蛋白质工程的定点突变

20世纪80年代以来，基因克隆技术与DNA化学合成方法相结合，建立和发展了定点突变技术。可以按照预定设计，在已知的DNA序列中增删或转换核苷酸，精确地是靶基因在特定位点发生碱基序列的变化，进而使基因表达及调控，基因产物发生相应改变。这种快速精确的基因突变已经被广泛地应用与基因工程和蛋白质工程之中。定点突变有多种方法，有的改变特定核苷酸，有的则是对一段最可能影响蛋白质功能的基因序列进行随机突变，产生一系列突变蛋白质。

寡核苷酸诱导的定点突变基本上分两类：一类是用单链噬菌体M13作载体的寡核苷酸介导的单链模板定点突变；另一类用双链质粒作载体，双引物法定点突变。为了在体外导入特定的点突变，小的限制性片段可以切除，并被包含所需要突变的合成接头所替代（称为盒式诱变）。如果不行，插入片段可以克隆到产生单链DNA的噬菌粒载体中，由所设计的错配引物知道DNA复制，产生异源双链的复制型，并在下面的复制循环中产生野生型和突变的复制型。

(图）

单链噬菌体作载体的定点突变的基本原理是，用已知序列的环状DNA变性后为模板，人工合成一段引物，将所要设计的定点突变寡核苷酸置于引物中，也就是说人工所合成的引

物不是完全和模板互补，而是在某个位点有意识地让碱基突变，和模板上的碱基不能配对，由于其他的碱基是互补的，所以任然可以通过复性，使引物和模板特异性结合。在M13单链环状模板上杂交一段寡核苷酸引物，利用DNA聚合酶和连接酶的作用，从引物延伸合成链，得到一个闭合环状的异源双链分子。由于预先在寡核苷酸引物中人为地引入碱基的错配对，插入或缺失，然后在将杂合双环DNA转化到细菌中，因此异源双链DNA经转化和筛选就可以分离到带有相应突变的DNA克隆。由于复制是半保留复制，经克隆后将有一半的后代环状DNA产生了定点突变，另一半和正常的亲代链一样。

环状双链质粒DNA作为载体进行基因的改造有它的优点。待改造基因中如有两个适当的限制性内切酶切点，可以用人工合成双链DNA片段置换两切点之间原有序列，在人工合成的双链DNA片段中包含有突变的序列。但是这种置换方法收到限制酶酶切位点的限制。

1.用M13DNA进行的寡核苷酸引物介导的定点突变：寡核苷酸引物介导的定点突变的步骤是用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。主要过程是：（1）将待突变基因克隆到突变载体上；

2.制备含突变基因的M13DNA单链模板；

3.引物与模板与模

板退火，5/端磷酸化的突变寡核苷酸引物与待突变的寡核苷酸引物与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的DNA 4.合成突变链，在DNA聚合酶的催化下，引物以单链DNA为模板合成全长的互补连，而后由连接酶封闭缺口，产生闭环的异源双链的DNA分子； 5.转化和初步筛选异源双链DNA分子转化大肠杆菌后，产生野生型，突变型的同源双链DNA分子，可以用限制性酶切法，斑点杂交法和生物来初步筛选突变的基因； 6.对突变体基因进行序列分析。

改进型双引物诱变原理是将目的基因克隆到M13噬菌体载体中，提取M13单链DNA，作为PCR的模板；设计两个引物，这两个引物分别与M13同一条单链的不同DNA片段互补，其中一个引物（引物1）与目的基因的一部分互补，但是含有一个核苷酸的突变；另一个引物（引物2）中含有一个酶切位点，但该酶切位点的一个核苷酸被诱变。对引物1的5/端进行磷酸化，引物2的新生链的3/端与引物1的磷酸化后5/端相遇，两端DNA在T4DNA连接酶的作用下连接。这样引物1的磷酸二酯键起到封接作用，保护引物1不会被新生连所替换。用未被引物2诱变时的限制性内切酶位点所对应的限制性酶解PCR产物，然后用该酶解产物转化修复缺陷型大肠杆菌。由于不含有引物2诱变的DNA都被切割成线性，不能在大肠杆菌中稳定存在，所以得到的转化子

都是同时含有1.2两个突变位点的。通常引物2选择在抗性基因中，这样除用限制煤排除非突变体外，还可以抗性变化来进行进一步筛选。这种方法较为简便易行，且得到突变体的机会较高，因此是现在较常用的一种获得突变体的方法。

PCR介导的定点突变法

利用PCR技术进行定点突变，不仅可以使突变体大量扩增，还可以提高突变率。以PCR为介导的定点突变为基因修饰和改造提供了另一条途径，例如通过改变引物中某些碱基而改变基因序列，达到有目的的改造蛋白质结构，研究蛋白质的结构与功能之间的关系的目的。还可以在所设计的引物5/端加入合适的限制型内切酶酶位点，为PCR 扩增产物后续得分克隆提供方便。

寡核苷酸介导的PCR突变的一种常用方法是将目的基因克隆到质粒载体上，质粒分置于两管中，每管各加入两个特顶的PCR引物，一个引物与基因内部或其附近的一段序列完全互补，另一引物和另一段序列互补，但有一个核苷酸发生了突变；两管中不完全配对的引物与两条相反的链结合，两个突变引物是互补的。

由于两个反应中引物的位置不同，所以PCR扩增后，产物有不同的末端。将两管PCR产物混合，变性，复性，则每条链会与另一管中的互补退火，形成有两个切口的环状DNA

转入大肠杆菌后，这两个切口均可修复。若同一管中的两条DNA链结合，会形成线性DNA分子，它不能在大肠杆菌中稳定存在。只有环状DNA才能在大肠杆菌中稳定存在，而绝大多数的环状分子都含有突变基因。这种方法不用将基因克隆到M13载体上，也不用特殊的载体系统，而且不用将M13上的突变基因在亚克隆到表达载体上，方法简单实用。

PCR介导的定点突变法，需要4种扩增引物，进行3次PCR反应。前两次PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有碱基突变的内侧引物，扩增形成两条双链DNA 片段，其中一段可以彼此重叠，去除未反应的多余引物之后，这两条双链DNA片段经过变性和退火可以形成具有3/凹末端的异源双链分子，在TaqDNA聚合酶的作用下，产生含有重叠序列的双链DNA分子。这种DNA分子再用两个外侧寡核苷酸引物进行第三次PCR扩增，便产生突变体DNA.

3.盒式突变

盒式突变1985年Wells提出的一种基因修饰技术——盒式突变，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析。利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧造成两个原载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶消化基因，再用合成的发生不同变化的双链DNA片段替代被消化的部分。这