酶联免疫吸附试验测AFP——ELISA双抗体夹心法
双抗体夹心法原理
双抗体夹心法原理
双抗体夹心法（double-antibody sandwich assay）又称为酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的免疫学检测方法，用于检测目标物质，如蛋白质、抗原或抗体等。
双抗体夹心法的原理是利用两种不同的抗体，一种用于固定在检测板上，另一种被标记着酶，并用于检测样本中的目标分子。
在检测时，将待测样本加入到固定抗体覆盖的检测板孔中，待目标分子结合到固定抗体上后，洗涤样本，加入酶标记的抗体，酶与目标分子再次结合形成“夹心”复合物。
通过在底物的作用下，酶能够将底物转化为荧光或颜色生成物，由于只有与目标分子结合的酶标记的抗体才能够被夹持，因此可以确定样本中目标分子的数量，通过比较标准品样本的反应值得出定量。
总的来说，双抗体夹心法的优点是具有高灵敏度、特异性、精确度高以及批量化检测的优点，同时也非常适合小样本检测。
因此，双抗体夹心法被广泛应用于医学、食品安全、环境监测等领域的检测中。
酶联免疫吸附双抗体夹心法
载体连接形成固相抗体
E EE
E
E
3、加酶标抗体 3、加酶标抗体 待EL测IS血A的清基、础抗是-A抗FEP原-L（3或抗抗体体、）封的闭固蛋相白化溶及液抗、原辣（根或过抗氧体化）物的酶酶（标H记RP。）、底物四甲基联苯胺（TMB)、显色液、终止液……
测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免
ELISA的三条基本原理
❖ 原理一
ELISA的基础是抗原（或抗体）的固相化及抗原（或抗体）的 酶标记。结合在固相载体表面的抗原（或抗体）仍保持其免疫 学活性。
❖ 原理二
抗原(或抗体)可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种 酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性。
❖ 原理三
固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶 反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本 中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定 量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结 果，使测定方法达到很高的敏感度。
则要与酶标记特异性抗体作用。
双抗体夹心法图示自1963年发现以来，作为源自种肿瘤特异性抗原已广泛应用于临床。
OR: 甲胎蛋白（AFP）定量测定试剂盒（酶联免疫法）
1、已知抗体包 1、已知抗体 在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5 倍）。
固相(包被)抗体Ab + 样品(抗原Ag) + 酶标抗体Ab * → Ab-Ag-Ab* + 底物(TMB)→显色 液后15 分钟以内进行。
免疫学实验ELISA双抗夹心法课件
小于判断值为阴性。 注：阴性对照OD值小于0.05按0.05计算，
大于0.05按实际OD值计算判断值。
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注意事项：
1. 试剂及待测标本使用前应平衡至室温，并将试剂混匀， 弃去1～2滴垂直滴加；
2. 严格按照操作程序依次加样，以保证实验结果准确性； 3. 应尽量避免孔中有气泡，以免所测得OD值不准确。
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思考题：
1.免疫标记技术有哪些？各有何特点？。 2.ELISA操作过程中应注意哪些问题？
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2009级医疗专科复习题
一、名词解释2.5*8,共20分
免疫、抗原、抗原决定基(表位)、异嗜性抗原、白细胞分 化抗原、TD-Ag、 TI-Ag、抗体、免疫球蛋白、单（多）克 隆抗体、补体、经典途径、旁路途径、细胞因子、IL、IFN、 CSF、TNF、MHC、MHC限制性、TCR、BCR、模式识别 受体（PRR）、抗原提呈细胞（ APC）、适应性免疫应答、 免疫耐受、免疫调节、超敏反应、人工主动免疫、人工被动 免疫、计划免疫 注：红色标记为要求掌握英文
实验原理：
酶联免疫吸附试验（ELISA）是将抗原、抗体的特异性反应与酶对底 物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术，可用于检测体 液中微量的特异性抗体或抗原。首先，抗原、抗体的特异性反应在一种 固相载体表面－聚苯乙烯微量反应板孔中进行，通过洗涤去除多余的游 离反应物；然后加入酶标记的抗体或酶标记的抗抗体，从而形成抗体－ 抗原－酶标抗体复合物（双抗体夹心法）或抗原－抗体－抗抗体复合物 （间接法）；此时加入酶底物和显色剂，在酶催化底物后，液体呈现显 色反应。液体显色的强弱与复合物中待测抗原或抗体的量呈正比，借此 可检测待测抗原或抗体的有无及含量。
酶联免疫实验(定量法)
注意事项
1 试剂盒使用前要充分恢复到室温。 2 洗涤要彻底，防止假阳性，但不可洗 涤过猛过急造成假阴性。 3标准品OD值要满足以下要求：20 ng／ ml＞0.150;400 ng／ml ＞1.000,否则应 视为实验失败，全部试验重做。
使固相抗原抗体复合物与酶标抗体结 合，形成固相抗体-待测抗原-酶标记 抗体复合物（双抗体夹心），洗涤 除去未结合酶标记抗体；加底物显 色，固相上的酶催化底物成为有色 产物，根据颜色反应的程度进行该 抗原的定性或定量检测。
定量免疫测定的标准曲线的建立
定量测定顾名思义就是测定待测物的含 量。定量免疫测定在测定未知临床标本 得同时，亦需要测定系列不同浓度的标 准品或校准品，然后根据标准品或校准 品浓度与测定信号之间的比例关系来推 算未知标本得浓度，建立标准品或校准 品浓度与测定信号之间的比例关系的数 学公式及相应作图，称为曲线拟合。
实验步骤
1、加样；取出包被板，做好标记。留一孔做空白对照， 其余孔用微量加样器依次加入50μ l标准品及待测样品， 随即加酶结合物50 μ l 。轻轻振荡混匀后，置37度温 箱中温育30min。 2、洗涤：将各孔液体甩掉，用稀释的洗涤液注满各孔， 静置20秒，甩掉，重复5次后在吸水纸上拍干。 3、显色：每空加入底物50 μ l ，再加入显色剂50 μ l ，充分混匀，室温避光反应5min。 4、加终止液50 μ l 终止反应。 5、以空白调零，450nm波长处用酶标仪测各孔OD值。
标准曲线的特点：
定量免疫测定的标准曲线的建立有以下三 个特点： 1、标准品或校准品浓度与测定反应之间 关系是非线性的。 2、可能存在与系列标准品或校准品的测 定数据拟合的多条曲线。 3、具有相对大的且方差不齐的测定误差。
酶联免疫吸附试验双抗体夹心法
（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA）
“ELISA双抗体夹心法”，第5步，加待检标本、阳性对 照、阴性对照各2孔，每孔100ul，37℃，30分钟：
待检标本
阳性对照
阴性对照
• （一）免疫标记技术
【概念或原理】： 利用荧光素、酶、胶体金、发光物 质以及放射性核素等易显示物（标记物）连接于已 知抗体或抗原，再去检测待测标本中的相应抗原或 抗体的量或其存在与否。
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tubercle bacillus with fluorescence
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酶免疫技术
酶免疫组化技术：组织或细胞中抗原定位 酶免疫测定(如ELISA)：测液体标本中抗原或抗体
ELISA (酶联免疫吸附试验，enzyme-linked immunosorbent assay) sandwich ELISA to detect Ag √ indirect ELISA to detect Ab competitive ELISA to detect Ab or Ag
Sandwich ELISA (to detect Ag, 双抗体夹心法，原理)
1）已知抗体包被 2）洗板 3）加待检抗原标本 4）洗板 5）加酶标记抗体 6）洗板 7）加底物显色，测定
(measure color)
（封闭的意义）
( Ag )
polystyrene ( no Ag )
（显色） （定量）
6. 洗涤单个核细胞2次(加入约1ml Hanks’ 液, 混匀，离心，1500或2000rpm，5min，倒 去上清；重复1次)；
7. 用残留上清(或加Hanks’ 液约0.1ml)重悬获 得的单个核细胞，备用；
8. 吸取单个核细胞混悬液，加一滴于载玻片 上，显微镜下观察单个核细胞（以淋巴细 胞为主）
ELISA测定的常用模式--双抗体夹心法测抗原
ELISA测定的常用模式--双抗体夹心法测抗原临床ELISA测定的常用模式--双抗体夹心法测抗原对于含多个抗原决定簇的大分子蛋白，使用双抗体夹心ELISA模式测定相当简便，现有的商品试剂盒基本上都采用此种测定模式。
具体测定方法如下：1．首先以双抗体之一于碳酸盐缓冲液中4℃下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。
2．加入含待测物的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测抗原就会与固相上特异抗体反应而吸附于固相上。
3．加入酶标记的双抗体之二，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成双抗体与特异抗原的夹心产物。
4．加入酶底物，温育显色测定(图2—1)。
在该测定模式中，有两步温育和板孔洗涤步骤，如果将上述测定步骤2和3并为一步，即将待测样本和酶标抗体同时加入，从而仅有一步温育和洗板过程，即为通常所说的“一步法”。
最初的双抗夹心ELISA试剂盒，均采用两步法。
后来，人们为了节省时间，简化操作步骤，试剂生产厂家逐步推出了“一步法”试剂盒。
目前在我们的临床实验室中，测定大分子抗原如HAg、。
FP和hCG等，基本上都采用一步法。
一步法相比于两步法，虽然操作简单‘但有其固有的缺陷，处理不好，对ELISA测定结果有严重影响。
在通常的两步温育洗涤方法中，抗原抗体反应将遵循下述规律，即在第一步中加入的待测标本中抗原(Ag)浓度逐步增加时，将使固相抗体(Ab)与抗原的结合逐步达到饱和[(1)式]，这样当随后加入一定浓度的酶标抗体(Ab’)后，a复合物的形成将直接与在第一步中形成的b复合物相关[(2)式]，因此，待测抗原浓度的逐步增加导致了显色的逐步加深，当抗原浓度增加到一定程度时，反应显色达到平台，而呈S形变化曲线。
而一步法双抗夹心ELISA的反应曲线则为钟形曲线。
也就是说测定显色随着待则标本中抗原浓度的增加而升高至一定程度后，测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直至不显色，即所谓的“钩状效应”(hook eHect)，也就是我们在免疫沉淀试验中所称的“带现象”(zonephen。
酶联免疫吸附试验双抗体夹心法
• 转化率 =
转化的淋巴细胞数 ×100%
转化的淋巴细胞数 + 未转化的淋巴细胞数
T cells
T cells + B cells
×100%
（60~80%）
过渡型细胞
核分裂相细胞
转化的淋巴细胞包括以下三种细胞： （1）淋巴母细胞：体积明显增大，为成熟淋巴 细胞的3～4倍。核膜清晰，核染色质疏松，呈 细网状。核内见明显核仁1～4。胞浆丰富，嗜 碱性，有伪足样突出。胞浆内有时可见小空泡。 （2）过渡型淋巴细胞：具有上述淋巴母细胞的 某些特征。核质疏松，可见核仁，胞浆增多， 嗜碱性强。体积比小淋巴细胞大。 （3）核分裂相细胞：核呈有丝分裂，可见 许多对成堆或散在的染色体。
rosette forming cell T cell
rosette forming cell
rosette forming cells
rosette forming cell (electron microscope)
• 显微镜下观察花环形成细胞，310室， 不要求计算E花环形成率。
（三）2、淋巴细胞转化试验
可用来鉴定和计数T细胞
＋ CD2
T细胞
SRBC
＋
B细胞
SRBC
花环形成细胞
（60～80％）
＋
E 花环形成率=
形成E花环细胞数 ×100%
形成E花环细胞 + 未形成花环淋巴细胞
(60~80%)
• E 花环形成率=
形成E花环细胞数 形成E花环细胞数 + 未形成花环细胞数
×100%
总E花形成率：60~80% 活性E花形成率：25~40%
4. 水平离心(2000rpm, 20 min)；
3种不同方法检测甲胎蛋白的比较
ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ
ｃｏｎｔｅｎｔ
ＴＲＦＩＡ，ＲＩＡ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ＥＬＩＳＡ．Ｔｈｅ ＲＩＡ．ａｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｉｎｔｒａａｓｓａｙ
ｒａｎｇｅ
１
１ ０００ ｎｇ／ｍｌ ｆｏｒ ＴＲＦＩＡ，５～４００ｎｇ／ｍｌ ｆｏｒ ＲＩＡ ａｉｌ（｛５～３００ｎｇ／ｍｌ ｉｎｔｅｒａｓｓａｙ ＣＶ
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｏｆ ｓｅｒｕｍ
ｏ（－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ
ＣＨＥＮ Ｈａ／一ｗｅｉ。ｅｔ
ｂｙ ＴＲＦＩＡ，ＲＩＡ ａｎｄ
ａｌ
ＥＬＩＳＡ
（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ
ｄ—ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）ｉｎ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔａｒｙ，ｔｈｅ
２结果
２．１线性比较
将ＡＦＰ标准品（苏州新波生物技术有限公司提 供）１ ０００ｎｇ／ｍｌ按不同的浓度稀释后做线性实验。 结果显示，ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法和ＴＲＦＩＡ法分别当 ＡＦＰ浓度在５～３００ｎｇ／ｍｌ、５～４００ｎｇ／ｍｌ、１—１ ｍｌ范围内呈现良好的线性关系。 ２．２精密度试验比较 取一混合血清（ＡＦＰ含量为６２ｎｇ／ｍ１）分别用３ 种方法同时平行２０次计算批内误差；连续１０ｄ，次 ／ｄ，计算批间误差，结果见表１。 ２．３对比试验 将随机抽检的３０份病人血清标本分别用３种 方法进行检测，并对３种方法进行比较。回归方程： 设Ｙ为ＲＩＡ法所测ＡＦＰ含量，Ｘ。为ＴＲＦＩＡ法所测 ＡＦＰ含量，ｘ：为ＥＬＩＳＡ法所测ＡＦＰ含量，结果见表
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ａｌｐｈａ—ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｔｉｍｅ—ｒｅｓｏｌｖｅｄ
酶联免疫吸附试验(ELISA)
竞争法
此法可用于小分子抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体 。被 结合的酶标抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定，如 果待检溶液中抗原越多，被结合的标记抗原的量就越少，有色产物就 减少，这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量。此法的优点 在于快速、特异性高、且可用于小分子抗原及半抗原的检测；小分子 激素、药物等ELISA测定多用此法。
掌握免疫标记技术的基本原理。 掌握三大免疫标记技术的工作原理及主要实验类型的
原理和方法。 熟悉ELISA试验的实验设计原理。 了解免疫标记技术的应用与发展。
酶免疫测定类型
酶免疫技术
酶免疫组化 酶免疫测定
均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定
固相酶免疫测定 液相酶免疫测定
酶联免疫吸附试验
1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和 Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫 测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。
HRP催化过氧化物的氧化反应。
供氢体：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)
OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，最适吸收波 长为492nm
TMB经HRP作用后共产物显蓝色，用HCL或H2SO4终止后， 由蓝色呈黄色，最适吸收波长为450nm .TMB性质较稳定，可 配成溶液试剂，只需与H2O2溶液进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需 稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝 标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原 的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
捕获法 测IgM抗体
酶联免疫吸附试验(ELISA)基本原理
酶联免疫吸附试验（ELISA）基本原理基本原理1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。
这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。
在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，zui后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。
由于酶的催化频率很高，故可*地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
方法类型和操作步骤ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。
根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原zui常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。
洗涤除去其他未结合的物质。
（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。
根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
实验室血清学常用检测方法
常用血清学检测方法介绍一、酶联免疫吸附试验诊断技术目前，该项技术已在兽医学上得到广泛的应用，大多数动物传染病都已经研制成ELISA检测方法。
1、酶联免疫吸附试验的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。
此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
2、ELISA的类型根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
用于动物疫病检测的ELISA主要有以下几种类型：①.双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法。
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质、微生物病原体第二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
例如猪瘟病毒检测ELISA、禽流感病毒抗原捕获ELISA，就是根据这种原理设计的。
②.双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似。
用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。
与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。
乙肝HBs的检测常采用本法。
本法关键在于酶标抗原的制备，需要根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于于间接法。
此外，该方法不受被检动物种属差异的限制。
③.间接法测抗体间接法是检测抗体常用的方法。
其原理为利用酶标记的抗体（抗免疫球蛋白抗体），检测与固相抗原结合的受检抗体（见图1）。
酶联免疫吸附试验(双抗夹心法)原理
酶联免疫吸附试验（ELISA），又称酶联免疫吸附测定法，是目前广泛用于生物化学和免疫学领域的一种重要实验方法。
该技术结合了免疫学和生物化学的原理，能够高灵敏、高特异地检测抗原或抗体的存在，对临床诊断、生物医学研究以及生物制药等领域有着广泛的应用。
在本文中，我们将深入探讨酶联免疫吸附试验的原理、方法和应用。
一、酶联免疫吸附试验原理酶联免疫吸附试验的原理主要是利用酶标记抗体、抗原和底物的相互作用来检测特定物质的存在。
在双抗夹心法中，试验基本步骤如下：1. 用待测抗原溶液在固相酶标记抗体包被的微孔板上，充分接触和结合。
2. 经洗涤后，底物溶液被加入，并与酶标记抗体包被的复合物结合。
3. 底物受酶催化分解后，生成有色产物，通过比色法测定其光密度，间接测定抗原的含量。
在实验过程中，我们不能忽视的是标本处理、试剂选用、仪器操作等一系列实验细节，这些都对实验结果的准确性和重复性有着重要的影响。
二、酶联免疫吸附试验的方法不同类型的酶联免疫吸附试验方法包括间接法、夹心法、竞争法和直接法等。
在这次我们重点讨论的是双抗夹心法。
该方法通过将待测抗原与固相酶标记抗体和液相抗体结合，从而提高了对待测抗原的灵敏度和特异性。
这种方法在免疫学研究、传染病诊断和药物检测等方面具有重要的应用价值。
除了双抗夹心法，间接法通过检测待测抗体也是常用的酶联免疫吸附试验方法。
在实验设计中，根据不同的研究目的和样本特性，我们可以选择不同的方法来进行实验设计和操作。
三、酶联免疫吸附试验的应用酶联免疫吸附试验在临床诊断、疫苗研制、传染病监测、生物药品开发等领域有着广泛的应用。
它能够高灵敏、高特异地检测抗原或抗体的存在，为疾病诊断和药物研发提供了重要的技术支持。
在临床诊断中，酶联免疫吸附试验被广泛应用于传染病的早期诊断和鉴定。
HIV抗体检测、甲型肝炎抗原检测等都是通过酶联免疫吸附试验来完成的。
酶联免疫吸附试验还被应用于药物和疫苗的开发和监控过程中，能够全面地评价新药和疫苗的免疫原性和保护效果。
甲胎蛋白测定方法
甲胎蛋白测定方法1.免疫比浊法：这是一种常见的甲胎蛋白测定方法，其基本原理是利用抗甲胎蛋白抗体与体液中的AFP结合，并通过免疫反应形成比浊溶液。
在一定条件下，通过比较反应溶液的滴度与标准质量的AFP溶液的滴度，即可计算出待测样品中的AFP浓度。
2.酶联免疫吸附试验（ELISA）：这种方法是在固相酶联免疫吸附试验的基础上改进的。
首先，将待测样品加入带有特异抗体的酶标板孔中，与抗体发生特异性结合。
然后，通过洗涤去除未结合的物质，并加入与甲胎蛋白结合的辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体。
最后，加入底物使酶催化发生显色反应，根据反应物浓度与显色强度的相关性计算出AFP的浓度。
3.免疫电泳法：免疫电泳法通过将待测样品与抗甲胎蛋白抗体混合，然后将混合物分离电泳，以检测AFP的浓度。
根据电泳后蛋白质条带的长度和强度，可以判断AFP的浓度高低。
4. Immuno-Polymerase Chain Reaction（IPCR）：这是一种新兴的甲胎蛋白测定方法。
它结合了免疫技术和聚合酶链反应（PCR）技术。
首先，通过PCR扩增样品中的AFP基因片段。
然后，采用特异性抗体结合PCR扩增产物，形成固定复合物。
最后，通过荧光素酶或放射性示踪剂对复合物进行检测，计算待测样品中AFP的浓度。
以上是目前常见的AFP测定方法，每种方法都有其优点和局限性。
选择合适的方法应根据实际需要、设备条件和诊断要求。
甲胎蛋白的测定方法对于一些疾病的早期诊断和治疗监测具有重要意义，然而，需要注意的是，单纯的AFP测定结果并不能作为其中一种疾病的确诊依据，还需要结合其他临床信息进行综合分析和判断。
人甲胎蛋白(AFP) 说明书
人甲胎蛋白（AFP）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中甲胎蛋白（AFP）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人甲胎蛋白（AFP）水平。
用纯化的人甲胎蛋白（AFP）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入甲胎蛋白（AFP），再与HRP标记的甲胎蛋白（AFP）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的甲胎蛋白（AFP）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人甲胎蛋白（AFP）浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：45μg/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
酶联免疫吸附试验测AFP——ELISA双抗体夹心法
弃去孔内液体，同上洗涤三次
↓拍干
加底物A、B液各2滴(100UL/孔)
↓37℃×15min
显色后加终止液1滴(50UL/孔)
↓
酶标比色仪450nm读取OD 值
棋盘滴定法选择最佳工作浓度
选择标准：强阳性参考血清A值为0.8左右 阴性参考血清A值<0.1
（即：选择强阳性对照孔最接近0.8，且阴 性孔小于0.1的孔所对应的包被浓度和酶标 浓度为最佳的ELISA检测浓度。）
实验材料与仪器
待检抗原原液、酶标抗体、抗原稀释液、 酶标稀释液、酶标板条、洗涤液、显色液 A、显色液B、终止液
滴管、吸管、微量加样器、移液管 酶标仪、温育箱
操作
在酶标板条的孔中加入相应浓度的抗原（100UL/孔）
↓37℃×30min
弃孔内液体，用洗涤液洗3遍，30s/次
↓拍干
加所设计的不同工作浓度的酶标抗体100UL/孔
Ab＋Ag＋Ab* Ab • Ag • Ab* ＋Ab • Ag ＋Ag • Ab*＋Ab* • Ag • Ab*
a
b
c
d
Ab ＋ Ag Ab • Ag （b复合物）
(1)
Ab • Ag＋Ab* Ab • Ag • Ab* （a复合物）
(2)
HooK‘S效应（钩状效应）
ELISA影响因素实验设计
实验设计要求
在实验本上绘出36孔设计图表
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
写出实验中选择的包被液的情况 写出实验中选择的包被抗体、酶标抗体、
检测抗原的浓度，和系列稀释方案。 写出最终测得的OD值并分析实验结果。
评价
双抗体夹心ELISA法简单易行，不需 复杂的仪器设备，特异性强、敏感性 高，其中一步法更简单、省时，但有 Hook效应的缺点。
酶联免疫吸附测定法
定法
免疫学实验
基本原理
它采用抗原与抗体的特异反应将待
测物与酶连接，然后通过酶与底物产生 颜色反应，用于定量测定。测定的对象
可以是抗体也可以是抗原。
在这种测定方法中有 3种必要的试剂：
①固相的抗原或抗体（ 免疫吸附剂）
②酶标记的抗原或抗体（ 标记物）
③酶作用的底物（ 显色剂）
实验原理 双抗体夹心法
底物后生成的有色物质量 (OD值)，即可确定待测 抗原含量。
实验器材和药品
? 固相载体在ELISA 测定过程中作为吸附 剂和容器。 最常用的是聚苯乙烯和聚氯乙 烯 。它们有较强的吸附蛋白质的性能，抗
体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的 免疫学活性。
微量滴定板，量滴定板为 8×12的96孔 式。ELISA 板的特点是可以同时进行大量标
本的检测，并可在特制的比色计上迅速读
出结果。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附
性增加。
酶结合物是酶与抗体或抗原联结的产 物。具有酶促反应，显示出生物放大作用。
在ELISA 中，常用的酶为辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP) 和碱性磷 酸酶 (alkaline phosohatase, AP) 。
2. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗 体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育 0.5～1小时，洗涤。
3. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的底物溶 液0.1ml ，37℃10～30分钟。
4. 终止反应：于各反应孔中加入2M 硫酸0.05ml。
5. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：
?洗涤液
常用的稀释液为含0.05%吐温20的磷酸
盐缓冲液。
elisa常用方法
elisa常用方法酶联免疫吸附测定(ELISA)为免疫学中的经典实验。
下面是店铺为您带来的elisa常用方法，希望对大家有所帮助。
elisa常用方法：双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法。
夹心法利用两种一抗对目标抗原进行捕获和固定，在确保灵敏度的同时大大提高了反应的特异性，该方法的检测灵敏度可提高到pg级的水平。
将已知抗体包被到固相表面，加入待检标本，标本中若含有相应抗原即与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分，加入该抗原特异的酶标记抗体，洗去未结合的酶标记抗体，加底物后显色。
若标本中无相应抗原，固相表面即无抗原结合，加入的酶标记抗体则不能结合于固相并被洗涤去除，当加入无色底物后，因无酶催化故不显色。
双抗体夹心法适用于测定2价或2价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
elisa常用方法：间接法间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。
先将待测的蛋白包被在孔板内，然后依次加入一抗、酶标记的二抗和底物显色，通过仪器(例如酶标仪)定量检测抗原。
这种方法操作简单但由于高背景而特异性较差，目前已逐渐被夹心法取代。
间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标二抗建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体。
elisa常用方法：竞争法竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。
其原理为标本中的抗体一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。
标本中?体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。
如抗原为高纯度的，可直接包被于固相。
如抗原中有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。
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综合性实验设计方案探讨
ELISA最佳工作浓度的选择
——此次试验提供0.5mg/mL的包被抗体原液每组300μ l (经过一系列的预实验，现在我们抗体包被的浓度范围缩 小为10μ g/mL ～ 60μ g/mL)。 ——包被用Na2CO3缓冲液每组各10ml ——酶标抗体稀释液、抗原稀释液每组10ml ——1:50酶标抗体液每组100μ l（预实验后工作浓度范围 缩小在1:2000～1:10000之内） ——800μ g/mL的检测抗原原液每组800μ l（自己调整检 测浓度，此次试验强阳性抗原为400μ g/mL、弱阳性抗原 浓度为20μ g/mL、阴性直接加抗原稀释液 ） ——聚苯乙烯酶标板条3条，共36孔
实验材料与仪器
待检抗原原液、酶标抗体、抗原稀释液、 酶标稀释液、酶标板条、洗涤液、显色液 A、显色液B、终止液 滴管、吸管、微量加样器、移液管 酶标仪、温育箱
操作
在酶标板条的孔中加入相应浓度的抗原（100UL/孔）
↓37℃×30min
弃孔内液体，用洗涤液洗3遍，30s/次
↓拍干
加所设计的不同工作浓度的酶标抗体100UL/孔
谢谢！
↓37℃×30min
弃去孔内液体，同上洗涤三次
↓拍干
加底物A、B液各2滴(100UL/孔)
↓37℃×15min
显色后加终止液1滴(50UL/孔)
↓
酶标比色仪450nm读取OD 值
棋盘滴定法选择最佳工作浓度
选择标准：强阳性参考血清A值为0.8左右 阴性参考血清A值<0.1 （即：选择强阳性对照孔最接近0.8，且阴 性孔小于0.1的孔所对应的包被浓度和酶标 浓度为最佳的ELISA检测浓度。）
第一组：边缘效应 第二组：叠加效应 第三组：温浴方式 第四组：加样方式 第五组：洗涤次数 第六组：温浴时间 第七组：试剂温度
小组讨论结束后每组写出一份具体的试验设计方 案，下节课上每组派代表上台讲述实验方案和可 行性，讲述时间为2-3分钟左右。
要求设计方案中包括： 实验对象、标本要求 操作条件、操作过程（可画出96孔加样示 意图或对比示意图等） 结果判断标准 结果分析方式
实验设计操作要求
包被抗体、酶标抗体、检测抗原浓度的确立； 聚苯乙烯板条每孔加包被抗体液100μL，4℃包被 48h。 弃去孔内液体，每孔加200μL封闭液，4℃封闭24h。
弃去封闭液，风干，检测（检测时每孔所加的各 稀释度的酶标液和抗原都为100μL ），结果分析。
标本检测的原理
将特异性抗体包被固相载体，加入受检标 本（抗原）使之与固相载体上的抗体结合 成抗体抗原复合物，加入酶标抗体形成抗 体抗原酶标抗体复合物，加入底物显色。
Ab＋Ag＋Ab* Ab Ag Ab* ＋Ab Ag ＋Ag Ab*＋Ab* Ag Ab* a b c d
Ab ＋ Ag
Ab Ag （b复合物） Ab Ag Ab* （a复合物）
(1) (2)
Ab Ag＋Ab*
HooK‘S效应（钩状效应）
ELISA影响因素实验设计
实验设计要求
在实验本上绘出36孔设计图表
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
写出实验中选择的包被液的情况 写出实验中选择的包被抗体、酶标抗体、 检测抗原的浓度，和系列稀释方案。 写出最终测得的OD值不需 复杂的仪器设备，特异性强、敏感性 高，其中一步法更简单、省时，但有 Hook效应的缺点。