脂肪酶可用于乳制品中乳脂肪的酯化反应，用于改善乳品的风味和乳脂质的稳定性。

3.面包工业：脂肪酶可用于面包制作过程中的面糊脂肪分解，用于改善面包的质地和延长保鲜期。

医药领域1.药物制剂：脂肪酶可用于药物制剂的制备过程中的脂肪酯水解反应，用于改善药物的溶解性和生物利用度。

2.肥胖症治疗：脂肪酶可用于治疗肥胖症，通过促进脂肪的降解和消化，达到减重的目的。

环境领域1.油污处理：脂肪酶可用于油污处理过程中的脂肪降解反应，用于减少油污对环境的污染。

2.生物柴油制备：脂肪酶可用于生物柴油的制备过程中的酯交换反应，用于提高生物柴油的产量和质量。

总结脂肪酶的生产原理主要通过微生物发酵得到，需要选择合适的微生物菌株、合理的培养基配方以及控制合适的发酵条件。

脂肪酶的分离纯化

贺州学院课程考核试卷（论文）（2013—2014学年第 1 学期）课程名称：酶工程开课单位：化生学院考核年级、专业：11生物工程任课教师：何彩梅论文题目：脂肪酶的分离纯化脂肪酶的分离纯化摘要：采用简单的两步法—离子交换层析和疏水层析法，对Candida sp. 99−125 脂肪酶进行了纯化，比活提高了10.0倍，达到27200 U/mg，回收率为35.5%. SDS−PAGE 电泳分析显示该酶的分子量约为38 kDa. 酶学性质研究表明，该酶最适反应温度为40℃，最适反应pH 值为8.5，在室温下具有良好的稳定性. 钙离子和Tween80 能够促进提高脂肪酶的活性，而铁离子、铜离子和SDS 对其有明显的抑制作用.一．前言脂肪酶(Lipase, EC3.1.1.3)是一类重要的酯键水解酶. 与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶的制备周期短，作用pH 和作用温度范围广，底物专一性强，便于进行工业生产和制备高纯度制剂[1].在众多脂肪酶中，假丝酵母系(Candida sp.)脂肪酶的用途最为广泛，特别是用于合成短碳链酯类化合物如香料、生物柴油等物质[2]和手性化合物的拆分反应[3].Candida sp. 99-125 是本实验室保存的一类菌种，目前已应用于生物柴油[4]、维生素A 酯[5]、棕榈酸异辛酯[6]等物质的催化合成研究. 然而该菌株生产的脂肪酶中含有大量的杂质，不仅影响脂肪酶的酶活水平，而且对酶促催化反应带来许多不利因素. 为此，本研究采用简单的两步法—离子交换层析和疏水层析法分离纯化Candida sp. 99-125 脂肪酶，并对纯化后酶的性质进行了研究.2 材料与方法2.1 试剂与仪器粗酶粉，产酶菌株为Candida sp. 99−125，实验室自制；聚丙烯酰胺；液相色谱仪；SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)电泳仪；DEAE Sepharose FF 层析柱和PhenylSepharose FF (Low sub)层析柱.2.2 实验方法2.2.1 粗酶液的制备取2 g 粗酶粉溶于20 mL Tris-HCl (20 mmol/L, pH=7.5)缓冲液，待搅拌均匀离心，取上清液为上柱用的粗酶液. 粗酶液中蛋白的比活为2710 U/mg.2.2.2 离子交换层析法纯化脂肪酶以20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH=7.5)平衡离子交换层析柱，上样4 mL 粗酶液. 先以Tris-HCl 缓冲液冲洗掉未被离子交换层析柱结合的蛋白，再用0~0.4 mol/L的NaCl 溶液进行浓度梯度洗脱，洗脱体积为15 倍柱体积，最后以1 mol/L NaCl 溶液彻底洗脱结合蛋白. 分步收集洗脱液进行分析，合并酶活高的组分.2.2.3 疏水层析法纯化脂肪酶向上节得到的高活性脂肪酶样品溶液中加入固体硫酸铵至0.8 mol/L，将该溶液注入经0.8 mol/L 硫酸铵(AS)缓冲液(pH=7.0)平衡的疏水层析柱中. 先用0.8mol/L 硫酸铵缓冲液冲洗掉未被结合的蛋白，再用0.8~0.0 mol/L 的硫酸铵缓冲液进行浓度梯度洗脱，洗脱体积为10 倍柱体积，最后以20 mmol/L Tris-HCl (pH=7.5)缓冲液继续冲洗至彻底洗脱结合蛋白. 分步收集洗脱液进行分析.2.2.4 脂肪酶活力的测定脂肪酶活力测定采用橄榄油乳化液水解滴定法[7].酶活定义：脂肪酶在40℃, pH 为8.0 的条件下水解橄榄油乳化液产生1 μmol/min 脂肪酸所消耗的酶量，即为1个脂肪酶活力单位(记为1 U).2.2.5 蛋白质浓度的测定蛋白质浓度的测定采用Bradford 检测法[8]. 标准蛋白质为1 mg/mL 牛血清蛋白(BSA).2.2.6 SDS−聚丙烯酰胺凝胶电泳合并2.2.3 节得到的高活性脂肪酶样品溶液，加入2 倍SDS−PAGE 上样缓冲液，经沸水浴加热3∼5 min，得到电泳样品. 电泳采用浓度为12%的分离胶，控制电压在150 V. 电泳结束后进行考马斯亮蓝染色.3 结果与讨论3.1 脂肪酶的纯化3.1.1 离子交换层析采用DEAE Sepharose FF (1 mL)作为离子交换层析柱，紫外检测器的检测波长为280 nm，流动相流速为0.8 mL/min，进样量为4 mL.对上样后未被DEAE 柱结合的蛋白洗脱液进行酶活测定，结果表明，洗脱液中不存在酶活性物质. 然后用NaCl 溶液梯度洗脱，结果如图1 所示.图1 层析柱DEAE 分离纯化脂肪酶图1 显示有2 个蛋白吸收峰(A, B)，A 峰的峰形与酶活值构成的峰吻合，说明A 峰为纯化得到的目标脂肪酶蛋白峰，B 峰为杂蛋白峰. 活性测定表明，A 峰的比活为16600 U/mg，纯化倍数为6.1 倍，酶收率为55.7%.但2 峰之间有牵连现象，无法实现完全分离，说明DEAE柱对Candida sp.脂肪酶的分离效果一般.3.1.2 疏水层析采用Phenyl Sepharose FF (1mL)作为疏水层析柱.流动相流速为0.8 mL/min，进样量为4 mL.对上样后未被Phenyl 柱结合的蛋白洗脱液进行酶活测定，表明没有酶活性物质被洗脱出来. 用硫酸铵溶液梯度洗脱酶液的实验结果见图2.图2 表明，以梯度为0.8~0.0 mol/L 的硫酸铵溶液洗脱时，脂肪酶蛋白并没有被洗脱下来，说明脂肪酶蛋白的疏水性比较强，与Phenyl 柱结合牢固；而以20mmol/L Tris-HCl 缓冲液洗脱时，洗脱液则表现出较高的脂肪酶活性. 脂肪酶经Phenyl Sepharose FF 层析柱进一步纯化后，收率为63.7%，纯化倍数为1.6 倍.图2 层析柱Phenyl 分离纯化脂肪酶综上所述，Candida sp. 99-125 脂肪酶在经过DEAE离子交换层析和Phenyl 疏水层析两步纯化后，其比活为27200 U/mg，比粗酶提高了10.0 倍，产品收率为35.5%.3.2 脂肪酶的性质3.2.1 脂肪酶的最适反应温度分别测定纯化后的脂肪酶溶液样品在不同温度下的酶活性，结果见图4，表明该脂肪酶的最适反应温度为40℃.3.2.2 脂肪酶的最适反应pH 值在37℃下，分别测定纯化后的脂肪酶溶液样品在不同pH下的酶活性，结果见图5，表明该脂肪酶的最适反应pH 值为8.5.3.2.3 脂肪酶的温度稳定性将纯化后的酶液在不同温度下放置1 h 后测定酶活性，结果见图6. 该脂肪酶在高于35℃的条件下容易失活，但在室温(20∼30℃)下放置时具有较好的稳定性. 将酶在室温(20℃)下放置2d，其酶活收率在95%以上.3.2.4 金属离子对脂肪酶活性的影响向纯化后的脂肪酶溶液中分别加入5 mmol/L 的MgSO4, CuSO4, FeSO4, CaCl2 溶液和2.5 mmol/L 的K2SO4 溶液，在30℃下放置30 min，以不加离子的酶液为对照，分别测定其酶活.图7 表明，Fe2+和Cu2+对此酶有明显的抑制作用；而Ca2+的活化效果最好，可使酶活提高30%. 这说明适量的Ca2+能够促进脂肪酶活性的提高，对酶分子的最佳活力构象起稳定作用. 因此，可选择CaCl2 作为活化剂以提高酶活性.3.2.5 表面活性剂和酶抑制剂对脂肪酶活性的影响向纯化后的脂肪酶溶液中分别加入1 mmol/L 的EDTA, β-Mercaptoethanol, Dithiothreitol (DTT)和SDS,以及0.1%的Triton-X100, Tween80, Span60 和Span85，在30℃下放置30 min 后测定酶活，以不加表面活性剂或抑制剂的酶液为对照，结果见图8. 可见加入0.1%的Tween80 可略微提高该脂肪酶的活性，而1 mmol/L 的SDS 的引入对酶有抑制作用，EDTA 对酶活性的影响不大，说明该酶不是金属结合酶. 其他表面活性剂和抑制剂对酶活性的影响不大.3.3 假丝酵母系脂肪酶性质的比较Candida antarctica 脂肪酶B 的催化活性强，比活约为9 U/mg (Fluka 公司商品酶，62288 lipase B, Candidaantarctica，recombinant from Aspergillus oryzae)，温度稳定性好，立体选择性高[9]，特别是商品固定化产品Novozyme 435 在60∼80℃下仍保持较高的催化活性[10].Candida rugosa 脂肪酶包含5 个同工酶[11]，不同的同工酶对不同碳链脂肪酸的选择性差别较大，纯化的LipA 比活为750 U/mg[12]，最适反应温度在35∼40℃，最适反应pH 值为7∼8[11].Candida lipolytica 脂肪酶报道较多，姜延程等[13]对该酶采用DEAE−Cellulose DE-52 和DEAE−SephadexA-50 离子交换层析等步骤纯化，比活提高27.4 倍，达到169 U/mg，收率11%；徐岩等[1]采用盐析和透析的方法将比活提高2.69 倍，收率45%；张金红等[14]采用疏水层析法对其进行分离纯化，比活提高了10 倍以上. 但该酶的温度稳定性差，在30℃下存放24 h，酶活损失50%以上[13].4. 结论通过Candida sp. 99-125 脂肪酶的分离纯化及其酶学性质研究，得到如下结论：采用DEAE Sepharose FF 离子交换层析和PhenylSepharose FF (Low sub)疏水层析两步进行纯化，使Candida sp. 99-125 脂肪酶的比活显著提高，达到27200U/mg，为粗酶的10.0 倍，收率为35.5%. 经分析该酶的分子量约为38 kDa.(2)Candida sp. 99−125 脂肪酶纯化后的最适反应温度为40℃，最适反应pH 为8.5. 该脂肪酶在室温(20℃)条件下具有较好的稳定性，放置2 d，其酶活保留达95%以上. Ca2+的活化效果最好，可使酶活提高30%，Tween80 可略微提高该脂肪酶的活性，而Fe2+, Cu2+和SDS 对其有明显的抑制作用.参考文献：[1] 徐岩, 李建波, 王栋. 解脂假丝酵母脂肪酶的纯化及性质研究 [J].无锡轻工大学学报, 2001, 20(3): 257−260.[2] Bourg-Garros S, Razafindramboa N, Pavia A A. Large-scalePreparation of 3-Hexen-1-yl Acetate Using Candida antarctica Immobilized Lipase in Hexane [J]. Biotechnol. Bioeng., 1998, 59(4):498−500.[3] Maria S C, Jose V S G. Lipase-catalyzed Synthesis of Chiral Amides:A Systematic Study of the Variables that Control the Synthesis [J].Tetrahedron, 1998, 54: 2877−2892.[4] Deng L, Nie K L, Wang F, et al. Studies on Production of Biodiesel byEsterification of Fatty Acids by a Lipase Preparation from Candida sp.99-125 [J]. Chin. J. Chem. Eng., 2005, 13(4): 529−534.[5] Yin C H, Liu T, Tan T W. Synthesis of Vitamin A Esters byImmobilized Candida sp. Lipase in Organic Media [J]. Chin. J. 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微生物脂肪酶的纯化方法概述

微生物脂肪酶的纯化方法概述摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。

脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。

本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。

关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术1.脂肪酶概述脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。

同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。

1.1脂肪酶的结构与性质在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。

研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。

其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。

与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。

脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。

在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。

此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。

1.2产脂肪酶微生物微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。

脂肪酶纯化工艺流程

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以下是一种常见的脂肪酶纯化工艺流程：1. 发酵液预处理：将含有脂肪酶的发酵液进行离心或过滤，去除其中的细胞碎片和杂质。

微生物脂肪酶的纯化方法

微生物脂肪酶的纯化方法
鞠辉军;汪学军;刘均洪
【期刊名称】《河南化工》
【年(卷),期】2004(000)006
【摘要】微生物脂肪酶在有水或无水条件下都能催化大量的反应,所以在生物催化方面占据重要地位.微生物脂肪酶的化学选择性、区域选择性及对映性在科学界和工业应用方面引起了人们极大的兴趣.蛋白质的纯化过程包含着许多不同的技术,蛋白质的纯化步骤及每一步的纯化次数都会对蛋白质的纯化结果产生影响.本文介绍了许多新的脂肪酶纯化技术,可以有效地改善脂肪酶纯化工作.
【总页数】4页(P1-3,15)
【作者】鞠辉军;汪学军;刘均洪
【作者单位】青岛科技大学化工学院,山东,青岛,266042;青岛大学化工学院,山东,青岛,266042;青岛科技大学化工学院,山东,青岛,266042
【正文语种】中文
【中图分类】Q556
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