分子生物学研究策略-基因表达技术(10月25日)
植物分子生物学利用分子生物学技术手段研究植物分子遗传学和基因组学的学科
植物分子生物学利用分子生物学技术手段研究植物分子遗传学和基因组学的学科植物分子生物学是一门综合多学科的研究领域，通过应用分子生物学技术手段来探索植物的分子遗传学和基因组学。
该学科涉及了许多关键概念和方法，包括DNA克隆、基因表达调控、基因组学、转基因技术以及分子标记等。
通过这些手段的应用，植物分子生物学研究可以进一步深化对植物基因功能、调控网络和进化等方面的理解，推动改良和创新植物育种，以应对全球食品安全和环境挑战。
一、DNA克隆DNA克隆是植物分子生物学研究的核心技术之一。
它是将感兴趣的DNA片段从一个来源复制并插入到宿主植物细胞中的过程。
常用的DNA克隆技术包括限制性内切酶切割、DNA连接、转化和筛选等步骤。
通过DNA克隆，研究人员可以获取大量特定DNA片段以及有关植物基因的信息。
二、基因表达调控基因表达调控是植物分子生物学研究中的另一个重要方面。
植物基因表达调控的过程涉及多种调控因子和信号通路。
植物中的基因表达不仅仅依赖于基因本身的序列，还受到一系列转录因子、启动子和增强子的作用。
通过分析基因在植物不同组织和环境条件下的表达模式，研究人员可以深入了解基因调控网络的运作机制。
三、基因组学基因组学是植物分子生物学研究的重要分支，它研究植物的基因组结构和功能。
随着高通量测序技术的发展，植物基因组的测序速度和精确度大幅提高。
通过对植物基因组的比较和分析，研究人员可以揭示不同物种间的遗传变异，以及基因组在进化过程中的改变。
同时，基因组学也为植物育种和遗传改良提供了重要的理论支持。
四、转基因技术转基因技术是植物分子生物学研究的重要手段之一。
它通过引入外源基因或抑制内源基因的表达，改变植物的遗传特性。
转基因技术在植物育种中起到了重要的作用，例如提高作物的抗虫性、耐逆性和产量等。
然而，转基因技术也面临伦理和环境安全等问题，需要权衡利弊进行应用。
五、分子标记分子标记是植物分子生物学研究中常用的工具。
它是一种与植物基因或DNA序列有关的分子标记，可以用来鉴定特定基因型或进行基因组遗传分析。
分子生物学研究中的新方法和技术
分子生物学研究中的新方法和技术随着科学技术的不断发展，分子生物学研究也在不断深入。
新方法和技术的出现，既推动了这一领域的进展，也为科学家们提供了更多的研究手段。
针对这一主题，本文将介绍几种应用于分子生物学研究的新方法和技术。
一、CRISPR-Cas9 基因编辑技术CRISPR-Cas9 基因编辑技术是近年来分子生物学领域最为重要的突破之一。
通过该技术，科学家可以精确地定位并编辑DNA序列，从而改变基因的表达。
利用 CRISPR-Cas9 可以将任何外源DNA 片段插入到特定的基因位点上，也可以切除、替换或拷贝存在的 DNA 片段。
这种技术不仅在基础研究中有着广泛的应用，也为治疗基因疾病和癌症提供了一条新途径。
二、单细胞测序技术单细胞测序技术是一项用于对单个细胞进行测序的技术。
与传统的基因组测序技术不同，单细胞测序可以帮助科学家们把一个样本中许多不同类型的细胞分离出来，并分别对它们进行测序。
该技术有助于我们更好地了解在组织和器官中单个细胞类型之间如何相互作用，也有助于发现不同疾病的根本原因。
三、功能研究技术功能研究技术是一种可以用来揭示基因功能的技术。
在分子生物学中，这种技术尤其重要。
其中，目前最为常用的是 RNA 干扰技术和基因表达分析技术。
RNA 干扰利用小的干扰 RNA 来沉默目标基因的表达，从而了解这个基因对生物过程的影响，而基因表达分析技术则可以让我们更深入地了解这个基因在某些特殊条件下的表达模式。
四、代谢组学技术代谢组学是一种利用高通量技术来研究生物体代谢的技术。
它可以快速地测量生物体内的代谢物质，如葡萄糖、乳酸和氨基酸等，并在这些物质之间建立关联。
代谢组学的发展不仅有助于我们更好地了解人类代谢对健康的影响，也为预防和治疗疾病提供了一条新途径。
综上所述，分子生物学研究中的新方法和技术不断涌现，不仅推动着这一领域的发展，而且为未来的医药科技带来了更多的可能。
通过这些技术的不断创新和发展，我们相信我们将能够更好地了解生命的奥秘，从而为人类的健康和长寿贡献自己的一份力量。
分子生物学研究揭示基因调控网络的构建与运作机制
分子生物学研究揭示基因调控网络的构建与运作机制基因调控网络是生物体内调控基因表达的关键机制之一，它参与了生命的各种生理过程和发展调控。
近年来，随着分子生物学技术和计算生物学方法的发展，人们对基因调控网络的构建和运作机制有了更深入的认识。
本文将探讨基因调控网络的概念、构建方式以及其在生物体内的运作机制。
一、基因调控网络的概念基因调控网络是由一系列相互作用的基因调控元件和调控蛋白所构成的复杂网络结构。
它通过一系列反应和信号传递机制，调节基因的表达水平和精确的时空表达模式。
基因调控网络具有高度复杂性和灵活性，能够对内外环境的变化做出及时的应答。
二、基因调控网络的构建方式1. 转录因子和调控元件的相互作用基因调控网络的构建离不开转录因子与调控元件之间的相互作用。
转录因子是一类特殊的蛋白质，它能够结合到DNA上的特定序列，从而启动或抑制基因的转录过程。
调控元件是染色体上的一段DNA序列，其中包含了转录因子结合位点。
通过转录因子和调控元件的相互作用，基因调控网络的构建得以实现。
2. 基因调控网络的层次结构基因调控网络具有多层次的结构，包括转录层、转译层和蛋白质互作层。
转录层是通过转录因子的调控实现基因表达的调控层次，转译层是指通过调控转录后的RNA的翻译过程对基因表达进行调控的层次，蛋白质互作层是指基因产物之间相互作用所形成的网络层次。
三、基因调控网络的运作机制1. 正反馈回路正反馈回路是基因调控网络中常见的一种机制。
当转录因子激活其自身的转录过程时，就形成了正反馈回路。
正反馈回路可以放大基因表达的峰值，使得基因表达具有记忆性，有利于稳定基因表达水平。
2. 负反馈回路负反馈回路是一种抑制性的基因调控机制。
当转录因子激活其自身反义基因的转录过程时，就形成了负反馈回路。
负反馈回路可以抑制基因表达的过程，保持基因表达水平的稳定。
3. 多重调控模式基因调控网络往往采用多重调控模式来实现对基因表达的精确调控。
这种调控模式包括串联调控、并联调控和反馈调控等。
分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达
分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达第一节基因操作概述............................................................................. 错误!未定义书签。
一、聚合酶链式反应(PCR) ............................................................. 错误!未定义书签。
二、质粒概述................................................................................... 错误!未定义书签。
三、凝胶电泳................................................................................... 错误!未定义书签。
四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化....................................... 错误!未定义书签。
五、重组质粒的连接....................................................................... 错误!未定义书签。
六、限制性内切酶消化................................................................... 错误!未定义书签。
七、SDS-PAGE蛋白质电泳........................................................... 错误!未定义书签。
第二节材料、设备及试剂..................................................................... 错误!未定义书签。
分子生物学的前沿研究
分子生物学的前沿研究分子生物学作为现代生命科学的一个重要分支，在过去几十年中取得了重大的进展和突破。
随着科技的不断进步和理论的不断深入，分子生物学的前沿研究领域也日益广阔。
本文将介绍分子生物学的几个前沿研究领域，包括基因编辑技术、表观遗传学、转录组学以及蛋白质组学。
一、基因编辑技术基因编辑技术是近年来分子生物学领域的热门研究方向之一。
其中最具代表性的技术是CRISPR-Cas9系统。
CRISPR-Cas9系统可以通过靶向式基因组编辑，实现对特定基因的精确修饰和功能分析。
通过将Cas9核酸酶与特定的RNA序列结合，可以精确定位和切割目标基因，从而改变其序列或功能。
这一技术的出现，极大地提高了基因编辑的效率和准确性，对于研究基因功能、疾病治疗等具有重要的应用前景。
二、表观遗传学表观遗传学指的是通过研究基因组中的化学修饰如DNA甲基化和组蛋白修饰等，来理解基因表达调控的机制。
表观遗传学的研究揭示了基因表达调控的多样性和复杂性，进而为许多疾病的发生机制提供了新的解释。
例如，DNA甲基化在肿瘤的发生中起着重要作用，研究人员可以通过探究甲基化修饰的变化，寻找到肿瘤发生的潜在靶点和治疗策略。
此外，表观遗传学还涉及到干细胞研究、发育生物学以及环境对基因表达的影响等多个领域。
三、转录组学转录组学是对细胞中所有转录本的整体研究。
通过高通量测序技术，研究人员可以迅速、准确地获取细胞内所有基因在特定时间点和条件下的表达信息。
转录组学的发展使得我们可以更全面地了解基因表达调控的机制，探索特定细胞状态下基因网络的重要成员，从而有助于揭示许多重要生物过程的内在规律和潜在功能。
此外，转录组学也为临床诊断提供了新的方法，例如通过对肿瘤转录组的特征进行分析，可以实现肿瘤类型的分类和个体化治疗方案的制定。
四、蛋白质组学蛋白质组学是对细胞或生物体中所有蛋白质的整体研究。
通过质谱等技术手段，可以对蛋白质的组成、结构和功能进行深入研究。
蛋白质组学的研究有助于揭示蛋白质的多样性和复杂性，促进对细胞功能和生物过程的全面理解。
分子生物学研究策略-基因表达技术
2）理想乳酸菌表达载体的特征： 1、稳定的遗传、传代能力（复制子） 2、具有显性的转化筛选标记（Emr ） 3、启动子的转录是可以调控 4、具有多克隆酶切位点
3）研究进展 （1）食品发酵方面的应用
（2）乳酸菌菌种鉴定 REA （Restriction Endonuclease Analysis） 16S rRNA （PCR ）
真核基因在不同表达系统的表达
表达白细胞介素IL-3(成熟蛋白)
大肠杆菌表达系统
20-30u
地衣芽孢杆菌表达系统 250-300u
酵母菌表达系统
20u
哺如动物细胞
2u
2、芽胞杆菌表达系统（Gene
Expression system in Bacillus）
1）特点
枯草芽孢杆菌是非致病的土壤微生物，严格生 长在有氧条件下。
SDS-PAGE
（3）抗微生物和食品腐败
（4）细胞表面层和外多糖
利用生物异构化方法从亚油酸生产具有生理活性的共轭 亚油酸（CLA）异构体单体。筛选到一株产生9顺,11反 共轭亚油酸的乳杆菌L1，建立了亚油酸制备技术，CLA 小试发酵工艺，共轭亚油酸的HPLC纯化分离和毛细管 电泳鉴定技术。
蛋白的转位和穿膜
链霉菌中蛋白的转位与穿膜机制尚未搞 清，如将IL-2与tendamistat信号肽融合， 在链霉菌中只有1/20翻译产物转位 （translocation）至培养基和积累在胞内。
5）影响链霉菌中基因表达的因素
（1）启动子对外源基因表达的影响 （2）信号肽对外源蛋白分泌的影响 A、信号肽N末端氨基酸序列正电荷数对
3、选择性标记不得选用各种抗生素抗性标记。 应选用食品级的标记基因，如糖类利用标记、 营养缺陷型标记等；
简述分子生物学的主要研究内容(一)
简述分子生物学的主要研究内容(一)分子生物学的主要研究内容引言在生物学的广阔领域中，分子生物学作为其中的重要分支，致力于研究生物体内分子的结构、功能和相互作用。
通过对生物体内分子的研究，分子生物学揭示了生命的本质和生物体的运行方式。
本文将简要介绍分子生物学的主要研究内容。
分子生物学的主要研究内容分子生物学研究的内容广泛，包括以下几个方面：1.DNA与基因–DNA结构与功能：研究DNA的双螺旋结构、碱基配对、序列特征以及转录和复制过程中的功能；–基因表达调控：探究基因转录、后转录修饰以及DNA甲基化等调控机制，揭示基因表达的调控网络；–基因突变与遗传疾病：研究DNA突变的原因与机制，解析遗传疾病的发生与发展。
2.RNA与蛋白质–RNA结构与功能：研究RNA的二级、三级结构及其在转录后调节、翻译等方面的功能；–蛋白质合成与调控：揭示蛋白质的合成、折叠过程以及翻译后修饰、定位等方面的调控机制；–蛋白质间相互作用：研究蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸等之间的相互作用，解析细胞内信号传导和调控网络。
3.遗传工程与基因编辑–基因工程技术：利用DNA重组技术进行基因组改造、外源基因的表达等；–基因编辑技术：应用CRISPR-Cas9等工具对生物体进行精确基因组编辑，研究基因功能与表达调控的关系。
4.细胞信号传导–细胞信号通路：研究生物体内细胞外信号的传导机制和细胞内响应过程，揭示生命活动的调控网络；–信号分子与受体：研究激素、细胞因子、细胞外基质等信号分子与受体之间的相互作用，理解信号转导的病理机制。
5.分子进化与生物多样性–分子系统学：通过分析生物体内分子间的差异与相似性，探究不同物种之间的亲缘关系与演化历史；–病原体与宿主：研究病原体与宿主之间的相互作用，阐明感染、免疫等生物学过程。
结论分子生物学作为生物学的重要分支，通过对生物体内分子的研究，深入揭示了生命的奥秘。
从DNA与基因、RNA与蛋白质、细胞信号传导、遗传工程到分子系统学与生物多样性，分子生物学提供了丰富的理论和技术支持，推动了生命科学的发展。
6分子生物学研究法(下)——基因功能研究技术
目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术（左图）和 大引物诱变法（右图），在基因序列中进行定点突变。
6.2 基因敲除技术
1、基本原理
经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体的表型出 发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。 现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首先从基因 序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。 基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通过外源DNA 与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因 改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗 传等特点。 基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全 基因敲除）两种。 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动植物 个体中的靶基因活性，条件型基因敲除是指通过定位重组系 统实现特定时间和空间的基因敲除。 噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的 FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系 统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。
ChIP不仅可以检测体内转录因子与 DNA的动态作用，还可以用来研究 组蛋白的各种共价修饰与基因表达 的关系。 定性或定量检测体内转录因子与 DNA的动态作用。 ChIP-chip and ChIP-seq：在基因 组水平研究DNA结合蛋白、组蛋白 修饰以及核小体分布。 ChIP-seq相对于ChIP-chip来说，具 有更高的分辨率、更小的噪音以及 更广的基因组覆盖范围。 Nucleosome Occupancy study: 一 些转录因子本身并不含有DNA结合 结构域，它是通过参与形成蛋白复 合物从而改变染色质结构来发挥作 用的；因此我们可以通过研究基因 组上核小体的分布变化来揭示转录 因子作用的过程。
分子生物学课后习题答案
第一章绪论☐DNA重组技术和基因工程技术。
DNA重组技术又称基因工程技术，目的是将不同DNA片段（基因或基因的一部分）按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。
DNA重组技术是核酸化学、蛋白质化学、酶工程及微生物学、遗传学、细胞学长期深入研究的结晶，而限制性内切酶DNA连接酶及其他工具酶的发现与应用则是这一技术得以建立的关键。
DNA重组技术有着广泛的应用前景。
首先，DNA重组技术可以用于大量生产某些在正常细胞代谢中产量很低的多肽，如激素、抗生素、酶类及抗体，提高产量，降低成本。
其次，DNA重组技术可以用于定向改造某些生物的基因结构，使他们所具有的特殊经济价值或功能成百上千倍的提高。
☐请简述现代分子生物学的研究内容。
1、DNA重组技术(基因工程)2、基因表达调控(核酸生物学)3、生物大分子结构功能(结构分子生物学)4、基因组、功能基因组与生物信息学研究第二章遗传的物质基础及基因与基因组结构☐核小体、DNA的半保留复制、转座子。
核小体是染色质的基本结构单位。
是由H2A、H2B、H3、H4各两分子生成八聚体和由大约200bp的DNA构成的。
核小体的形成是染色体中DNA压缩的第一步。
DNA在复制过程中，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。
这样新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基顺序完全一样。
因此，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式被称为DNA的半保留复制。
转座子是存在染色体DNA上的可自主复制和移位的基本单位。
转座子分为两大类：插入序列和复合型转座子。
☐DNA的一、二、三级结构特征。
DNA的一级结构是指4种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。
DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。
分为左手螺旋和右手螺旋。
DNA的高级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。
现代分子生物学-第九章 分子生物学基本研究法(下)-基因功能研究技术
转录组测序分析和RNA-Seq
转录组(transcriptome)，广义上指在某一特定生理 条件或环境下，一个细胞、组织或者生物体中所 有RNA的总和，包括信使RNA (mRNA)、核糖体 RNA (rRNA)、转运RNA (tRNA)及非编码 RNA(non-coding RNA或sRNA); 狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA的总和。
转录因子与顺式作用元件结合，激活最基本启动子Pmin， 使报告基因表达。若接入3个以上顺式作用元件，可增强 转录因子的识别和结合效率。
结构域
二者融合 导入酵母 细胞
上游
启动子 下游
酵母单杂交体系主要用于：
确定某个DNA分子与某个蛋白质之间是否存在相互作用；
分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功
胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定 了哺乳动物基因敲除的技术基础。
6. 2. 3 植物基因敲除技术
T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广 泛的基因敲除手段。
利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报告基 因的DNA序列整合到基因组DNA上，如果这段 DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基 因的表达，从而使该基因“失活”。
关于基因敲除技术，噬菌体的Cre/Loxp系统、 Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和 R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统， 尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。
1、完全基因敲除：
Neo基因有双重作用：①形成靶位点的插入突变；②作为
正向筛选标记。
取代型
插入型
由于基因转移的同源重组自然发生率极低， 动物的 重组概率约为10-2～10-5，植物的概率为10-4～10-5， 即使采用双向选择法也很难保证一次就从众多细胞 中筛选出真正发生 了同源重组的胚胎干细胞。
基因表达调控的研究方法与技术
基因表达调控的研究方法与技术基因表达调控是细胞内基因表达水平的控制，它是细胞命运决定的关键环节。
体细胞与细胞内基因调节的不同表现十分复杂，因此对于基因表达调控的研究，需要大量的方法与技术来支撑。
本文将详细介绍基因表达调控的研究方法与技术。
一、基于基因组学的方法1.基因芯片技术基因芯片技术是一种高通量的基因表达分析方法，它可以同时检测几万个基因的表达水平。
该技术是将每个基因的DNA序列通过光控制制成小小的晶片（芯片），再在芯片上固定DNA片段来进行检测。
基因芯片技术具有高通量、快速、准确等优点，被广泛应用于基因表达调控的研究中。
2.高通量测序技术高通量测序技术，全称高通量基因测序技术，是一种基于二代测序原理的基因组学技术。
该技术主要通过对DNA序列的高通量测量，可以快速获得基因序列信息，从而实现对基因表达调控的研究。
高通量测序技术具有高准确性、高通量、全面性等优点，被广泛应用于基因表达调控、单细胞基因组学、转录组学等多个科学领域。
二、基于生物化学及分子生物学的方法1.转录因子荧光素酶报告基因技术转录因子荧光素酶报告基因技术是一种由基因工程学出发，以投射型转录因子（TF）的基因的表达水平为重点，综合应用生物化学、分子生物学、细胞学等多门学科研究基因表达调控的技术。
该技术具有对转录因子活性的快速、可靠检测的优势，在基因表达调控中得到了广泛的应用。
2.基因克隆与表达基因克隆与表达是利用分子生物学技术，将目的基因从生物体中克隆出来，并构建成表达载体，最终转化到适合的宿主中来，从而得到高表达的目的蛋白质。
这种方法可以从粗提物中纯化出目的蛋白质，从而更深入地研究基因表达调控。
三、其他特殊方法1.基于RNA干扰技术的基因沉默RNAi技术是一种快速、有效地破坏有害基因的工具。
通过该技术，可以采用小分子RNA干扰选定的基因产生的mRNA的转录和翻译，从而起到沉默目标基因的作用。
该技术被广泛应用于基因表达调控的研究中。
分子生物学研究的新技术与新进展
分子生物学研究的新技术与新进展近年来，分子生物学研究领域出现了许多新技术和新进展，这些新技术的出现不仅丰富了分子生物学的研究手段，同时也为解决科学问题提供了更为有效和高效的途径。
一、单细胞转录组测序技术在过去的研究中，我们只能通过对大量样本的混合测序来研究全基因组的特性。
然而，这种方法忽略了个体差异和细胞异质性的存在，无法全面了解每个细胞内部的基因表达情况。
而随着单细胞转录组测序技术的出现，研究者可以在单个细胞层面上研究基因表达水平，从而更好地了解单个细胞内部的基因表达变化。
同时，单细胞转录组测序技术可以提供关于细胞发育和增殖的详细信息，特别是对于一些发育过程中基因表达变化较为明显的组织和器官。
二、基因编辑技术基因编辑技术是指通过直接改变DNA序列来实现定向修饰目标基因的一种技术，常用于研究基因功能和治疗疾病。
最常用的基因编辑技术是CRISPR-Cas9系统，通过此系统可以精确修饰基因组中的特定区域，增强或抑制特定基因表达。
此外，CRISPR-Cas9系统还可以通过将修饰的基因组转化到细胞中，开创了疾病治疗领域的新契机。
随着对基因编辑技术的研究深入，我们可以更好地了解不同基因和表观遗传学因子在生物体中的调控机制。
三、微生物组学技术微生物组学技术是指通过检测和分析微生物群落的组成及功能来研究微生物的学科。
近年来，微生物组学技术在探究环境和人体中微生物群落对健康和疾病的作用上发挥了巨大的作用。
特别是在疾病预防和治疗方面，微生物组学技术为我们提供了更为精确的治疗手段。
例如，利用微生物组学技术对人体内的肠道微生物进行分析，可以为相关疾病的诊断和预测提供有力支持。
四、蛋白质组学技术蛋白质组学技术是指通过大规模测序和鉴定蛋白质，以研究生物体内所有蛋白质的结构和功能，从而了解其在生命活动中的作用及其调节机制的科学研究。
随着蛋白质组学技术的不断发展，可以更加深入地了解蛋白质在人体发生变化时的动态表达和相互作用关系。
分子生物学研究分析
分子生物学研究分析分子生物学是一门研究生物体内分子结构、功能与相互作用的学科。
通过对生物体中的分子进行分析和研究，我们可以更深入地了解生命的本质以及生物体各个组成部分的运作机制。
本文将对分子生物学研究分析的方法和应用进行探讨。
一、基本概念和技术手段在分子生物学研究中，常用的技术手段包括基因克隆、PCR扩增、RNA干扰、蛋白质纯化、凝胶电泳等。
这些技术可以用来研究DNA、RNA和蛋白质的序列、结构、功能以及相互关系。
此外，分子生物学研究还包括基因组学、蛋白质组学和转录组学等领域的方法和技术。
二、基因表达调控的研究分子生物学研究可以帮助我们了解基因在细胞内的表达调控机制。
通过研究转录因子、启动子、转录调控区域等，我们可以揭示基因的启动、转录和翻译过程，并深入了解基因在细胞内的调控网络。
此外，分子生物学的研究还可以揭示疾病发生和发展中基因表达异常的原因，为疾病诊断、治疗提供理论基础。
三、疾病相关基因的研究通过对疾病相关基因的研究，分子生物学可以帮助我们了解疾病的发生机制，并为疾病的早期诊断和治疗提供依据。
例如，通过分析与肿瘤相关的基因突变，我们可以发现肿瘤的遗传基础，并为肿瘤的预防和治疗提供新的靶向策略。
此外，分子生物学的研究还可以揭示遗传性疾病的致病机制，为疾病的基因治疗提供理论基础。
四、分子标记和分子诊断分子生物学的研究还可以用于分子标记和分子诊断。
通过检测特定基因的表达或突变状态，我们可以对疾病进行早期诊断和预后评估。
例如，通过检测某些癌症相关基因的突变，可以帮助医生判断肿瘤患者的预后并制定个体化治疗方案。
此外，分子标记和分子诊断还可以用于病原体的检测和鉴定，为传染病的预防和控制提供有力的支持。
五、新药开发和治疗策略分子生物学的研究对于新药开发和治疗策略的制定起着重要的作用。
通过对疾病相关基因和蛋白质的研究，我们可以发现新的靶向药物，并设计相应的治疗方案。
例如，通过研究肿瘤细胞的分子机制，我们可以设计靶向特定基因突变的抗肿瘤药物，并提高药物治疗的效果。
第六章：分子生物学研究方法(下全文编辑修改
人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交
4. 基因定点突变技术
• 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码 的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨 基酸残基 对蛋白质结构功能的影响。
二、基因敲除技术
• 基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通 过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行 精确的定点修饰和基因改造。
方法: • 以9~11bp作为标签（tag）＝49＝262144组合 • 串联tag并通过两端接头PCR扩增 • 扩增产物进行测序 • 每个tag通过Genebank或EST数据库进行比对 • 确认tag代表的基因表达情况
2. RNA的选择性剪接从一个 mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。
2.凝胶阻滞试验 ➢ 是用于研究DNA与蛋白质相互作用的一种
特殊的凝胶电泳技术。
➢ 当DNA与蛋白质结合时，在电泳中会受到阻滞， 说明可能与某种特殊蛋白结合了。
3. DNAase足迹试验 ➢ 蛋白质结合在DNA片段上，能保护结合部位不被
DNAase水解，电泳中对应于结合部位没有条带。
• 常用RT-PCR法研究某个基因是否存在选择性剪切。
3.原位杂交技术( In Situ Hybridization，ISH)
• 用标记的核酸探针，在组织、细胞上对核酸进行 定位和相对定量研究的一种手 段。
• 探针标记用同位素或地高辛、生物素荧光标记等。
地
同
高
位
辛
素
标
标
记
记
染色体原位杂交
三、蛋白质与RNA、DNA相互作用
1. 酵母单杂交系统 • 将待测转录因子cDNA与表达载体导入酵母细胞，
该基因产物如 果能够与顺式作用元件相结合，就 能激活启动子，使报告基因得到表达。
分子生物学技术在遗传基因治疗中的应用
分子生物学技术在遗传基因治疗中的应用随着科技的不断进步，分子生物学技术在医学领域的应用也越来越广泛。
遗传基因治疗作为一种新兴的治疗手段，已经显示出在一些遗传疾病的治疗中的潜力。
本文将重点探讨分子生物学技术在遗传基因治疗中的应用，包括基因传递技术、基因编辑技术以及基因控制技术等。
一、基因传递技术基因传递技术是将治疗性基因（如正常基因、抗突变基因等）传递到患者体内，以修复或替代受损的基因，从而治疗遗传疾病。
常用的基因传递技术包括腺相关病毒载体、质粒转染和基因转染技术等。
腺相关病毒载体是最常用的基因传递工具之一。
该技术通过将治疗基因载入腺相关病毒中，然后将病毒注射到患者体内，使其传递并表达治疗基因。
腺相关病毒具有高效的基因传递能力和广谱的宿主细胞感染性，且对宿主的免疫反应较弱，因此在基因治疗中被广泛应用。
质粒转染是另一种常用的基因传递技术。
该技术通过将治疗基因载入质粒中，经过化学方法或物理方法将质粒转染到目标细胞中，以实现基因传递。
相比于病毒载体，质粒转染的优势在于不易引起免疫反应和基因插入相关的风险，但其传递效率相对较低，限制了其在临床应用中的推广。
另外，基因转染技术也是一种被广泛应用于基因治疗的技术。
该技术通过将外源基因导入载体，然后利用物理或化学方法将载体导入目标细胞中。
基因转染技术具有简单易行和传递效率高等优点，因此在基因治疗中被广泛采用。
二、基因编辑技术基因编辑技术是指通过直接对基因组进行操作，修复或改变患者体内异常基因和突变基因的技术。
其中CRISPR-Cas9系统是当前最为流行和广泛应用的基因编辑技术。
CRISPR-Cas9系统是一种可编程的基因编辑工具，由Cas9蛋白和RNA引导子（gRNA）组成。
通过设计gRNA，Cas9蛋白能够精确识别和结合到目标基因序列，并引导Cas9蛋白对目标基因进行剪切或修复。
该技术可以用于基因敲除、基因缺失修复以及点突变等基因编辑操作。
CRISPR-Cas9系统在基因治疗中的应用已经取得了一些突破性的进展。
分子生物学研究中的基础实验技术介绍
分子生物学研究中的基础实验技术介绍分子生物学研究在基础科研和生命医学研究中扮演着重要的角色。
飞速发展的分子生物学研究技术以其高效、精准、可重复性的特点成为了生命科学家的必备工具。
让我们一起来了解几种分子生物学研究中的基础实验技术。
1. DNA/RNA提取技术DNA/RNA提取是分子生物学研究的第一步，是从生物样品中获取纯度高的DNA或RNA的方法。
此技术可以应用于蛋白质鉴定、基因组测序和表观遗传学等领域。
常用的DNA提取方法有酚-氯仿法、盐析法和列柱法等。
其中酚-氯仿法简单易行，适用于DNA纯化和分子生物学操作；盐析法适用于大量的DNA提取；列柱法纯度高，适用于对高纯度DNA样品的分离。
RNA提取方法有TRIZOL法、琼脂糖纯化法和磁珠分离法等。
其中TRIZOL法适用于处理多样本，在样品处理时间短、批量大的情况下性能最佳；琼脂糖纯化法操作简单、成本低，适用于处理样品量小且同时提取RNA和蛋白质；磁珠分离法成本较高，但是它的效率和纯度都较高，可以用于小样本RNA提取和mRNA 纯化。
2. PCR技术PCR技术是基于DNA复制和扩增的技术，可用于DNA序列特异性检测、测序、基因表达分析和基因编辑等应用领域。
PCR技术是利用DNA聚合酶的反复循环态增加目标DNA分子的过程，从而扩增目标DNA分子，它是分子生物学研究中必须熟练掌握的基本操作之一。
PCR反应至少含有数量合适的引物、5'磷酸化的DNA模板、聚合酶、核酸酶抑制剂（RNase inhibitor）等组分。
PCR的引物选择是扩增成功的关键，匹配、降寶和引物长度的选择都会影响PCR扩增结果的可靠性。
3. 南方杂交南方杂交是一种测定核酸序列间同源性和差异性的分析方法，适用于在DNA或RNA样品中检测突变、重排和拷贝数变异等事件。
该方法在医学、生态、植物学和动物学等领域应用广泛。
南方杂交技术的基本原理是利用蛋白质-核酸之间的特异性结合，检测序列相似性。
基因组学技术在分子生物学研究中的应用
基因组学技术在分子生物学研究中的应用基因组学技术的快速发展和不断突破，为分子生物学研究提供了强大的工具和方法。
通过对生物体的基因组进行系统性的研究和解析，科学家们可以更全面地了解生物体的遗传组成和功能，进而深入探究分子生物学的各个方面。
在本文中，我们将探讨基因组学技术在分子生物学研究中的应用。
一、基因测序技术在分子生物学研究中的应用基因测序是基因组学技术的核心，通过对生物体DNA序列的解读，科学家们可以揭示基因的组成和变异，研究基因与表型之间的关系，探究基因的功能和调控机制等。
近年来，高通量测序技术的快速进步，使得基因测序能够更快速、更精确地进行。
通过基因测序，在研究癌症等疾病的发生机制中，科学家们发现了大量与疾病相关的基因变异，并揭示了许多疾病的分子机制。
二、转录组学技术在分子生物学研究中的应用转录组学技术是研究生物体基因表达的重要工具，通过对RNA分子的定量和定性分析，科学家们可以揭示基因表达调控的机制，发现新的功能基因和信号通路等。
常用的转录组学技术包括RNA测序和芯片技术。
通过转录组学技术，科学家们在解析人类和其他生物的转录组时，发现了大量新的编码和非编码RNA分子，并在生物发育、疾病发生和治疗等方面做出了重要的贡献。
三、蛋白质组学技术在分子生物学研究中的应用蛋白质组学技术被广泛应用于研究生物体的蛋白质组，通过对蛋白质的识别、定量和功能分析，科学家们可以全面了解蛋白质的组成、调控和相互作用等。
蛋白质组学技术包括质谱技术、蛋白质芯片和蛋白质互作分析技术等。
通过蛋白质组学技术，科学家们成功解析了一系列生物体的蛋白质组，发现了大量新的功能蛋白质和信号通路，并揭示了许多生理病理过程中的重要分子机制。
四、代谢组学技术在分子生物学研究中的应用代谢组学技术用于研究生物体的代谢物谱，通过对生物体的代谢产物进行定性和定量分析，科学家们可以揭示生物体的代谢途径、代谢调控机制以及代谢与疾病之间的关联等。
代谢组学技术主要包括质谱技术和核磁共振技术等。
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Genera: – Streptococcus – Leuconostoc – Pediococcus – Lactobacillus – Enterococcus – Lactococcus
All the above genera grow in chains. Many are used for the food industry.
（7）益生菌（PROBIOTICS）
Lactobacillus and Bifidobacterium
食品级基因修饰菌是指被导入源于同种或公
认的安全的食品级微生物的基因，因此具有 某种优良性状的用于发酵食品生产的微生物。 1、功能性基因必须源于同种菌或公认的安全 的食品级微生物； 2、载体必须是食品级的，不得含有非食品级 的功能性DNA 片段； 3、选择性标记不得选用各种抗生素抗性标记。 应选用食品级的标记基因，如糖类利用标记、 营养缺陷型标记等； 4、宿主菌的遗传特性清楚且稳定，具有足够 的安全性，应选用适当的分子生物学方法如 DNA序列分析、杂交等确定宿主菌的遗传组 成。
16S rRNA （PCR ）
SDS-PAGE
（3）抗微生物和食品腐败
（4）细胞表面层和外多糖
利用生物异构化方法从亚油酸生产具有生理活性的共轭
亚油酸（CLA）异构体单体。筛选到一株产生9顺,11反 共轭亚油酸的乳杆菌L1，建立了亚油酸制备技术，CLA 小试发酵工艺，共轭亚油酸的HPLC纯化分离和毛细管 电泳鉴定技术。
3）、可作为宿主的其它菌种：
嗜碱芽孢杆菌Bacillus abcalophilus
蛋白酶 淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefacilus -淀粉酶 短芽孢杆菌Bacillus brevis 地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis 淀粉酶，抗真菌肽 巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium 淀粉酶 短小芽孢杆菌Bacillus pumilus 蛋白酶
6）链霉菌表达系统优缺点及研究发展趋势
（1）优点：
链霉菌工业化培养条件成熟,适合于大规模
产业化 链霉菌基本为非致病菌,不产生内毒素 可以进行高密度培养,在稳定期仍能维持异 源蛋白的产生 链霉菌可分泌胞外酶,利用信号肽可分泌外 源蛋白 链霉菌中有许多可利用的转录起始信号,利 用它可以高表达外源基因
蛋白的转位和穿膜
链霉菌中蛋白的转位与穿膜机制尚未搞
清，如将IL-2与tendamistat信号肽融合， 在链霉菌中只有1/20翻译产物转位 （translocation）至培养基和积累在胞内。
5）影响链霉菌中基因表达的因素
（1）启动子对外源基因表达的影响 （2）信号肽对外源蛋白分泌的影响 A、信号肽N末端氨基酸序列正电荷数对
食品级载体不但是GRAS微生物，而且不
依靠抗生素抗性作为选择标记，因而更 为安全，在食品、医药方面具有广泛的 应用潜力。 乳酸菌的食品级 高效诱导分泌表 达NICE系统是可 控制的蛋白质生 产的最理想的系 统。
4、链霉菌基因表达系统
（Gene Expression system in Streptomyces ）
基因表达的影响 B、信号肽切割位点后的氨基酸数对基因 表达的影响 C、信号肽和目的蛋白之间的距离对基因 表达的影响
（3）密码子、SD序列和终止子等对基
因表达的影响 链霉菌中翻译起始密码子为ATG或GTG， 终止密码子为TAA或TAG （4）DNA扩增序列对基因表达的影响 （5）发酵条件对外源基因表达的影响
1）特点 大多数来自于土壤 能形成孢子的革兰氏阳性菌 有复杂的形态（以无中隔分
枝菌丝方式生长）和生理生 命周期 产生多种次级代谢产物 基因组是大肠杆菌的两倍， GC含量高，平均为74%
2）链霉菌的载体
（1）高拷贝载体 pIJ101 40-800 拷贝 硫链丝菌素（tsr）， 新霉素（neo），酪氨酸酶（mel） （2）低拷贝载体 pIJ920 1-2拷贝 广泛宿主 能插入大于 30kb的片段 （3）穿梭载体 pHJL210（SCP2*/pBR322） 菌调节蛋白新家族(SARP)正调控因 子 B、全局调节基因（global regulator） 调控所有抗生素生物合成的调节基因 absA 编码双组分信号转导系统 （3）调节因子 小分子脂溶兼水溶的γ丁酰内酯作为激素样物 质激发次级代谢和/或气生菌丝的形成
（4）链霉菌中的蛋白外泌系统 蛋白分泌机制
大多数链霉菌的外泌蛋白前蛋白中有N
端信号序列，它们的外泌依靠Sec-介导 的分泌系统。现已从链霉菌中已克隆了 SecA，SecY，SecD，SecE和SecF类似 物。SecA(Blanco etal.1998)属于膜相关 的转位ATPase,它阻止分泌前蛋白形成 三级结构前体，促进前蛋白定位于分泌 的转位酶上。
1）大肠杆菌表达系统 的特点：
（1）遗传背景清楚 （2）目的基因表达水
平高 （3）培养周期短 （4）抗感染能力强
2）大肠杆菌表达系统研究的发展趋势
完善现有的表达系统；
重组蛋白质的正确折叠； 构象形成；
蛋白质的分泌；
菌体表面表达技术及其应用；
重组蛋白质修饰加工。
长在有氧条件下。 枯草芽孢杆菌遗传学相当先进，很多噬菌体和 质粒适合用作克隆载体。 芽孢杆菌可大量产生几种商品酶，如-淀粉酶， 蛋白酶及苏云金杆菌的杀虫晶体蛋白等，发酵 技术发达。 具有单层细胞膜组成较简单的细胞外壳。 易于分离纯化分泌蛋白
2）枯草杆菌宿主菌株
由于大肠杆菌的CaCl2转化法对枯草芽孢杆 菌无效 （1）选择可转化的菌株 *168菌株及突变体： 营养要求、芽孢形成和萌发、蛋白酶缺失、 重组缺陷、限制/修饰系统缺陷、转座子插 入 （2）选择转化的方法 感受态转化： 原生质体转化： 电转化：甘氨酸添加培养感受态 其它方法，如转导、结合转移
（9）其他载体
（A）大容量载体 细菌人工染色体BAC 利用F因子复制起始点/par元件，1-2拷贝， 克隆100-300kb的片段 （B）整合型载体 利用pSAM2整合元件构建的pPM927 （C）高表达载体 整合高表达载体pCJR24，是利用天蓝色链 霉菌A3中的激活调节基因actII-ORF4与actI 基因启动子构建的
2）理想乳酸菌表达载体的特征：
1、稳定的遗传、传代能力（复制子）
2、具有显性的转化筛选标记（Emr ） 3、启动子的转录是可以调控 4、具有多克隆酶切位点
3）研究进展
（1）食品发酵方面的应用
（2）乳酸菌菌种鉴定 REA （Restriction Endonuclease Analysis）
3）链霉菌基因转移的方法 （1）原生质体转化 转化率不高 ,制备过程中影响因素多, 系统对外源DNA的限制修饰作用 （2）接合转移 DNA以单链形式进入宿主菌 大肠杆菌S17-1菌株, 质粒RSF1010 （3）电脉冲穿孔 转化率比原生质体高10-100倍 （4）噬菌体转导
4）链霉菌基因的调控和蛋白质的分泌表达
球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus
灭蚊毒素蛋白 嗜热芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus 高温-淀粉酶 苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis 杀虫晶体蛋白 耐碱的芽孢杆菌Bacillus alcalophilic 碱性蛋白酶 炭疽芽孢杆菌 Bacillus anthracis
*1996年，完成了酵母基因组DNA （1.25x107bp)全序列测定工作。
Division: budding Do not form filaments Some form filaments Some can mate.
4）枯草芽胞杆菌表达系统研究的发展趋势
1、表达真核基因 蛋白酶水解——缺陷型、抑制剂 2、表达商业用酶 克隆基因的整合 3、表达杀虫晶体蛋白 提高杀虫毒力，减少杀虫时间，增加广谱 4、利用芽孢杆菌基因工程技术扩大和加 强在医药领域多个方面的应用
3、乳酸菌基因表达系统（Gene
Expression system in Lactic Acid Bacteria）
真核基因在不同表达系统的表达
表达白细胞介素IL-3(成熟蛋白)
大肠杆菌表达系统 地衣芽孢杆菌表达系统 酵母菌表达系统 哺如动物细胞
20-30u 250-300u 20u 2u
2、芽胞杆菌表达系统（Gene
Expression system in Bacillus）
1）特点
枯草芽孢杆菌是非致病的土壤微生物，严格生
系统 优化组合强启动子,信号和先导肽, 从分 子水平研究其结构元件与功能的关系 在蛋白水平研究蛋白的分泌机理,特别是 蛋白的转位和转膜机制 研究次级代统 （Gene Expression system in Yeast ）
1）特点：
乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽
孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。 大多数不运动，少数以周毛运动。 菌体常排列成链。 在其发酵产物中只有乳酸的称为同型乳酸发酵， 而产物中除乳酸外还有较多乙酸、乙醇、CO ２等物质的称为异型乳酸发酵。 有微好氧菌和专性eria
（1）RNA聚合酶基因多样性 天蓝色链霉菌有两种不同形式的RNA聚 合酶全酶 32 （与大肠杆菌有保守性） 和49 （发育阶段） 多 因子,双启动子 研究表明天蓝色链霉菌至少有7个不同的 因子,参与营养期,孢子形成,次级代谢等