第四章 高效毛细管电泳

3. 缓冲溶液的浓度

浓度增加，离子强度增加，改善分离 浓度增加，电渗率降低，迁移时间延长

浓度增加，导电的离子数增加，焦耳热增加
4. 缓冲溶液的pH

影响溶质的电荷：pH低于溶质的等电点时，溶质带正 电荷；反之，带负电荷

引起电渗的变化：在高pH下，电渗很大
胶束电动毛细管色谱MECC
以胶束为假固定相的一种电动色谱
唯一因素 吸附：毛细管管壁对于被分离物质粒子的作用
阳离子溶质和带负电的管壁的离子相互作用
疏水作用 毛细管内表面积和体积比越大，吸附的可能性也越大
4.CE的分离模式
1. 毛细管区带电泳(capilary zone electrophoresis,CZE) CZE的分离机理是基于各被分离物质的净电荷与质量比(荷 质比)间的差异。应用范围包括氨基酸、肽、蛋白、离子分 析、对映体拆分和很多其它离子态物质的分析。


改变流动相来调节选择性
毛细管凝胶电泳CGE
将平板电泳中的凝胶用到毛细管中作支持物进行电泳，不同
体积的溶质分子在起“分子筛”作用的凝胶中得以分离。
常用凝胶：聚丙烯酰胺、葡聚糖、琼脂糖等
应用：蛋白质、核苷酸、RNA、DNA片段分离和测序、聚合
酶链反应产物分析等等
5. 毛细管电泳结构
基本结构：
3. 毛细管电泳基础理论
3.1 电泳：在电场作用下带电粒子在缓冲溶液中的定向移动。
uep ep E uep电泳（electrophoresis）速度 E为电场强度
ep为电泳淌度，即溶质在 单位电场强度下
单位时间内移动的距离
ep
i 4
为介质的介电常数 为介质的粘度 i是粒子的Zeta电势，近似地正比于
经典电泳法的局限性：难以克服由两端高电压引起的电解质
离子流的自热，自热影响随电场强度额增大而迅速加剧，因 而限制了高压的使用。
毛细管电泳：散热在效率很高的毛细管内进行，可以应用高
电压，极大改善分离效果。
作用原理：电泳原理和色谱原理 带电粒子在一定介质中因电场作用而产生定向运动，因带电

1. 分离电压

柱长一定时，电压增加，粒子迁移加快，柱内焦耳热增加 在一定范围内柱效随电压的升高而升高，过了极点后，焦 耳热影响加剧，反而下降。 直接影响粒子的迁移和分离 要求：缓冲容量好、在检测波长处吸收低、自身淌度低、 与等电点相差约1个pH单位、尽量用酸性。

2. 缓冲溶液的种类


组分在电场作用下，因电迁移和电渗作用进入毛细管内 对离子组分存在进样偏向
压力进样
将毛细管两端置于不同的压力环境中时，管中溶液即能流动，将样品带
入
无组分偏向，选择性差
扩散进样 利用浓差扩散，抑制背景干扰和进样偏向 检测： 紫外检测、激光诱导荧光检测
6.毛细管电泳的应用
1. 农药制剂和原药有效成分的测定 3. 在生物化学中杂质的分离和测定 4. 在手性药物分析中的应用
高压电源、进样、填灌/清洗、毛细管、温度控制、检测、记录/处理
清洗系统 毛细管 检测器
记录和数 据处理 电极槽和 进样系统 恒温系统 电极槽 铂电极
高压电源：0～30 kV直流高压电源
毛细管柱：化学惰性、电惰性，可以透光；
聚四氟乙烯、玻璃、石英；

内径25～75um，管长<70cm。 进样： 电动进样
粒子所带的电荷数、带电粒子形状、解离度等不同，带电粒 子在电解质中迁移速度不同而分离。------差速迁移过程。
特点：和HPLC 相比，都属于液相分离技术。 但是： 柱效高，可达105～106/m 分离速度快，几十秒～几十分钟
溶剂和试样消耗极少
没有高压泵，仪器成本比HPLC更低 选择性强
自由溶液电泳的分离效率受焦耳热的限制，只能在低电场
强度下进行操作，使分析时间和分离效率很低。 1967年，Hjerten最早提出了用小内径管在高电场下进行 自由溶液的电泳。 1981年，Jorgenson和Luckas发表了划时代的研究工作， 用75um内径石英毛细管进行电泳，电迁移进样，荧光柱上 检测丹酰化氨基酸，达到400000块/m理论塔板数的高效率 。从此跨入高效毛细管电泳的时代。
3.毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis，CGE)
CGE是将凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。不同体积 的溶质分子在起“分子筛”作用的凝胶中电泳分离。常用于蛋 白质、寡聚核苷酸、RNA、DNA片断分离和测序及PCR产物分析。 现在还有采用无胶筛分方法，同样可达分离目的。
4.毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusing，CIEF) CIEF是用两性电解质在毛细管内建立pH梯度，使各种具有不 同等电点的蛋白质在电场作用下迁移到等电点的位置，形成一 非常窄的聚焦区带。已成功用于测定蛋白质等电点，分离异构 体或用其它方法难于分离的蛋白质。
毛细管区带电泳CZE
2. 概况
电泳（electrophoresis）是电解质中带电粒子在电场作用下向 相反方向迁移的现象，利用此现象对物质进行分离分析的方 法，称为电泳法。
毛细管电泳（capillary elecrophoresis, CE）是以高压电场为
驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度 和分配行为上的差异而实现分离分析的液相分离方法。
uos为电渗速度
os为电渗率（电渗淌度） os为管壁的Zeta电势
Hale Waihona Puke Baidu
在毛细管电泳中，同时存在着电泳流和电渗流，粒子在毛细 管内的运动速度是这两种速度的矢量和：
uap uef uos ( ep os ) E
ap ep os
uap为表观迁移速度
ap为表观淌度
组 分 正离子 中性分子 负离子 表观淌度 ef + os os os - ef 表观迁移速度 uef + uos uos uos - uef
3.3 引起谱带展宽的因素
谱带展宽：柱内溶液和溶质本身：自热、扩散、吸附
来源于系统：进样和检测
1. 流型
扁平型塞子流模型
抛物面动力学模型
产生的原因： 毛细管直径大； 内部的自热过大； 液体和固体表面接触处的摩擦力导致压力过低。
1.毛细管电泳的发展
1807～1809年，俄国物理学家F.F.Reuss首次发现黏土颗
粒的电迁移现象。 1907年，Field和Teague首次用电泳成功分离了白喉毒素 和它的抗体。 1937年，瑞典科学家将人血清提取的蛋白质混合液放在两 段缓冲溶液之间，两端加电压，第一次分离出白蛋白和 、、-球蛋白。 Tiselius还制成了第一台电泳仪并进行 了第一次自由溶液电泳。他因对电泳技术的发展和应用的 巨大贡献而获得1948年诺贝尔化学奖。
2 胶束电动色谱 (micellar electro kinetic capillary chromatography，MECC) MECC是唯一既能分离中性溶质又能分离带电组分的CE模式。 采用表面活性剂(如十二烷基硫酸钠，SDS)在操作缓冲液内 形成有一疏水内核、外部带负电的胶束相。利用溶质具有不 同的疏水性，在水相和胶束相(准固定相)间分配的差异得以 分离。主要用于小分子、中性化合物，手性对映体、各种药 物等。
在电泳缓冲溶液中加入表面活性剂，当溶液中表面活性剂
浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂中的疏水基团可形 成胶束，溶质因淌度和分配系数的不同而分离。 胶束假固定相 表面活性剂：亲水基＋疏水基 疏水基：直链或支链烷烃 亲水基：阳离子、阴离子、两性离子基团

增加了带电离子胶束相，其具有与周围介质不同的 淌度，并且可以与溶质互相作用 导电的水溶液相是分离载体的溶剂
2. 自热
电流通过缓冲溶液时产生的焦耳热
自热导致径向温度梯度，因而产生离子迁移速度的径向不
均匀分布，使谱带展宽， 塔板高度增加，分离效率降低。 管内径小，管外径大，可减小自热引起的温度差 如：内径50um，外径375um
3. 扩散和吸附
扩散：在毛细管电泳中，溶质纵向扩散是谱带展宽的
ef i i i ep ef 为有效淌度 i 为样品分子的第 i级离解度 i 为活度系数或其他平衡 离解度
Z M2/3
3.2 电渗：液体相对于带电的管壁移动的现象。 石英的等电点约为1.5，在常用缓冲溶液中(pH>2)，管 壁带负电。
os uos os E E