转染细胞的稳定筛选方法和实验步骤
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结1
最全的G418筛选稳定表达细胞系G418是一种广谱抗生素，可以选择性地杀死没有正确整合的质粒DNA转染的细胞，从而筛选出具有稳定表达的细胞系。
G418筛选是基因转染中常用的一种选择方法，通过对G418敏感性的筛选来选择转化基因。
本文将G418筛选步骤和优化方案。
G418筛选步骤细胞株选取首先需要选取稳定转染所需的细胞株。
需要保证选取的细胞株生长健康、分裂正常、易于培养以及不易死亡。
常用的细胞株有293T、CHO、HEK293。
转染在开始筛选之前，需要将目的基因转染进入所选细胞株。
目前常用的转染方法有磷酸钙共沉淀法、电转染法和脂质体转染法等，需要根据实际情况选择转染方法。
初步筛选完成转染后，需要在培养基中加入G418，通常的加药浓度不超过1mg/mL，推荐浓度为400μg/mL。
在转染后24-48小时内开始进行初步筛选，通过观察细胞的生长状态以及基因表达情况来判断筛选效果。
细分筛选初步筛选后，需要将G418的浓度逐步增加，通常第二轮加药浓度是初步筛选浓度的2倍，第三轮加药浓度是第二轮的2倍。
逐渐递增药物浓度，可以让敏感的细胞死亡，生存的细胞逐渐表达目的基因，从而得到稳定的细胞株。
稳定维持筛选到稳定的细胞后，需要对细胞进行定期维护。
通常可以在培养基中加入适当的G418浓度，维持稳定表达的转染细胞。
优化方案药物浓度G418的加药浓度直接影响到细胞死亡率和筛选效果。
在进行筛选前需要先进行剂量反应实验，通过不同浓度药物的处理，检测细胞生长状态和基因表达情况。
细胞密度传统细胞密度在98%时，死亡率是最高的。
因此，为了降低G418对细胞的毒性，可以将细胞密度控制在70-80%左右。
同时，过稀的细胞密度也会影响到筛选效果，因此需要根据实际情况进行调整。
培养时间筛选时间也直接影响到G418对细胞的毒性程度和筛选效果。
不同的细胞株和实验条件下，对筛选时间的选择有所不同。
通常初步筛选时间在24-48小时，细分筛选筛选时间需要根据实际情况进行判断。
细胞转染步骤
细胞转染步骤细胞转染是一种将外来脱氧核糖核酸（DNA）或核苷酸序列引入细胞内的技术。
这个过程可以用于研究基因功能、病毒感染和基因治疗。
在细胞转染过程中，有几个重要步骤需要注意。
下面是一个关于细胞转染步骤的简要介绍。
第1步：提取DNA或RNA在细胞转染前，需要先准备好DNA或RNA。
其中，DNA可通过PCR扩增、酵母合成，或从细胞中提取。
RNA则可通过反转录酶聚合酶链式反应（RT-PCR）反转录，然后进行DNA扩增。
第2步：选择转染方法目前有很多种不同的细胞转染方法，包括电穿孔、热休克、化学转染等。
要选择适合的转染方法，需要考虑许多因素，如细胞类型、转染效率和毒性等。
常用的转染剂有聚乙烯醇、脂质体、钙磷酸盐等。
第3步：制备转染复合物转染复合物是转染时添加的液体溶液，用于将DNA或RNA引入细胞。
制备复合物通常需要将DNA或RNA与转染剂混合，然后使其与乙醇或其他化学物质形成稳定的颗粒，最终形成复合物。
转染时需要将制备好的转染复合物直接加入培养基中，让细胞与其接触。
接触后，DNA或RNA会被吸附到细胞表面并被内吞到细胞内部。
转染过程通常需要一定程度的时间，具体时间取决于细胞类型和转染复合物的选用。
第5步：培养和维护转染成功后需要对细胞进行培养和维护。
这通常需要注意以下几个因素：1）细胞浸润度：细胞密度应该适合，以便观察细胞形态和产物的表达量。
2）培养基成分：为了保持细胞生长，需要选择适当的培养基成分。
3）药物筛选：转染后可能需要添加药物对细胞进行筛选，以便筛选出目标基因。
4）稳定性维护：为了保证目标基因稳定的表达，需要适当地维护和稳定细胞系。
以上是细胞转染过程中的几个关键步骤。
在进行细胞转染时，需要注意步骤的顺序和方法的选择，以便提高转染效率和成功率。
稳转细胞系筛选注意事项
稳转细胞系筛选注意事项稳转细胞系筛选是细胞工程和生物医学研究中非常重要的一环。
以下是关于稳定细胞系筛选的50条注意事项，并对每一条进行详细描述：1. 选择合适的细胞系来源：在进行稳转细胞系筛选前，首先要选择合适的细胞系来源，以确保细胞系的稳定性和易转染性。
常用的细胞系来源包括HEK293、CHO、MDCK等。
2. 确定转染条件：在进行稳转细胞系筛选前，需要确定适合的转染条件，包括转染试剂种类、浓度、转染时间和细胞密度等。
3. 标定荧光素酶检测试剂盒：在进行稳转细胞系筛选时，需要使用荧光素酶检测试剂盒来检测稳定转染细胞系的活性。
4. 建立适当的质粒载体：选择适当的质粒载体对稳转细胞系的构建和筛选至关重要。
常用的载体包括pCDNA3.1、pcDNA3.1+、pEGFP-N1等。
5. 筛选适宜的筛选标记物：在进行稳转细胞系筛选前，需要选择适宜的筛选标记物，如抗生素、蛋白荧光标记等。
6. 确定稳定转染细胞系的稳定性：在进行稳定转染细胞系筛选时，需要对转染细胞系的稳定性进行验证，通常采用长期培养和连续传代的方式来确保转染细胞系的稳定性。
7. 选择适合的培养基和培养条件：在进行稳转细胞系筛选时，需要选择适合的培养基和培养条件以促进细胞系的稳定生长和表达。
8. 确定荧光素酶基因的稳定插入：在进行稳转细胞系筛选前，需要确保荧光素酶基因在细胞基因组中的稳定插入，通常采用PCR、Southern blotting等方法来验证。
9. 考虑基因组的稳定性：在进行稳转细胞系筛选前，需要考虑基因组的稳定性，并尽量避免对细胞基因组的不良影响。
10. 确定筛选标准：在进行稳转细胞系筛选前，需要确定筛选标准，如荧光素酶基因活性的阈值、抗生素的最佳浓度等。
11. 使用酶切鉴定：使用酶切鉴定来确保质粒载体的正确构建和稳定转染细胞系的正确筛选。
12. 建立稳定转染细胞系的储备：在进行稳转细胞系筛选后，需要建立稳定转染细胞系的储备，以备后续实验使用。
sirna转染实验步骤及实验要点
sirna转染实验步骤及实验要点siRNA转染实验步骤如下：1.细胞接种：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度在30%左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。
2.转染过程：•取0.67μg (50pmol) 的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μl。
注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。
•取1μl的EntransterTM-R4000，然后加入24μl无血清稀释液体，充分混匀，制成EntransterTM-R4000稀释液，终体积为25μl。
室温静置5分钟。
•将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合（可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上）混合，室温静置15分钟。
转染复合物制备完成。
•将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基（可含10%血清和抗生素）的细胞上，前后移动培养皿，混合均匀。
注意：对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。
•转染后6小时观察细胞状态，如状态良好可不必更换培养基，继续培养24-96小时得到结果。
3.观察和检测：根据具体实验需求，可以在转染后的不同时间点观察细胞状态、检测基因表达、蛋白质表达等。
实验要点：1.细胞接种密度要适宜，一般在30%左右汇合度较好。
2.无血清稀释液的选择对于siRNA的稳定性和转染效率至关重要。
建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640等品牌。
3.在制备转染复合物时，要保证各个步骤的混合均匀，避免产生气泡。
4.在将转染复合物加入细胞时，要保证细胞的生存环境，避免对细胞造成损伤。
5.在转染后的观察和检测中，要注意保证实验结果的准确性和可靠性。
以上信息仅供参考，建议查阅专业文献获取更准确的信息。
真核转染稳定筛选标记及原理
G418。适用于所有的真核细胞
氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因选择系统
❖ 遗传标记：CAT，大肠杆菌Tn9转座子编码的催化氯霉素 乙酰化反应的蛋白质
❖ 编码产物：氯霉素乙酰转移酶 ❖ 筛选药物：氯霉素 ❖ 作用机理：真核细胞缺乏CAT，将CAT作为报告基因与目
的基因一起导入到真核细胞，可在加入氯霉素的培养基中 选择阳性细胞。常用于瞬时表达研究。
潮霉素抗性选择系统
❖ 遗传标记：HPH ❖ 编码产物：潮霉素B磷酸转移酶 ❖ 筛选药物：潮霉素B ❖ 作用机理：HPH灭活潮霉素B
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小组：周四班二组 组员：薛莹超（报告者）
滕达 曾欣宜 席杰 赖惠英 邓宇星
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外源基因表达的三个概念
分类
转化
通过生化或 者物理方法 将目的基因 导入原核细 胞中 。
转染
通过生化或 者物理方法 将目的基因 导入真核细 胞中 。
转导
通过病毒介导 ，用基因组中携 带有克隆目的片 断的病毒来感染 靶细胞。
死亡，而导入了外源基因的细胞成功存活，并且 在氨甲喋呤的选择压力下大量表达蛋白。
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT） 基因选择系统
❖ 遗传标记：XGPRT ❖ 编码产物：黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ❖ 筛选药物：霉酚酸
❖ 作用机理：XGPRT合成GMP。
哺乳动物细胞无XGPRT酶，不能利用黄嘌呤形成黄嘌 呤磷酸（XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）， 可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤磷酸（IMP）。哺乳动物细胞可 通过IMP生成GMP。当用IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了 GMP的合成，使细胞失去合成DNA能力而死亡。
Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤 注意事项
Invitrogen阳离子转染试剂Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤注意事项2010-07-10 16:16Invitrogen的细胞转染试剂：Lipofectamine 2000Lipofectamine 2000是最为人熟知的转染产品之一。
已知可为517种细胞（见下面连接地址）提供高转染效率（表达转基因细胞的百分数）和活性（细胞抽提物中转入基因的酶产物活性）。
特点两个关键性特点使得Lipofectamine 2000试剂的转染步骤快速简便：（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕（2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA 以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24－96小时检测结果。
下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。
转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。
细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。
对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。
Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA 混合。
保温时间过长会降低活性。
）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。
如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。
在室温保温20分钟。
稳转细胞系构建方法总结
稳转细胞系构建方法总结
稳定细胞系构建是生物学研究中非常重要的一部分，它可以用
于基因功能研究、药物筛选、疾病模型构建等多个领域。
稳定细胞
系的构建方法有多种，下面我将从多个角度对稳定细胞系构建方法
进行总结。
首先，稳定细胞系构建的关键步骤包括转染、筛选和鉴定。
转
染是将外源基因导入目标细胞中的过程，常用的转染方法包括化学法、电穿孔法和病毒载体法。
化学法包括钙磷沉淀法和脂质体转染法，电穿孔法则利用电脉冲使细胞膜通透性增加，病毒载体法则利
用病毒作为基因导入的载体。
转染后，需要进行筛选以筛选出含有
外源基因的稳定细胞系，通常使用抗生素筛选或者荧光蛋白标记等
方法。
最后，对所得到的细胞系进行鉴定，确认其是否稳定表达外
源基因。
其次，稳定细胞系构建的选择合适的细胞系也是非常重要的。
常用的细胞系包括HEK293、CHO、Hela等，选择合适的细胞系可以
影响到后续的稳定细胞系构建和应用效果。
另外，稳定细胞系构建方法还需要考虑外源基因的选择和构建。
外源基因可以是编码蛋白质的基因、RNA干扰基因、CRISPR-Cas9系统等，根据研究的需要选择合适的外源基因进行构建。
此外，稳定细胞系构建的过程中还需要考虑细胞毒性、稳定性和表达水平等因素，以确保所得到的稳定细胞系能够稳定、高效地表达外源基因。
总的来说，稳定细胞系构建是一个复杂的过程，需要综合考虑转染方法、细胞系选择、外源基因选择和构建以及细胞系鉴定等多个因素，才能够成功地构建稳定细胞系。
希望以上总结能够对你有所帮助。
用G418建立稳定细胞系
实验步骤1
1. 转染：
用CHO或者N2a细胞转染BACE-HA后培养48小时，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时；
2. 加G418:
去掉培养液，PBS洗一次，加入浓度为800ug/ml的G418筛选培养基。
3. 换液：
根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。
当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。
筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后；
4. 挑单克隆：
制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/5ul。
在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液5ul/孔。
待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。
5. 单克隆鉴定：
细胞大量扩增后，同时用原细胞系转染PCDNA3.1,并设置对照组即空白对照，提蛋白，做western blot检测。
实验步骤2
1. 将处于对数生长期的CHO或者N2a细胞按比例接种于12孔板，待细胞长到60%时转染。
转染方法同瞬时转染。
2. 待24-48小时后换为含800ug/mlG418的选择性培养基，将细胞按1:10稀释后稳定培养两周换为含600ug/mlG418的选择培养基
3. 将混合细胞吹打成单细胞悬浮计数，调整细胞数为每孔20个/孔，加入100ul含200ug/mlG418的选择培养基，待抗性克隆长出后挑选良好的克隆，逐步放大，压力由含200ug/mlG418的培养基增加至含800ug/mlG418的培养基继续筛选，最后稳定用含800ug/mlG418培养基培养。
慢病毒转染细胞的操作具体方法及步骤
慢病毒转染细胞的操作步骤
一、慢病毒转染贴壁细胞实验方法
1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×10^5/孔铺到24孔板中。
使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10^5/孔左右。
2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。
37℃孵育。
3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml 新鲜培养基以稀释polybrene。
4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。
5、继续培养。
如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。
如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。
如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。
二、慢病毒转染悬浮细胞实验方法
1、在2×10^5/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。
37℃孵育。
或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。
2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。
3、继续培养3-4天。
中间视细胞生长情况可传代或换液。
转染细胞的稳定筛选实验标准操作规程
转染细胞的稳定筛选实验标准操作规程（编号：019）1、目的及适用范围该SOP用来建立稳定表达目的蛋白的细胞系。
2、主要仪器及试剂CO2细胞培养箱、生物安全柜、酶标仪、转膜仪、电泳仪、DMEM培养基、胎牛血清、0.025%胰酶、筛选药物（抗生素）3、操作步骤3.1 确定抗生素作用的最佳浓度：不同的细胞株对各种抗生素有不同的敏感性，因此在筛选前要做预试验，确定抗生素对所选择细胞的最低作用浓度。
3.1.1提前24h在96孔板或24孔板中接种细胞8孔，接种量以第二天长成25%单层为宜，置CO2细胞培养箱中37℃培养过夜。
3.1.2 将培养液换成含抗生素的培养基，抗生素浓度按梯度递增（如：0, 50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000μg/mL），此梯度因抗生素而异。
3.1.3培养10-14d以绝大部分细胞死亡浓度为准,筛选稳定表达克隆时可比该浓度适当提高一个级别，维持时使用筛选浓度的一半。
3.2 转染按转染试剂说明书步骤进行。
3.3 转染48h后按1:10的比例将转染细胞传代到6孔板中，换成含预试验中确定的抗生素浓度的选择培养基。
在6孔板内可见单个细胞，继续培养可见单个细胞分裂繁殖形成单个抗性集落，此时可用两种方法挑选单克隆。
3.3.1滤纸片法：用消毒的5×5mm滤纸片浸过胰酶,将滤纸片贴在单细胞集落上10-15s，取出粘附有细胞的滤纸片放于24孔板中继续加压培养。
细胞在24孔板中长满后转入35mm培养皿中，长满后再转入10cm皿中扩大培养。
3.3.2有限稀释法：将细胞消化下来后做连续的10倍稀释（10-2～10-10），将每一稀释度的细胞滴加到96孔培养板中培养，7-10d后，选择单个克隆生长的孔再一次进行克隆。
3.4 ELISA或Western blot检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况由于不同克隆的表达水平存在差异因此可同时挑选多个克隆选择表达量最高的克隆传代并保种。
稳定转染步骤范文
稳定转染步骤范文稳定转染是指将外源基因或RNA通过载体引入目标细胞，并使其在细胞中稳定存在和表达。
稳定转染在生物医学研究和基因治疗等领域扮演着重要的角色，因为它可以使目标细胞长期稳定地表达外源基因，以实现相关研究或治疗的目的。
下面是稳定转染的一般步骤：1.选择适当的载体：选择合适的载体是稳定转染的第一步。
常用的载体包括质粒、病毒和质体等。
质粒是最常用的载体之一，它具有较大的载体容量，便于实验操作，且没有传染性。
病毒能够高效转染目标细胞，但需要确保安全性，避免病毒复制和毒性对细胞的影响。
质体是构建稳定转染细胞株的另一种选择，其使用较为复杂，但稳定性较好。
2.插入目标基因：将目标基因插入到选定的载体中。
基因的插入可以通过限制性内切酶切割和连接等方法实现。
确保插入的基因与载体配对后形成完整的DNA分子。
3.构建稳定转染细胞株：将含有插入目标基因的载体转染入目标细胞中。
转染方法包括化学法、电穿孔法、微粒轰击法和病毒感染法等。
其中，化学法最为常用，其通过化学品改变细胞膜的通透性来促进外源基因的转染。
4.选择处理：添加适当的选择抗生素或标记物来选择转染成功的细胞。
常用的选择剂包括抗生素G418和新霉素等。
由于稳定转染的成功率较低，这一步骤的目的是选择和培养含有插入基因的稳定转染细胞克隆。
5.扩增和筛选稳定转染细胞：将转染成功的细胞株进行扩增培养，并通过PCR、荧光显微镜观察和免疫标记等方法筛选出稳定转染的细胞株。
6. 确认并分析稳定转染细胞株：鉴定细胞株中目标基因的表达情况。
可以通过Western blot、RT-qPCR等方法来检测外源基因的表达水平，并通过细胞功能实验来研究基因在细胞中的功能。
7.建立稳定转染细胞株库：将稳定转染的细胞株进行存储和保存，以备将来使用。
总结：稳定转染是通过引入外源基因或RNA，使其在目标细胞中长期稳定地表达。
稳定转染的步骤包括选择适当的载体、插入目标基因、转染目标细胞、选择处理、扩增和筛选稳定转染细胞、确认并分析稳定转染细胞株以及建立稳定转染细胞株库等。
详细描述细胞转染步骤
详细描述细胞转染步骤细胞转染是指将外源DNA或RNA引入细胞内，使其表达或干扰靶基因的过程。
该技术在基因工程、药物筛选和疾病研究中发挥着重要作用。
下面将详细介绍细胞转染的步骤。
1. 细胞培养准备在进行细胞转染之前，首先需要准备好细胞培养基和细胞。
常用的细胞包括哺乳动物细胞（如HEK293细胞、HeLa细胞等）和昆虫细胞（如Sf9细胞、S2细胞等）。
细胞应保持在良好的生长状态，通常需要在无菌条件下培养，并在适当的培养基中维持其生长。
2. DNA/RNA准备在进行细胞转染之前，需要准备好要转染的DNA或RNA。
DNA可以是质粒DNA、线性DNA或合成DNA，而RNA可以是mRNA或siRNA。
这些外源DNA/RNA应在实验室中进行合成或提取，并经过纯化、测序等步骤进行质检。
3. 转染试剂选择根据实验需要和细胞类型的特点，选择合适的转染试剂。
常用的转染试剂包括离子脂质体、阳离子聚合物和电穿孔等。
离子脂质体适用于多种细胞类型，而阳离子聚合物则更适用于特定细胞类型。
电穿孔则可用于绝大多数细胞类型。
4. 转染操作将细胞用适当的细胞培养基进行洗涤，以去除残留的培养基和细胞代谢物。
然后将细胞转移到新的培养基中，并使其适应新的培养条件。
接下来，将转染试剂与DNA/RNA混合，并在室温下孵育一段时间，以使其形成复合物。
然后将复合物加入到细胞培养基中，与细胞进行共培养。
5. 转染后处理转染后，细胞需要在适当的培养条件下继续培养，以使其表达或干扰靶基因。
在此期间，可以根据实验需要添加适当的选择抗生素或标记物，以筛选或鉴定转染细胞。
同时，还可以通过荧光显微镜观察转染效率，并进行定量分析。
6. 细胞检测和分析在转染后的一段时间内，可以通过PCR、RT-PCR、Western blot等方法，检测和分析靶基因的表达或干扰效果。
此外，还可以通过细胞增殖、凋亡、迁移等实验，研究转染对细胞生物学行为的影响。
7. 数据分析和结果解读根据实验结果，进行数据分析和结果解读。
稳转株的建立与筛选
稳转株的建立与筛选
稳转株的建立与筛选是一种利用染色体工程技术实现长期稳定地保存和表达特定基因的方法。
稳转株的建立具有重要的科学价值，可以大大提升研究的效率，进而加快新药的研发速度。
稳转株的建立主要包括三个步骤：1.基因构建；2.转染载体构建；3. 稳转株建立。
1.基因构建是将转染基因构建成转染载体所需要的形式。
一般来说，需要经过PCR扩增、DNA合成、引物设计等步骤，最终得到最终的基因构建。
2.转染载体构建是将基因与转染载体结合起来，使基因能够被转染载体携带，并且可以被细胞内表达。
一般来说，转染载体构建需要进行DNA合成、PCR扩增、克隆、测序验证等步骤。
3.稳转株建立是将转染载体转染到目标细胞中，并获得稳定表达特定基因的稳转株。
一般来说，稳转株建立包括转染载体转染、筛选和稳定性验证等步骤。
转染载体转染是将转染载体转染到细胞内的过程，可以通过质粒转染、质粒融合、质粒导入、病毒感染等方法来实现。
筛选是将转染后的细胞分为稳定表达和不稳定表达两类，以获得稳定表达特定基因的细胞株，常用的筛选方法有抗性筛选、荧光筛选等。
稳定性验证是在筛选后，通过RT-PCR、Western blot、荧光免疫等方法，来证明稳转株能够稳定表达特定基因。
建立稳转株后，还需要进行稳定性监测，以确保稳转株能够稳定表达特定基因。
除了上述方法，也可以采用其他方法如遗传筛选、生物信息学分析等来进行稳定性监测。
总之，稳转株的建立与筛选是一个复杂的过程，需要经过基因构建、转染载体构建、转染载体转染、筛选和稳定性验证等步骤，最终获得稳定表达特定基因的稳转株。
转染细胞的稳定筛选方法和实验步骤
转染细胞的稳定筛选1、药物筛选前的准备药筛前应确定药物筛选浓度，不同细胞系具有不同的药物敏感度，因此在筛选前应该用在药物浓度范围内设定浓度梯度来确定筛选稳定克隆的药物浓度。
药物浓度一般确定为能使未转染细胞在7天之内全部死亡，如G418一般需要7天，而puro一般时间很短，只需要3—4天即可.2、药物筛选注意事项（1)药筛的时间加药时间一般为转染后48h。
但由于慢病毒表达较慢,因此利用慢病毒感染将质粒转入细胞的方法，加药时间一般为72h空白对照加药筛选时，最好设置空白对照，即未转染细胞同时加药，待空白对照中细胞全部死亡,转染组中不具有抗药性的细胞基本药杀完,但还需继续加药。
(2)换液如果加药后,细胞死亡较多,需及时换液，以防死细胞释放有害物质导致具有抗药性的细胞死亡。
另外，随着细胞的代谢,抗生素的活性会降低,因此,每隔3-5天应更换一次抗生素筛选培养液。
3、克隆筛选注意事项若转染的质粒带有荧光标记，不管是以下哪种筛选克隆的方法，都应该选择带有荧光较强的细胞克隆,因为加药筛选时，可能会产生耐药性的细胞，因此最好选择带有荧光较强的细胞.若是转染的质粒不带有荧光，那么只能盲挑.不管是带有或者不带有荧光标记，都应该挑出克隆后进行验证，验证存在不成功的概率。
因此，挑克隆时，应尽量多挑几个克隆，20个左右。
4、稳定克隆筛选步骤(1）有限稀释法步骤a)将药筛后的细胞（一般长满六孔板即可,若细胞生长很快药筛时可以在10cm的dish中进行）用胰酶消化下来b)对消化后的细胞悬液进行计数（如果细胞数量过大，可先稀释后计数）c)计算后，用枪头吸取约200个细胞（其中有部分为死细胞)到10ml培养液中充分混匀，剩下的大部分细胞冻存保种d)然后将以上10ml细胞悬液加到96孔板中,每孔100ul,这样有的孔就可能只有一个细胞，过程中注意不时用枪头吹打混匀细胞悬液(一个96孔板得到的克隆可能较少，可以用同样的方法做2-3个96孔板）e)待细胞贴壁后,逐孔在显微镜下观察，没有细胞或者多余一个细胞的孔划叉，只有一个细胞的孔划勾，以做好标记，如果只有一个细胞的孔数量太少，可将一个孔内有两个细胞的孔也划勾,但这样克隆就可能不纯。
G418筛选稳定转染步骤
1.G418的配制：方案一：300mgG418加入3ml PBS溶液，浓度为100mg/ml，完全溶解后，0.22um过滤，-20℃保存。
方案二：（1）配制1M HEPES：23.8g HEPES（缓冲能力更强）粉末溶于100ml ddH2O，10NNaOH（加量较多）调节pH至7.3，过滤除菌（较难过滤），4℃保存，终浓度为1mol/L。
（2）5g G418溶于10ml 1M HEPES（pH7.3），终浓度为500mg/ml，-20℃保存。
注：实验中采用方案二时效果较好。
2.制备筛选培养基：用培养基将G418稀释为0 ug/ml、200 ug/ml、300 ug/ml、400 ug/ml、500 ug/ml、600 ug/ml、700 ug/ml、800 ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml、1100ug/ml、1200ug/ml24孔板，每孔1ml培养基（含有G418的完全培养基），每个浓度4个重复，则每次换液需各个浓度培养基4ml，现用现配。
200ug/ml300ug/ml400ug/ml500ug/ml600ug/ml700ug/ml800ug/ml900ug/ml10 00ug/ml1100 ug/ml1200 ug/ml3ml完全培养基998.4997.6996..2994.4993.6992..2990.4G418(500mg/ml)1.6ul2.4ul3.2ul4.0ul4.8ul5.6ul6.4ul7.2ul8.0ul8.8ul9.6ul3.细胞培养：将冻存的细胞复苏培养，，传代3至4次使细胞达到良好的生长状态,铺24孔板（200/孔），12h换液，加筛选培养基培养。
4.确定G418最佳筛选浓度：将培养孔中培养基吸除，PBS洗涤一次，每孔加入不同浓度筛选培养基，隔天更换一次筛选培养基，培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准。
注：实验中所确定的最佳筛选浓度为1200ug/ml。
细胞稳定转染方法
G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
稳转细胞系构建-ZXD
稳转细胞构建
构建载体（过表达/干扰） 慢病毒包装
细胞复苏、传代 嘌呤霉素浓度筛选
慢病毒感染 筛选抗性细胞 鉴定及扩大培养
稳转细胞系建
1、载体构建及慢病毒包装（略） 2、细胞复苏及传代 3、确定嘌呤霉素最优筛选浓度：
1）培养待转染（而不是转染后）的细胞。 2）取对数生长期的细胞，用培养基制成细胞密度为1.5×105 个/ml的细胞悬液。 3）96孔培养板每孔加入100ul细胞悬液（使每孔细胞数在1.5×104个），37℃培养箱中培养 过夜。 4）分别加入不同浓度嘌呤霉素，使终浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.8μg/ml，每日检查细 胞活力，筛选出最佳浓度。
Thanks！
稳转细胞系筛选实验
简介
稳定转染就是转染的质粒DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期 表达目的基因及蛋白。需要在瞬时转染基础上对靶细胞进行筛选或者应用高 转染效率的病毒，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物进 行细胞传代，从而得到可稳定表达目的基因的细胞系。 筛选稳定细胞系有两种方法： 1）转染质粒后，筛选获得稳转细胞系； 2）慢病毒感染筛选稳定细胞系。慢病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法 更方便和高效，是目前主流的稳定细胞系筛选方法。 应用： 1）基因过表达服务 2）shRNA 干扰服务 3）miRNA过表达 4）任意非编码基因的过表达
简介
为什么要挑选单克隆细胞 多克隆细胞株筛选比较快速，费用较低。 单克隆细胞株筛选周期长，费用高。 多克隆细胞系构建成功后由于不同细胞克隆生长速度不一致，目的基因表达 量比较低的细胞克隆增殖速度一般更快，因此在最初的10代左右会观察到表 达量逐渐下降，最后高表达量低增殖速度的细胞消失，低到中等表达量的细 胞组成稳定表达克隆。 对于转染效率和表达效率低的细胞系，多克隆细胞筛选得到的细胞系中目的 基因的表达量有可能不能满足实验要求。 单克隆细胞系在细胞克隆挑选后可以对目的基因表达量进行检测，挑选出高 表达的细胞克隆进行培养。这一步骤在转染效率低的细胞株中尤其重要。 做细胞亚定位的稳定细胞系，存在表达量过低、荧光信号不够强，以及表达 量过高、荧光蛋白聚集导致不能正确定位两种问题。单克隆细胞系挑选可以 直接选出定位正确的细胞克隆。
稳定转染(质粒转染)
2、特殊细胞（质粒转染）
服务流程
（1）根据细胞特点、实验特点或实验需求，设计实验方案并与客户讨论确定实验方案；
（2）进行预实验，通过转染含有GFP报告基因的质粒确定最佳转染试剂，并优化转染条曲线绘制；
（2）转染质粒，铺板，用不同抗生素浓度筛选细胞单克隆；
（3）qPCR和WB检测稳定克隆的外源基因表达水平。
客户提供
待转染细胞株，待转染的质粒，质粒测序结果，目的基因相关信息，目的蛋白抗体。
我们提供
细胞培养、转染试剂、选择性抗生素，稳定的单克隆细胞株2株，Q-PCR检测结果，Western blot检测结果及实验方法报告单。
质量保证
筛选出的细胞单克隆的外源基因的表达水平与含有空载质粒的细胞单克隆相比具有统计学意义上的显著差异。
（4）转染质粒，铺板，用不同抗生素浓度筛选细胞单克隆；
（5）qPCR和WB检测稳定克隆的外源基因表达水平。
客户提供
待转染细胞株，待转染的质粒，质粒测序结果，实验中必需的特殊试剂，目的基因相关信息，目的蛋白抗体。
我们提供
细胞培养、转染试剂、选择性抗生素，稳定的单克隆细胞株2株，Q-PCR检测结果，Western blot检测结果及实验方法报告单。
稳转细胞系筛选注意事项
稳转细胞系筛选注意事项一、实验步骤1. 实验前准备：实验前要穿戴好防护服、手套、口罩等防护用品，确保实验室安全。
2. 细胞复苏：将冷冻保存的细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，轻轻摇动冻存管，使其迅速融化。
然后打开冻存管，将细胞悬液转移至15ml离心管中，加入适量培养基，吹匀后离心。
3. 细胞计数：将离心后的细胞悬液加入血球计数板，在显微镜下观察并计数。
4. 细胞接种：将细胞悬液接种到培养皿中，放入培养箱中培养。
5. 药物处理：根据实验需要，向培养皿中加入不同浓度的药物，观察细胞的生长情况。
6. 细胞收获：当细胞生长到一定数量时，用胰酶消化并收集细胞。
7. 基因检测：将收集的细胞进行基因检测，验证稳转细胞系的筛选是否成功。
8. 数据分析：对实验数据进行统计分析，得出结论。
二、注意事项1. 实验操作过程中要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污染。
2. 在处理细胞时要轻柔操作，避免对细胞造成损伤。
3. 在加入药物时要准确控制浓度和作用时间，避免对细胞造成毒性作用。
4. 在进行基因检测时要确保引物和探针的特异性，避免假阳性或假阴性结果。
5. 在数据分析时要考虑到实验的重复性和可重复性，避免误差和偏差。
6. 在实验过程中要保持实验室的清洁卫生，及时清理废弃物和垃圾。
7. 在实验结束后要及时记录实验数据和结果，并进行总结和归纳。
8. 在进行稳转细胞系筛选时要注意选择合适的筛选标记物，以确保筛选结果的准确性和可靠性。
9. 在进行基因检测时要注意选择合适的检测方法和技术，以确保检测结果的准确性和可靠性。
10. 在进行稳转细胞系筛选时要注意控制细胞的生长条件和环境因素，以确保细胞的生长和表型特征的稳定性。
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转染细胞的稳定筛选
1、药物筛选前的准备
药筛前应确定药物筛选浓度，不同细胞系具有不同的药物敏感度，因此在筛选前应该用在药物浓度范围内设定浓度梯度来确定筛选稳定克隆的药物浓度。
药物浓度一般确定为能使未转染细胞在7天之内全部死亡，如G418一般需要7天，而puro一般时间很短，只需要3-4天即可。
2、药物筛选注意事项
（1）药筛的时间
加药时间一般为转染后48h。
但由于慢病毒表达较慢，因此利用慢病毒感染将质粒转入细胞的方法，加药时间一般为72h
空白对照
加药筛选时，最好设置空白对照，即未转染细胞同时加药，待空白对照中细胞全部死亡，转染组中不具有抗药性的细胞基本药杀完，但还需继续加药。
（2）换液
如果加药后，细胞死亡较多，需及时换液，以防死细胞释放有害物质导致具有抗药性的细胞死亡。
另外，随着细胞的代谢，抗生素的活性会降低，因此，每隔3-5天应更换一次抗生素筛选培养液。
3、克隆筛选注意事项
若转染的质粒带有荧光标记，不管是以下哪种筛选克隆的方法，都应该选择带有荧光较强的细胞克隆，因为加药筛选时，可能会产生耐药性的细胞，因此最好选择带有荧光较强的细胞。
若是转染的质粒不带有荧光，那么只能盲挑。
不管是带有或者不带有荧光标记，都应该挑出克隆后进行验证，验证存在不成功的概率。
因此，挑克隆时，应尽量多挑几个克隆，20个左右。
4、稳定克隆筛选步骤
（1）有限稀释法步骤
a)将药筛后的细胞（一般长满六孔板即可,若细胞生长很快药筛时可以在
10cm的dish中进行）用胰酶消化下来
b)对消化后的细胞悬液进行计数（如果细胞数量过大，可先稀释后计数）
c)计算后，用枪头吸取约200个细胞（其中有部分为死细胞）到10ml培养
液中充分混匀，剩下的大部分细胞冻存保种
d)然后将以上10ml细胞悬液加到96孔板中，每孔100ul，这样有的孔就可
能只有一个细胞，过程中注意不时用枪头吹打混匀细胞悬液（一个96孔
板得到的克隆可能较少，可以用同样的方法做2-3个96孔板）
e)待细胞贴壁后，逐孔在显微镜下观察，没有细胞或者多余一个细胞的孔
划叉，只有一个细胞的孔划勾，以做好标记，如果只有一个细胞的孔数
量太少，可将一个孔内有两个细胞的孔也划勾，但这样克隆就可能不纯。
f)等细胞长起来以后，从96孔板到24孔板，再到6孔板逐渐扩大培养
g)细胞分6孔板中养起来后，可分出部分细胞提蛋白，用western验证克隆
是否为我们所需要的克隆，也可以用RT-PCR进行验证，若验证发现克
隆并不是所需要的克隆，即失败的克隆，就扔掉，保留验证成功的克隆
并大量培养
h)首次验证成功的克隆养两周后再次验证，若仍能保持特性，表示筛出的
克隆较稳定，这样较为稳定克隆即可大量培养保种，并进行后续实验（2）无限稀释法
a)将药筛后的细胞（一般长满六孔板即可）用胰酶消化下来
b)对消化后的细胞悬液进行计数（如果细胞数量过大，可先稀释后计数）
c)计算后，吸出约5000个细胞，铺到10cm的dish中，摇匀
d)待细胞贴壁后，在显微镜下找到单个细胞，用马克笔在dish的底部做好
标记，然后放到孵箱里培养
e)待单个细胞长成了细胞团（约10个），在显微镜下观察，如果有两个细
胞团靠得很近，则用马克笔在底部做好标记，然后在安全柜内用白枪头
刮掉周围舍弃的细胞团，并不断在显微镜下观察，看周围的细胞是否已
经都被刮掉。
然后换培养液（将刮掉的细胞弃去）
f)放到孵箱里培养数天（细胞团较大，约一两百个），克隆在肉眼下可见
g)将培养液倒掉，用PBS洗两遍，再吸10ul的胰酶在标记好细胞团的地方
不停的快速吹打约1-2min，最后将枪头里细胞悬液打到24孔板内培养
即为挑出的一个克隆，此过程切记不能过长，以免dish太干导致细胞死
亡
h)照7的方法每种细胞至少挑出15个克隆，培养一段时间后，消化到六孔
板中培养（处理时间根据24孔板内的细胞数量而定）
i)细胞分6孔板中养起来后，可分出部分细胞提蛋白，用western验证克隆
是否为我们所需要的克隆，也可以用RT-PCR进行验证，若验证发现克
隆并不是所需要的克隆，即失败的克隆，就扔掉，保留验证成功的克隆
并大量培养
j)首次验证成功的克隆养两周后再次验证，若仍能保持特性，表示筛出的克隆较稳定，这样较为稳定克隆即可大量培养保种，并进行后续实验。