酵母双杂交系统

酵母双杂交技术的研究与应用

摘要：酵母双杂交系统是在20世纪90年代初发展起来的利用遗传学方法在酵母真核细胞体内研究蛋白质之间相互作用的一种高度灵敏的分子生物学技术，它可以有效分离新基因或新的能与一种已知蛋白相互作用的蛋白质及其编码基因，被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域，已成为分子生物学研究领域的重要实验手段之一，获得了许多有价值的重要发现。

关键词：酵母双杂交系统；蛋白质组学；功能基因组学Abstract:Yeast two-hybrid system is a highly sensitive molecular biology technique,which uses genetic methods to study protein-protein interaction in eukaryotic yeast cells,developed in the early 1990s.It can effectively separate new genes or new protein which has interaction with a known protein and protein-coding genes, is widely used in the field of proteomics, cellular signal transduction and functional genomics, has become one of the important experimental methods in the molecular biology areas, gained a lot of valuable important discovery.

Key words:Yeast two-hybrid system;Proteomics;Functional Genomics.

随着分子生物学研究的迅猛发展与人类基因组计划的完成,基因工程领域的研究已从结构基因组时代走进了功能基因组时代。功能基因组学的主要任务就是对生物基因组中包含的全部基因及其所翻译的蛋白质的功能加以分析，尤其是大量未知基因的功能及其相应蛋白质产物的功能。酵母双杂交是目前研究蛋白-蛋白相互作用的所有方法中较为简便、灵敏和高效的一种方法。它是利用酵母遗传学方法在真核细胞体内研究蛋白质之间相互作用的非常有效的分子生物学技术，可有效地用来分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质的编码基因。酵母双杂交技术的可行性和有效性在验证已知蛋白质之间的相互作用或筛选与靶蛋白特异作用的诱饵蛋白的研究中已被广泛的得到证实。

1 酵母双杂交系统的基本原理

酵母双杂交体系简称双杂交体系(Two-hybrid system)，是1989年由Fields[1]等在研究真核基因转录调控中提出并初步建立的。该系统是建立在人们对酵母转录因子GAL4的认识基础之上，完整的酵母转录因子GAl4分为结构上可以分开的、功能上又相互独立的2个结构域，一个是位于N端l～174位氨基酸残基区段的DNA结合域(DNA binding domain，DNA-BD)，另一个是位于C端768～881位氨基酸残基区段的转录激活域(Activation domain，AD)。DNA-BD能够识别GAL4效应基因(GAL4-responsive gene)的上游激活序列(Upstream activating sequence，UAS)，并与之结合，而AD则通过与转录机器

(Transcription machinery)中的其他成分之间的作用，启动UAS下游的基因进行转录。这2个结构域通过共价或非共价连接是转录因子发挥转录功能的关键，两者单独存在的时候并不能激活下游基因的转录反应，只有两者在空间上较为接近时，才能表现完整的GAL4转录因子活性并激活UAS下游启动子，使其下游报告基因得到转录。

基于酵母转录因子GAL4的原理，Fields等建立了酵母双杂交系统，将可能存在相互作用的2种蛋白质，即已知蛋白X和待研究蛋白Y，分别作为诱饵(bait)和猎物(prey)，并分别和BD/AD在空间结构上重新连接为一个整体而与报告基因的上游激活序列(UAS)结合，如果X和Y之间可以形成蛋白-蛋白复合物，使GAL4的2个结构域AD和BD相互接近，表现出转录因子的活性从而启动转录，使UAS下游启动子调控的报告基因组氨酸基因(HIS)、腺嘌呤基因（ADE）、β-半乳糖苷酶基因（LACZ）、酵母半乳糖苷酶基因（MEL1）得以表达。反之，如果诱饵和猎物之间不存在相互作用，BD与AD就不能结合，报告基因则不能被启动表达。通过对报告基因表达进行检测，即可实现对蛋白质之间相互作用的研究。在目前通用的酵母双杂交系统中，根据BD来源不同可分为真核细胞中的GAL4系统和原核细胞中的LexA系统[2]。

2 酵母双杂交系统的应用

2.1 用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库，获得与已知蛋白质存在特异相互作用的蛋白质

案例1：酵母双杂交技术筛选小鼠脑cDNA文库中与鼠巨细胞病毒即刻早期蛋白M122相互作用蛋白的研究[3]

目的：巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)是胎儿脑发育异常和免疫低下病人脑损伤最常见的感染性病因，但其致病机制至今尚未阐明。鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus，MCMV)感染的神经系统病变特征与HCMV(human cytomegalovirus，HCMV)感染极其相似，故成为模拟HCMV感染导致脑发育异常机制研究的理想模型。研究发现，MCMV即刻早期基因M122是病毒复制的必需基因。这种嗜神经蛋白还可与宿主细胞蛋白相互作用并反式调节细胞特定基因表达，进而影响与细胞增殖、分化和细胞周期调控等相关信号通路。推测M122蛋白可能在巨细胞病毒导致脑损伤的致病机制中起一定的作用[4,5]。在本研究中，利用酵母双杂交技术筛选小鼠脑cDNA文库中与M122相互作用的蛋白，以期获得与其相互作用的蛋白分子，为进一步研究巨细胞病毒的致病机制奠定实验基础。

方法：

①诱饵质粒在酵母菌AHl09感受态细胞中的表达：对诱饵质粒pGBKT7-M122进行毒性和自激活检测，再用醋酸锂法将诱饵质粒pGBKT7-M122、阳性对照pGBKT7-53分别转化酵母菌株AHl09，转化的酵母菌涂于SD/-Trp平板，30度培养3—5d。挑