a第一节：细胞形态结构的观察方法(1)
细胞形态结构的观察与显微测量
实验一细胞形态结构的观察与显微测量一、实验目的：1．熟悉动物细胞、植物细胞的基本形态结构2．掌握临时装片的制作方法3．掌握显微测量的原理和方法4．掌握生物绘图的方法。
二、实验原理：细胞是生物体结构功能的基本单位，其形态与功能相适应。
不同类型的细胞具有不同的大小、形态和结构，以适应其功能。
通过制作临时装片，可以观察很多细胞的结构，并借助测微尺测量细胞直径，进而获得细胞的体积。
三、实验仪器、试剂及材料：仪器：光学显微镜（台/人），载玻片、盖玻片（4套/人）、测微尺剪刀（1把）、镊子（1把）、牙签（50根）、滴管（个/组）试剂：1%碘液、瑞特染液（如果观察血细胞，则需瑞特染液）材料：洋葱、红辣椒、紫色落葵（或紫罗兰）、血细胞悬液、口腔上皮细胞四、实验步骤：1．洋葱鳞茎表皮细胞的观察在载玻片中央滴一滴1%碘液用剪刀在洋葱鳞茎叶内表面画一个1mm2的方框用镊子撕下表皮在碘液中铺平盖上盖玻片用吸水纸吸去多余碘液（也可帮助排除气泡）显微镜下观察（同法制红辣椒表皮细胞装片）2．人口腔黏膜上皮细胞的观察在载玻片中央滴一滴1%碘液用牙签刮取上皮细胞在1%碘液中搅动分散细胞染色1分钟盖上盖玻片观察3．血细胞观察（见细胞生物学实验教程：第9页）在载玻片右端滴一滴血细胞稀释液用另一张载玻片以30~45度角（两玻片夹角）推移血液成均匀薄膜滴一滴瑞特染液染色3分钟自来水洗掉染液，晾干观察4．显微测量（1）原理：测微尺由目镜测微尺和镜台测微尺组成，目镜测微尺位于目镜内，为玻璃圆片，上有一条带刻度的直线，精确度较镜台测微尺的低；镜台测微尺是一块载玻片，中央圆形区域内有一带刻度的直线，精确度较目镜测微尺高。
（2）测量：A、将镜台测微尺放入载物台上，转动目镜，使二者平行。
选择一处让二者重合，然后向右侧寻找再次重合处，记下二者的数值，并按照目镜测微尺和镜台测微尺的精度关系换算目镜测微尺每小格实际代表的刻度值。
B、将镜台测微尺取下，换上洋葱表皮细胞、口腔黏膜上皮细胞、血细胞涂片，用目镜测微尺测量出其长度和宽度。
细胞生物学研究方法
2 暗视野显微镜 暗视野显微镜是因为视野内不能直接看到照 明光线 , 只能看到被检物体散射或衍射的光 线。故视野内呈黑暗状态。由于被检物体表 面散射的光亮 . 才使我们能够在黑暗的视野 中观察到被检物体的外形和运动。 普通显微镜的最高分辨力如上所述为 0.2微 米 , 而暗视显微镜虽然对被检物体的细微构 造分辨不清 , 但却可看到 0.004 微米以上的微 粒子的存在。这是普通光学显微镜所不具有 的特性。
6．扫描隧道显微镜(Scanning tunneling microscope, 简称 STM)。 人类永远不会停止对微观世界的探索，在电子显 微镜发明大约半个世纪后，1981年拜宁（Binning） 等又发明了扫描隧道显微镜它的成象原理完全不同 于光镜和电镜。。基于量子力学原理，研究者们发 展出了一系列高分辨显微镜。这些发明为人类打开 了通向微观世界的一扇又一扇大门，使人类真正进
那么电子束是怎么成象的呢?它和光学象的形成 有何不同？在光学显微镜中，成象的反差度,即 亮度差,是因被检物的不同结构吸收光线的强弱 程度不同造成的 。而电镜的成象原因是,入射电 子与物质原子碰撞后产生 散射,被检的不同部位 有不同的散射度,这样就形成了电子象的浓淡.电 子束的散射度是由物体的密度与厚之积,以及加 速电压的大小决定的。
第三章
细胞生物学研究方法
观察（原版P143）
自1680年荷兰学者列文虎克(Leeuven hoek)用 单显微镜(单透镜)第一次看到酵母活细胞以来, 人们一直在努力改革和发展观察手段，来研 究细胞较深层次的形态和结构。 今天人们已经有了具有原子尺度高分辨本领 的扫描隧道显微镜。 与此同时人们还创造了一系列对细胞组分和 细胞生理活动进行详尽分析的方法和手段,它 们揭示了各种细胞结构及生物大分子在细胞 内的功能和作用。
细胞生物学 第二章细胞生物学研究方法
§1 细胞形态结构的观察方法
三、扫描隧道显微镜 （Scanning tunneling microscope，STM）
• 于1981年发明，发明者获 1986年度诺贝尔物理学奖。
• 特点： ①具有原子尺度的高分辨力，
侧（横）分辨率为0.1-0.2nm， 纵分辨率0.001nm； ②除在真空外，还可在空气、 液体等条件下观察； ③非破坏性测量：不受电子 束的轰击、破坏。
• 因此，可用已知的抗体检测未知的抗原。
• 但多数抗原-抗体结合后不出现可见反应，即不能检测 到二者的这种特异性结合。如何检测抗原-抗体发生了 结合反应？
• 用一种可见的标记物标记抗体，通过检测标记物的存
在与否判断抗原-抗体是否发生了结合反应——免疫标
记技术。
抗原
标记物
抗体
二、特异蛋白抗原的定位与定性
s 将二次电子收集并经一系列 的处理在荧光屏上成像。
s 这样，可以得到样品表面的 立体图像。
二、电子显微镜
• 扫描电镜的样品制备：
s 取材； s 固定； s 脱水； s 临界点干燥； s 喷镀； s 电镜观察。
• 分辨本领：较低，一般 在3nm。
• 放大倍数：几万倍。
二、电子显微镜
• 特点：成像具有立体 感。
• 可见光的波长400700nm。
• 光学显微镜的最大分辨 率为0.2μm。
一、光学显微镜
• 光镜样品制备： 石蜡包埋切片， 苏木精-伊红染色。
一、光学显微镜
（二）相差显微镜和微分 干涉显微镜
• 原理：利用显微镜中的 特殊装置，使光线通过 样品时波长和振幅发生 变化，以增大样品明暗 的反差。
• 用途：这两种显微镜可 用于观察未染色的活细 胞的细胞结构及其动态 变化。
实验一细胞形态结构的观察和普通光学显微镜的使用
实验一细胞形态结构的观察和普通光学显微镜的使用引言：细胞是生命的基本单位，具有复杂的结构和功能。
观察细胞的形态结构对于深入了解生命的本质和进行生物学研究至关重要。
本实验的主要目的是通过使用普通光学显微镜观察和学习细胞形态结构的观察方法。
一、实验方法1.收集样本：从鲜植物叶片中切取小型组织样本，并将其放入显微片中。
2.准备显微片：在显微片上滴加一滴蒸馏水，然后放置样本在蒸馏水上。
3.制备盖片：将一个玻璃盖片轻轻放置在样本上方。
4.准备显微镜：打开普通光学显微镜，并将显微镜调整到最佳聚焦状态。
5.放置显微片：将显微片放入显微镜的样本托盘中，并将其轻轻固定。
6.观察样本：通过调节目镜的焦距和光源的亮度，观察样本并记录所见。
7.绘制图表：根据观察结果，绘制细胞形态结构图表。
二、实验结果1.观察细胞膜：通过放大镜镜头观察细胞膜，可以看到细胞膜呈现出一个薄膜状的结构。
细胞膜起着维持细胞形态和保护细胞内部结构的作用。
2.观察细胞核：通过调整镜头的焦距和光源的亮度，可以清晰地观察到细胞核在细胞质中的位置。
细胞核通常呈圆形或卵圆形，具有较深的染色质和一个明亮的核仁。
3.观察细胞质：细胞质是细胞核周围的液体，其中包含着细胞器如线粒体、内质网、高尔基体等。
通过调整显微镜的焦距和光源的亮度，可以清楚地看到这些细胞器。
4.观察细胞壁：在观察植物细胞时，可以通过增加显微镜的放大倍数来观察到细胞壁。
细胞壁是细胞外的一个多层结构，可以提供细胞的支持和保护。
三、实验讨论1.细胞形态结构的观察需要适当的样本处理：使用新鲜的样本可以提供更清晰的显微观察结果，因此，在进行实验前最好收集到新鲜的细胞样本。
2.调整显微镜的焦距和光源亮度是关键：观察细胞结构需要将显微镜调整到最佳的聚焦状态，并调节光源的亮度，以确保能够看到细胞结构的细节。
3.多个角度观察样本可以提供更全面的结果：在实验中，可以从不同的角度观察样本，以获得更全面的细胞形态结构信息。
全面完整细胞生物学第四版笔记
《细胞生物学》一、第一章绪论（一）细胞生物学研究的内容及现状——主要说明细胞生物学是研究和揭示细胞基本生命活动规律的科学。
因为细胞是生命体结构与功能的基本单位，一切疾病和发病机制也是以细胞病变为基础，所以细胞的研究即是生命科学的出发点，主要研究内容可归为①生物膜与细胞器（生物膜是细胞重要的结构基础，细胞器是认识细胞结构与功能的重要组成部分）✍细胞信号传递了解基本生命活动的分子机制和揭示生命的本质有重要的理论意义，转导基础为蛋白质与蛋白质之间的复杂的相互作用，是通过复杂的信号转导网络系统而实现的，呈现高度的非线性关系。
✍细胞骨架体系（包括细胞质骨架与核骨架），维持细胞形态，保持细胞内部结构。
④细胞核，染色体及基因表达——细胞核为遗传物质DNA储存和复制的场所和RNA转录与加工的场所；染色质为遗传物质的载体，核仁转录rRNA和组装核糖体亚单位。
核孔复合体为核质之间物质交换与信息交流的门控通路，DNA 结合蛋白可分为组蛋白和非组蛋白。
⑤细胞增殖及调控—是了解生物生长发育的基础，是研究癌变及逆转的重要途径。
⑥细胞分化及干细胞生物学—实质在于信号介导下由组合调控引发的组织特异性基因的表达。
⑦细胞死亡—为主动过程，主要有细胞凋亡，细胞坏死，自噬性细胞死亡三个方式，以维持生物体正常的生长发育，自稳态的维持，免疫耐受的形成及肿瘤监控等过程。
⑧细胞衰老--是研究人、动植物生命的基础⑨细胞工程—用人工方法使不同细胞基因或基因组重组形成杂交细胞或将基因或基因组由一种细胞转移至另一种细胞中，使之跨越种间障碍，产生新的遗传性状，如动物体细胞杂交实验和哺乳生物体的克隆⑩细胞的起源与进化。
（二）细胞学与细胞生物学发展简史—分为三个阶段（生物科学时期、实验生物学时期、现代生物学时期）⑴胡克.英国第一次描述了植物细胞的构造；列文虎克观察了许多动植物的活细胞与原动物，并描述了细胞核结构；与注意到了细胞壁与细胞质的区别；施旺和施莱登共同提出了细胞是一切动植物的基本单位—为着名的“细胞学说”，使生物学科有了重大的促进和知道作用；普金耶和莫尔首次提出原生质理论；Estrasburger在植物细胞中发现有丝分裂，并证实其实质为核内丝状物（染色体）的形成向两个子细胞的平均分配；细胞器的发现：van Beneden和发现中心体，Altmanna发现线粒体Golegi发现高尔基体。
第九章核糖体(ribosome)
3，电镜种类
扫描电子显微镜 透射电子显微镜 扫描隧道显微镜
透射电镜及其图像
扫描电镜及其图像
第二节 细胞组分的分析方法
一、高速、超速和梯度密度离心分离各种细胞器、生物 大分子及其复合物
差速离心
密度梯度离心
二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂类的显色
DNA：福尔根（Feulgen）反应－－紫红色 多糖类：PAS反应－－黄色
第三章
细胞生物学研究方法
第一节 细胞形态结构的观察方法
显微镜和显微镜的分辨能力
肉眼：0.2 mm; 光镜：0.2 um; 电镜：0.2 n λ
N . sin α / 2
λ: 光源波长; α: 物镜镜口角; N: 介质折射率
显微镜成像原理
普通复式光学显微镜
（light microscope）
脂肪：苏丹III－－红色
蛋白质：米伦（Millon）－－红色
三、特异抗体技术
免疫荧光 免疫电镜 免疫沉淀 Western blotting
四、特异核酸标记技术
In situ hybridization
Northern blot (RNA); Southern blot (DNA)
原位杂交技术
五、放射性标记技术
流式细胞术
第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
一、细胞培养
1，植物细胞 （原代细胞培养，永生细胞系）
2，动物细胞
（单倍体细胞培养，原生质体培养，体细胞培养） 3，非细胞体系
（DNA复制，RNA转录，蛋白质合成，高尔基体的膜泡 运输，细胞核装配等）
细胞提取物，细胞核提取物
动物细胞培养
细胞的克隆
植物组织培养
二、细胞工程
细胞生物学 国家精品课程 教案讲义
细胞生物学国家精品课程教案讲义第一章绪论教学目的：1.掌握本学科的研究对象及内容；2.了解本学科的来龙去脉（发展史及发展前景）；3.掌握与本学科有关的重大事件和名词。
教学重点：本学科的研究对象及内容。
教学方法：讲授法。
教学过程第一节细胞生物学研究内容与现状一、细胞生物学是现代生命科学的重要基础学科（一）细胞学（Cytology）：是研究细胞的结构、功能和生活史的科学。
（二）细胞生物学（Cell Biology）：运用近代物理学和化学的技术成就以及分子生物学的概念与方法，从显微水平、亚显微水平和分子水平三个层次上，研究细胞的结构、功能及各种生命活动规律。
二、细胞生物学的主要研究内容1．细胞核、染色体及基因表达基因表达与调控是目前细胞生物学、遗传学和发育生物学在细胞和分子水平相结合的最活跃领域。
2．生物膜与细胞器的研究膜及细胞器的结构与功能问题（“膜学”）。
3．细胞骨架体系的研究胞质骨架、核骨架的装配调节问题和对细胞行使多种功能的重要性。
4．细胞增殖及调控控制生物生长和发育的机理是研究癌变发生和逆转的重要途径（“再教育细胞”）。
5．细胞分化及调控一个受精卵如何发育为完整个体的问题。
（细胞全能性）。
6．细胞衰老、凋亡及寿命问题。
7．细胞的起源与进化。
8．细胞工程改造利用细胞的技术。
生物技术是信息社会的四大技术之一，而细胞工程又是生物技术的一大领域。
目前已利用该技术取得了重大成就（培育新品种，单克隆抗体等），所谓21世纪是生物学时代，将主要体现在细胞工程方面。
三、当前细胞生物学研究的总趋势与重点领域1．染色体DNA与蛋白质相互作用关系；2．细胞增殖、分化、凋亡的相互关系及其调控；3．细胞信号转导的研究；4．细胞结构体系的装配。
第二节细胞生物学发展简史1．细胞学创立时期 19世纪以及更前的时期（1665—1875），是以形态描述为主的生物科学时期；2．细胞学经典时期 20世纪前半世纪（1875—1900），主要是实验细胞学时期；3．实验细胞学时期（1900—1953）；4．分子细胞学时期（1953至今）。
翟中和细胞生物学笔记-全-(整理打印版)
第一章绪论生命体是多层次、非线性、多侧面的复杂结构体系，而细胞是生命体的结构与生命活动的基本单位，有了细胞才有完整的生命活动。
细胞生物学是研究细胞基本生命活动规律的科学，它是在不同层次（显微、亚显微与分子水平）上以研究细胞结构与功能、细胞增殖、分化、衰老与凋亡、细胞信号传递、真核细胞基因表达与调控、细胞起源与进化等为主要内容。
核心问题是将遗传与发育在细胞水平上结合起来。
细胞生物学与分子生物学(包括分子遗传学与生物化学)相互渗透与交融是总的发展趋势。
“细胞学说”的基本内容认为细胞是有机体，一切动植物都是由细胞发育而来,并由细胞和细胞产物所构成；每个细胞作为一个相对独立的单位，既有它“自己的”生命,又对与其它细胞共同组成的整体的生命有所助益；新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。
学习细胞生物学的注意点•抽象思维与动态观点•结构与功能统一的观点•同一性(unity)和多样性(diversity)的问题•细胞生物学的主要内容：基本概念与实验证据；细胞器的动态特征；化学能的产生与利用；细胞的活动及其调控等•实验科学与实验技术——细胞真知源于实验室——Whatweknow//Howweknow.细胞是生命活动的基本单位一切有机体都由细胞构成，细胞是构成有机体的基本单位细胞具有独立的、有序的自控代谢体系，细胞是代谢与功能的基本单位细胞是有机体生长与发育的基础细胞是遗传的基本单位，细胞具有遗传的全能性没有细胞就没有完整的生命细胞概念的一些新思考细胞是多层次非线性的复杂结构体系细胞具有高度复杂性和组织性细胞是物质（结构）、能量与信息过程精巧结合的综合体细胞完成各种化学反应；细胞需要和利用能量；细胞参与大量机械活动；细胞对刺激作出反应；细胞是高度有序的，具有自组装能力与自组织体系。
细胞能进行自我调控；繁殖和传留后代；细胞的基本共性所有的细胞表面均有由磷脂双分子层与镶嵌蛋白质构成的生物膜，即细胞膜。
所有的细胞都含有两种核酸：即DNA与RNA作为遗传信息复制与转录的载体。
细胞生物学第四版(1-7)PPT课件
2021
电子显微镜的基本结构（A）和成像原 理（B）（图3-10）
2021
电子显微镜与普通光学显微镜的基本区 别（表3-1）
2021
（二）、主要电镜制样技术
1. 超薄切片技术：切片厚度一般仅为40~50nm 2. 负染色技术：用重金属盐对电镜样品进行染色的技术，使
普通光学显微镜成像示意图（图3-2 ）
2021
决定光学显微镜的分辨率的要素（图3-3 ）
D ＝ 0.61 λ∕［N ·sin(α/2)］ • D: 分辨率 • λ：入射光的波长 • N：介质的折射率（1或1.5） • α：物镜的镜口角
2021
石蜡切片的制备程序（图3-4）
2021
（二）、相差显微镜和微分干涉显微镜
2021
第二节 细胞学与细胞生物学发展简史
一、细胞的发现 二、细胞学的建立及其意义 三、细胞学的经典时期 四、实验细胞学与细胞学的分支及其发展 五、细胞生物学学科的形成与发展
2021
重要概念与学说
• 原生质体 （protoplast ）：去掉细胞壁的植物细胞或其他 去壁细胞。
• 细胞学说（cell theory ）：生物科学的重要学说之一，包 括三个基本内容：所有生命体均由单个或多个细胞组成； 细胞是生命的结构基础和功能单位；细胞只能由原有细胞 分裂产生。
2021
病毒的基本类型（图2-14）
2021
病毒结构的示意图（图2-15）
2021
戊型肝炎病毒的冷冻电镜图片（图216）
2021
在细胞核内增殖的腺病毒（图2-17）
2021
细胞形态结构的观察方法
细胞形态结构的观察方法一、光学显微技术(P49)1、普通复式光学显微镜技术①组成：光学放大系统、照明系统、机械系统；②性能参数：放大倍数、分辨力、清晰度、焦点深度、镜像亮度等，其中最重要的是分辨力。
分辨力（分辨率、分辨本领）：能分辨两个物点之间最短距离的能力。
该距离越小，则分辨力越高。
显微镜的分辨力计算公式：③普通光镜分辨极限α最大值140°；λ最小波长450nm；N最大值1.5；因此普通光镜的分辨力极限为0.2微米，此数值亦为显微水平和亚微水平的分界点。
（称为瑞利极限，Rayleigh limit）普通光镜有效放大倍数（经验值）＝物镜最大镜口率×1000④提高光学显微镜分辨力的手段a、缩短照明光线波长；b、应用特殊光学效应，增强反差。
光学显微镜样品制备固定（fixation）：使用固定剂（fixative）杀死细胞，并使细胞结构尽可能接近活细胞；脱水：乙醇包埋：石蜡切片：切片机脱蜡、染色：多种染料封片：长期保存显微镜技术和计算机技术结合倒置显微镜2、相差和微分干涉显微镜技术(P51)①相差显微镜：（phase contrast microscope, Ph ）1935年荷兰物理学家Frits Zernicke发明；它利用光的衍射和干涉原理，将光的相位差（人眼无法感受）→振幅差（人眼可以感受）；无色透明物体中的细节表现为明与暗的对比；适合观察活细胞和未染色的样品。
两束光波之间的相互干涉普通光学显微镜相差显微镜②微分干涉显微镜(P51)（differential－interference microscope ，DIM）DIM获得的反差取决于光线穿过样品折射率变化的速率。
样品边缘结构反差增大（相对小的距离内折射率发生明显变化）。
Nomarski microscope 荐阅读《细胞实验指南》下册，科学出版社，P8963、荧光显微镜技术（fluorescence microscopy）①原理：以紫外光为光源，激发标本中的荧光物质产生荧光，从而对某些物质进行定性和定位分析。
西北师范大学019生命科学学院2020年硕士研究生招生专业科目考试大纲
西北师范大学生命科学学院2020年硕士研究生招生考试专业科目参考书目及考试大纲生命科学学院硕士研究生初试、复试专业科目参考书《分子生物学623》考试大纲（生物学专业初试科目）一、参考书目《现代分子生物学》，朱玉贤主编，高等教育出版社，第四版，2013年。
二、主要涉及题型及分值（一）可能题型：名词解释、选择题、判断题、填空题、问答题、论述题。
（二）分值：满分150分。
三、考试大纲第1章绪论考核要点：分子生物学简史及分子生物学的研究内容考核内容：一、引言二、分子生物学简史三、分子生物学的研究内容四、分子生物学展望第2章染色体与DNA考核要点：染色体组成、DNA结构与复制考核内容：第一节染色体一、染色体概述二、真核生物染色体三、原核生物染色体四、原核生物和真核生物基因组的特点及比较第二节DNA的结构一、DNA的一级结构二、DNA的二级结构三、染色体的形成过程第三节DNA的复制本章重点：掌握原核生物和真核生物的染色体构成特点；DNA一级结构和二级结构；DNA复制的基本概念和半保留复制的机制；原核生物真核生物DNA复制的比较。
第3章转录考核要点：转录的基本过程、转录机器的主要成分、RNA加工的方式考核内容：第一节RNA的转录一、转录的基本过程二、转录机器的主要成分第二节启动子与转录起始一、启动子的基本结构二、启动子的区的识别三、酶与启动子区的结合四、增强子及其功能五、真核与原核启动子对转录的影响第三节原核生物和真核生物mRNA的特征比较一、原核生物mRNA的特征二、真核生物mRNA的特征第四节终止和抗终止一、不依赖于ρ因子的终止二、依赖于ρ因子的终止三、抗终止第五节RNA拼接一、RNA中的内含子二、RNA的剪接本章重点：掌握转录与复制的区别，转录的不对称性，原核生物的RNA聚合酶的组成及各亚基的功能，真核生物RNA聚合酶的分类、性质及功能，原核生物与真核生物启动子的结构特点，了解真核生物RNA聚合酶的组成，研究转录起始区的方法。
细胞生物学研究方法的不同类型
光学显微镜小结
普通光学显微镜：0.2um 紫外线显微镜： 0.1um 荧光显微镜 暗视野显微镜 相差显微镜 微分干涉差显微镜 激光共聚焦扫描显微镜
构造：
聚光器或光源上安装 环 状 光 阑 （ annular diaphragm)；
在物镜中加了环形相 板(annular phase plate)。
光阑的作用：使透过聚光器的光线形成空心光锥， 聚焦到标本上。 光线透过标本发生衍射，偏离 了未透过标本的光线线路，波长延迟1/4 。
（ 二 ） 紫 外 线 显 微 镜 （ ultraviolet microscope）
根据光学原理，光源光波越短，显微镜的分 辨本领越大。紫外线显微镜以紫外线为光源， 分辨率可提高一倍。
可看到在普通光学显微镜下看不到的胶体颗 粒。
可用来测定细胞中的核酸含量。
透镜：石英、萤石（CaF2)、碳酸锂等制作。
分辨率（resolution）：能将物体相近两点分辨清楚的距离极限
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
D代表分辨力：D= 0.61 / N.A.
代表光波波长；N. A. 为镜口率，也称数值孔径（Numerical aperture)。
N. A. =n Sin /2 n：物镜与标本间介质的折射率；（1或1.515）
：镜口角（聚光焦点对物镜镜 口的张角，<180º）
特殊装置：在聚光器中加装中央遮光板 或者使用暗视野光阑
暗视野照明方式
能见到小至5nm的质点，分辨率比普通显微 镜高40倍。有些细胞器如核、线粒体亦可见。
能够看到正在运动的微小物体（如精子）， 也能看到不运动的及某些不能被染色的脂粒， 因而常用于微生物与胶体化学研究。
细胞融合
第三章细胞生物学研究方法第一节细胞形态结构的观察方法第二节细胞组分的分析方法第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术教学要求：了解和掌握细胞生物学研究领域所使用的实验技术的基本原理和应用。
1．显微镜技术（1）光学显微镜技术：普通复式显微镜技术，荧光显微镜技术与现代图像处理技术，激光共焦点扫描显微镜技术，相差和微分干涉显微镜技术，录像增差显微镜技术。
（2）电子显微镜技术：原理与基本知识，样品制备技术，扫描电镜技术，冷冻蚀刻技术。
（3）扫描隧道显微镜技术：特点与优越性。
2．细胞组分的分析方法。
（1）超速离心技术。
（2）细胞内大分子的显示方法。
（3）细胞内特异蛋白抗原和核酸序列的定位与定性：免疫荧光技术，免疫电镜技术和原位杂交技术。
（4）细胞内生物大分子的合成动态：同位素标记技术结合放射自显影。
（5）定量细胞化学分析技术：显微分光光度测定技术，流式细胞仪技术。
3．细胞工程：动物细胞培养、细胞融合（细胞杂交技术）、单克隆抗体技术、细胞拆合与显微操作技术。
4．分子生物学技术。
一、细胞培养技术1．细胞培养（cell culture）：是指从活体中取出小块组织分离出细胞，在一定条件下进行培养，使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。
IN VITRO:（离体的，即在玻璃容器中）用培养细胞进行的实验IN VIVO:（在体内的）完整机体内进行的实验原代培养(primary culture):直接从生物体获取细胞进行培养。
传代培养(secondary culture)：将原代培养的细胞连续以一定比例扩大培养。
2．细胞株（cell strain）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。
3．细胞系（cell line）：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖。
4．克隆（clone）：亦称无性繁殖系或简称无性系。
对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。
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第一节：细胞形态结构的观察法
一、光学显微镜技术
①光学显微镜种类：普通光学显微镜技术、相差和微分干涉显微镜技术、荧光显微镜技术、激光扫描共焦显微镜技术、荧光共振能量转移技术、荧光漂白恢复技术；
二、电子显微镜技术
（1）电子显微镜的基本知识：
①电子显微镜分辨率高的原因：使用了波长比可见光短得多的光源；
②电子显微镜与光学显微镜的区别：
光源分辨率透镜真空成像原理
光学显微镜可见光200nm 玻璃透镜不要求真空样品对光的
吸收
电子显微镜电子束0.2nm 电磁透镜高真空样品对电子
的散射和透
射
③电子显微镜样品处理：
第一种常规流程：固定→包埋→超薄切片→染色
染色：某些精细结构可采用复染色技术。
（重金属盐染色）
第二种流程（冷冻蚀刻电镜技术）：快速低温处理→样品低温断裂→喷镀铂\金+碳(形成碳膜)→消化液消化样品→电镜观察碳膜上留下的痕迹及细胞断裂面结构
此方法适用于观察胞质中细胞骨架纤维及其结合蛋白。
（2）扫描电镜技术
扫描电镜与普通电子显微镜的明显区别：立体感更强
二者区别：
①成像原理：扫描电镜利用的是样品激发的二次电子，而不是直接散射光源
②样品处理：扫描电镜为了使样品有良好的导电性，需要观察前喷镀一层金膜，
而且为了降低在样品干燥时水的表面张力对样品表面结构的影响，
需要用液态CO2进行处理再干燥。
（原理p63）。