高效液相色谱分离检测技术详解演示文稿
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高效液相色谱法 PPT课件
①固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
仪器分析课件高效液相色谱法详解演示文稿
第8页，共71页。
高效液相色谱法与经典液相色谱法：
高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大 优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高
速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。 由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效 液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达
103cm·min-1。
第9页，共71页。
第34页，共71页。
• 选择流动相的基本原则是极性大的试样用极性较强 的流动相，极性小的则用低极性流动相。
• 为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多 种不同极性的溶剂混合起来使用，如果试样组分的分 配比值范围很广，则采用梯度洗脱。
第35页，共71页。
16-3-4 应用
液固色谱最适宜分离那些溶解在非极性溶剂中、具有中 等相对分子质量且为非离子型的试样。 特别适用于分离异构体。
• 极性吸附剂又分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性吸附剂包 括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化镁和聚酰胺 等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。碱性吸附 剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧酸和吡咯衍生物。
• 最常用的是硅胶，其次是氧化铝。很多薄层色谱和经典色谱 是用硅胶进行分离的。现代液相色谱中硅胶不仅作为液固吸 附色谱固定相，还可作为液液分配色谱的载体和键合相色谱 填料的基体。表16-2。
第23页，共71页。
外梯度:
利用两台高压输液泵， 将两种不同极性的溶剂按一 定的比例送入梯度混合室， 混合后进入色谱柱。
内梯度:
一台高压泵, 通过比例 调节阀，将两种或多种不 同极性的溶剂按一定的比 例抽入高压泵中混合。
第24页，共71页。
梯度洗脱的实质是通过不断的变化流动相的强度，来
调整混合试样中各组分的k’值，使所有谱带都以最佳 平均k’值通过色谱柱。它在液相色谱分离中所起的作 用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在 梯度洗脱中溶质k’值的变化是通过改变溶剂的极性、
高效液相色谱法与经典液相色谱法：
高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大 优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高
速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。 由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效 液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达
103cm·min-1。
第9页，共71页。
第34页，共71页。
• 选择流动相的基本原则是极性大的试样用极性较强 的流动相，极性小的则用低极性流动相。
• 为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多 种不同极性的溶剂混合起来使用，如果试样组分的分 配比值范围很广，则采用梯度洗脱。
第35页，共71页。
16-3-4 应用
液固色谱最适宜分离那些溶解在非极性溶剂中、具有中 等相对分子质量且为非离子型的试样。 特别适用于分离异构体。
• 极性吸附剂又分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性吸附剂包 括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化镁和聚酰胺 等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。碱性吸附 剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧酸和吡咯衍生物。
• 最常用的是硅胶，其次是氧化铝。很多薄层色谱和经典色谱 是用硅胶进行分离的。现代液相色谱中硅胶不仅作为液固吸 附色谱固定相，还可作为液液分配色谱的载体和键合相色谱 填料的基体。表16-2。
第23页，共71页。
外梯度:
利用两台高压输液泵， 将两种不同极性的溶剂按一 定的比例送入梯度混合室， 混合后进入色谱柱。
内梯度:
一台高压泵, 通过比例 调节阀，将两种或多种不 同极性的溶剂按一定的比 例抽入高压泵中混合。
第24页，共71页。
梯度洗脱的实质是通过不断的变化流动相的强度，来
调整混合试样中各组分的k’值，使所有谱带都以最佳 平均k’值通过色谱柱。它在液相色谱分离中所起的作 用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在 梯度洗脱中溶质k’值的变化是通过改变溶剂的极性、
实验高效液相色谱法详解演示文稿
并退回到正常的测量状态
5.将电极插入到被测液中,调节pH到所需值
当前第10页\共有30页\编于星期四\17点
前处理
(1)过滤：0.45um或更小孔径滤膜
目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤
其是使用无机盐配制的缓冲液。
滤膜类型：
聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐
醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水溶剂 尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于 强酸，不适用于二甲基甲酰胺。
泵头 进口单向阀
单向阀结构
注意： 请不要分解阀心A和阀心B
重新组装后性能不被保证，输液可能不稳定
当前第28页\共有30页\编于星期四\17点
线路过滤器
线路过滤器 压力传感器
故障：堵塞
现象：系统压力偏高
措施：异丙醇（或5％稀硝酸），
超声波清洗 判断依据：关闭排液阀，断开出口管路，设定流速
1mL/min，如压力>0.5MPa，则堵塞。
再生纤维素滤膜：同样适用于水溶性样品和有机溶剂
当前第11页\共有30页\编于星期四\17点
3.测定
色谱条件: 色谱柱:C18 ,4.6mm×150mm; 流动相: 甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液(5+95); 流速:1ml/min 检测波长:230nm
取样品处理液和标准系列溶液各10µl注入高效液 相色谱仪进行分离,以其标准溶液峰的保留时间为依 据进行定性。以标准溶液的浓度为横坐标, 相应的峰面积为纵坐标,分别绘制标准曲线(或计算回归 方程),从标准曲线上查出(或根据回归方程求出)样液中 被测物质的含量,按下式计算:
r
1
1
1
线性范围(mg/mL)
0～0.2
5.将电极插入到被测液中,调节pH到所需值
当前第10页\共有30页\编于星期四\17点
前处理
(1)过滤：0.45um或更小孔径滤膜
目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤
其是使用无机盐配制的缓冲液。
滤膜类型：
聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐
醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水溶剂 尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于 强酸，不适用于二甲基甲酰胺。
泵头 进口单向阀
单向阀结构
注意： 请不要分解阀心A和阀心B
重新组装后性能不被保证，输液可能不稳定
当前第28页\共有30页\编于星期四\17点
线路过滤器
线路过滤器 压力传感器
故障：堵塞
现象：系统压力偏高
措施：异丙醇（或5％稀硝酸），
超声波清洗 判断依据：关闭排液阀，断开出口管路，设定流速
1mL/min，如压力>0.5MPa，则堵塞。
再生纤维素滤膜：同样适用于水溶性样品和有机溶剂
当前第11页\共有30页\编于星期四\17点
3.测定
色谱条件: 色谱柱:C18 ,4.6mm×150mm; 流动相: 甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液(5+95); 流速:1ml/min 检测波长:230nm
取样品处理液和标准系列溶液各10µl注入高效液 相色谱仪进行分离,以其标准溶液峰的保留时间为依 据进行定性。以标准溶液的浓度为横坐标, 相应的峰面积为纵坐标,分别绘制标准曲线(或计算回归 方程),从标准曲线上查出(或根据回归方程求出)样液中 被测物质的含量,按下式计算:
r
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1
线性范围(mg/mL)
0～0.2
生化实验讲义高效液相色谱技术(HPLC)word精品文档11页
7 高效液相色谱技术（HPLC）高效液相色谱（HPLC：High Performance Liquid Chromatography ）是化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可缺少的工具。
国际市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最大的份额，增长速度最快。
高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。
适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。
其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。
目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。
7.1 基本原理流动相固定相流动相A AB CB CBA固定相——柱内填料，流动相——洗脱剂。
HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。
通常，按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类：分配色谱：——分配系数亲和色谱：——亲和力吸附色谱：——吸附力离子交换色谱：——离子交换能力凝胶色谱（体积排阻色谱）：——分子大小而引起的体积排阻分配色谱又可分为：正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。
反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。
用的最多，约占60～70％。
固定相（柱填料）：固定相又分为两类，一类是使用最多的微粒硅胶，另一类是使用较少的高分子微球。
后者的优点是强度大、化学惰性，使用pH范围大，pH=1～14，缺点是柱效较小，常用于第 140 页离子交换色谱和凝胶色谱。
最常使用的全孔微粒硅胶（3～10μm）是化学键合相硅胶，这种固定相要占所有柱填料的80％。
它是通过化学反应把某种适当的化学官能团（例如各种有机硅烷），键合到硅胶表面上，取代了羟基（－OH）而成。
高效液相色谱分析(主要分离类型与原理)课件
高效液相色谱分析(主要 分离类型与原理)课件
• 高效液相色谱分析简介 • 高效液相色谱的主要分离类型 • 高效液相色谱的分离原理 • 高效液相色谱分析实验操作与注意事项 • 高效液相色谱分析的应用实例
目录
Part
01
高效液相色谱分析简介
高效液相色谱分析的定义
高效液相色谱分析（HPLC）是一种分离和检测复杂样品中各种组分的方法。它利用不同 物质在固定相和流动相之间的分配平衡来实现分离。
THANKS
感谢您的观看
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Part
03
高效液相色谱的分离原理
高效液相色谱的固定相与流动相
固定相
是色谱柱中的填充物，用于吸附 和固定样品中的组分。常见的固 定相包括硅胶、氧化铝、活性炭 等。
流动相
是携带样品通过色谱柱的液体或 气体，与固定相相互作用，使各 组分得以分离。
高效液相色谱的分离过程
样品在流动相中溶解并被 带入色谱柱。
实验操作前的准备
实验器材与试剂准备
确保所需的色谱柱、检测器、流动相 、样品等都已准备好，并确保试剂的 质量和纯度。
实验条件设定
仪器校准与维护
确保色谱仪器的准确性和稳定性，进 行必要的校准和日常维护。
根据实验需求，设定合适的流动相比 例、流速、检测波长等参数。
实验操作步骤与要点
样品处理
根据实验要求，对样品进 1
Part
02
高效液相色谱的主要分离类型
吸附色谱
STEP 01
原理
STEP 02
应用
利用固定相吸附剂对不同 组分的吸附能力差异实现 分离。
STEP 03
特点
固定相的吸附能力可以通 过改变流动相的组成进行 调节。
• 高效液相色谱分析简介 • 高效液相色谱的主要分离类型 • 高效液相色谱的分离原理 • 高效液相色谱分析实验操作与注意事项 • 高效液相色谱分析的应用实例
目录
Part
01
高效液相色谱分析简介
高效液相色谱分析的定义
高效液相色谱分析（HPLC）是一种分离和检测复杂样品中各种组分的方法。它利用不同 物质在固定相和流动相之间的分配平衡来实现分离。
THANKS
感谢您的观看
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Part
03
高效液相色谱的分离原理
高效液相色谱的固定相与流动相
固定相
是色谱柱中的填充物，用于吸附 和固定样品中的组分。常见的固 定相包括硅胶、氧化铝、活性炭 等。
流动相
是携带样品通过色谱柱的液体或 气体，与固定相相互作用，使各 组分得以分离。
高效液相色谱的分离过程
样品在流动相中溶解并被 带入色谱柱。
实验操作前的准备
实验器材与试剂准备
确保所需的色谱柱、检测器、流动相 、样品等都已准备好，并确保试剂的 质量和纯度。
实验条件设定
仪器校准与维护
确保色谱仪器的准确性和稳定性，进 行必要的校准和日常维护。
根据实验需求，设定合适的流动相比 例、流速、检测波长等参数。
实验操作步骤与要点
样品处理
根据实验要求，对样品进 1
Part
02
高效液相色谱的主要分离类型
吸附色谱
STEP 01
原理
STEP 02
应用
利用固定相吸附剂对不同 组分的吸附能力差异实现 分离。
STEP 03
特点
固定相的吸附能力可以通 过改变流动相的组成进行 调节。
《高效液相色谱分析》课件
器等。
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成
中国药典高效液相色谱详解演示文稿
14
当前14页，共24页，星期一。二、系统适用性试验色谱系统的适用性试验通包括 理论板数
分离度 重复性
拖尾因子 分离度和重复性是尤为重要。
15
当前15页，共24页，星期一。
色谱柱的理论板数(n)
用于评价色谱柱的分离效能。由于不同物质在同一色谱柱 上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量柱效能的指标 时，应指明测定物质，一般为待测组分或内标物质的理论 板数。
要时，应在各品种项下对拖尾因子作出规定。
20
当前20页，共24页，星期一。
测定法
(1)内标法 按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物
质，分别配成溶液，精密量取各适量，混合配成校正因子测定用的对 照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的 峰面积或峰高，按下式计算校正因子：
蒸发光散检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与供试品的质 量有关；
二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱，故可用于供试品的 光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。
7
当前7页，共24页，星期一。
检测器
紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与供试品溶液的 浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与供 试品溶液的浓度通常呈指数关系，故进行计算时，一般需经对数 转换。
正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等 。
离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱 系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体 的分离通常使用手性填充剂。
4
当前4页，共24页，星期一。
色谱柱
填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键 合基团的表面覆盖度、含炭量和键合类型等）以及色谱柱 的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。分析分 子量小于2000的化合物应选择孔径在15nm以下的填料，分 析分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填 料。
当前14页，共24页，星期一。二、系统适用性试验色谱系统的适用性试验通包括 理论板数
分离度 重复性
拖尾因子 分离度和重复性是尤为重要。
15
当前15页，共24页，星期一。
色谱柱的理论板数(n)
用于评价色谱柱的分离效能。由于不同物质在同一色谱柱 上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量柱效能的指标 时，应指明测定物质，一般为待测组分或内标物质的理论 板数。
要时，应在各品种项下对拖尾因子作出规定。
20
当前20页，共24页，星期一。
测定法
(1)内标法 按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物
质，分别配成溶液，精密量取各适量，混合配成校正因子测定用的对 照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的 峰面积或峰高，按下式计算校正因子：
蒸发光散检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与供试品的质 量有关；
二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱，故可用于供试品的 光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。
7
当前7页，共24页，星期一。
检测器
紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与供试品溶液的 浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与供 试品溶液的浓度通常呈指数关系，故进行计算时，一般需经对数 转换。
正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等 。
离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱 系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体 的分离通常使用手性填充剂。
4
当前4页，共24页，星期一。
色谱柱
填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键 合基团的表面覆盖度、含炭量和键合类型等）以及色谱柱 的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。分析分 子量小于2000的化合物应选择孔径在15nm以下的填料，分 析分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填 料。
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固定相：C18
时间，min
1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯
（3）流动相的表面张力
流动相的表面张力愈大，介电常数愈大，极性亦愈强； 溶质和烷基键合相的缔合作用愈强，流动相的洗脱强度弱， 导致溶质的保留值大。
（4）流动相的酸碱性和盐浓度
酸性抑制弱酸解离，增加保留时间；碱性抑制弱碱解离，增 加保留时间；盐浓度增加不利于离子化溶质保留。
生成离子对反应
A-(水 相 ） + B+(水 相 ）
A-B+(有 机 相 ）
被测离子
反离子
2．常用 离子对
试剂
阳离子
烷基磺酸或盐类 (十二烷基磺酸钠 ） 分析有机碱类和有机阳离子
季铵盐类 (四丁基季铵盐、十六烷基三甲基季铵盐 )
阴离子 分析有机酸和有机阴离子
3．固定相与流动相 (1）固定相 -----ODS等非极性固定相
（1）溶质分子中非极性部分的总表面积
溶质和固定相接触的总表面积愈大，保留值愈大，所以溶质的极性愈 弱，疏水性越强，保留值越大。
（2）键合相上的烷基总面积
烷基键合固定相的作用在于提供非极性的作用表面。随着碳链的加长， 烷基的疏水特性增强，溶质的保留值也随烷基碳链长度的增加而增大。
固定相：C1
固定相：C8
疏溶剂作用理论
利用非极性溶质分子或 溶质分子中非极性基团和极 性溶剂接触时产生排斥力， 而从溶剂中被“挤出”，即 产生疏溶剂作用，促使溶质 分子与键合相表面的非极性 的烷基发生疏水缔合，而使 溶质分子保留在固定相中 .
想一想 影响溶质保留（时间长短）的因素有哪些?
影响溶质保留（时间长短）的四大主要因素
（1）正相键合相色谱法
流动相-----有机溶剂 分离机制 ---类似液-液分配色谱的分离原理
应用范围---适于分离溶于有机溶剂的 极性至中等极性的分子型化合物(如脂
溶性维生素、脂、芳香醇、芳香胺等）
（2）反相键合相色谱法
特征----固定相极性＜流动相极性 流动相-----水+有机调节剂
分离机制 ---“疏溶剂作用”理论 应用范围-----适用于分离非极性至 中等极性的分子型 二 元 内 梯 度 洗 脱 装 置 示 意 图
内梯度----高压泵将溶剂按程序压入混合室， 混合后再注入色谱柱
外梯度---多元溶剂通过比例阀再由泵注入色谱柱
四元外梯度洗脱装置双泵(串联)工作原理示意图
载体-----硅胶 键合反应---硅烷化反应、硅酸酯化反应
1．键合相类型 类型
非极性固定相 (ODS）
R1 Si OH + Cl Si C18H37 -HCl
R1 Si O Si C18H37
R2
R2
极性键合相 （键合-NH2、-CN、醇基等极性基团）
离子型键合相 （键合可交换阴或阳离子基团 )
2．分离原理 特征----固定相极性＞流动相极性
离子交换剂 ----键合的离子交换基团
类型
符号
官能团
强阳离子交换剂 弱阳离子交换剂
SCX WCX
—SO3H —COOH
强阴离子交换剂 弱阴离子交换剂
SAX WAX
—N+R3 —NH2
（2）流动相----水缓冲溶液
选择规则 (1)增加流动相中盐的浓度，可以降低待测离子的竞争亲和力， 使其在固定相上的保留时间减少，先出色谱柱;反之，则保留 时间增大，后出色谱柱 .
二、离子色谱法
1.离子色谱法（IC） 离子交换色谱与电导检测器相结合分析各种离子的方法
2．分离原理[抑制型（双柱型)] 分离柱 交换反应：R+-OH- + NaX → R+-X-+ NaOH 洗脱反应：R+-X- + NaOH → R+-OH-+ NaX 抑制柱 与组分反应：R—H+ + NaX → R-Na+ + HX 与洗脱剂反应：R--H+ + NaOH → R-Na+ + H2O
(2）流动相 -----甲醇-水或乙腈-水体系中加入适量离子对试 剂，并用缓冲液调至合适的pH。分离有机碱的pH值一般为 3~3.5；分离有机酸的pH值一般在7.5左右。
第2节 高效液相色谱仪 高效液相色谱仪结构及流程
一、输液系统
恒压泵(淘汰)
1．高压输液泵 恒流泵
单柱塞往复泵 双柱塞往复泵(串或并联）
高效液相色谱分离检测技术详解演示文稿
优选高效液相色谱分离检测技术
1. 液-液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型担体
氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用 100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见。
现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料。
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，表面附着
一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。 表面积小，柱容量底。
4.4.1 液谱分离系统
液-固色谱法（LSC） 固定相状态分 液-液色谱法（LLC）
HPLC 分离机制分
吸附色谱法 分配色谱法 离子交换色谱法 分子排阻色谱法 化学键合相色谱法 亲合色谱法 离子色谱法
一、化学键合相色谱法
化学键合相（chemically bonded phase）将固定液（含不 同官能团的有机分子）利用化学反应键合到载体表面上，使 其形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相
在无抑制柱的离子交换色谱中，进入检测器的是高电导的洗脱剂 NaOH及被洗脱的组分NaX，后者所产生的电导的微小变化被洗脱剂的高 本底所淹没，难于检测。而加了抑制柱后，进入检测器的本底是电导率 很低的水，因此很容易检测出具有较大电导率的HX。
2．固定相与流动相
基质 ---合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶 （1）固定相
（2）pH增大，酸的离解度增大而值增大，保留时间增加，后 出柱；但有机碱的离解度降低而分配比减小，保留时间减小， 先出柱。
(3)缓冲溶液中缓冲剂浓度增大 ;保留时间会减小。
三、反相离子对色谱法
1．分离机制
在反相色谱法中，将一种或多种与被测离子电荷相反的离子（称为对离 子或反离子）加到极性流动相中，使其与被测离子结合，形成疏水性（中性 或弱极性）的离子对缔合物 ,而被非极性固定相（有机相）萃取，进入固定相 被保留 .因待测组分离子的性质不同、反离子形成离子对的能力不同和形成离 子对疏水性的不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间的不同，因而出色 谱柱先后不同，实现分离.