蛋白质之间的相互作用ppt课件
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局限性
1.双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内， 而许多蛋白间的相互作 用依赖于翻译后加工， 而这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠 和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助， 这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体 蛋白等的研究。 2.酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。由于某些蛋白本身具有激活 转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用， 使DNA结合结构域杂交蛋白在 无特异激活结构域的情况下可激活转录，即自激活。 3.另外，某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成 稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生"假阳性"结果。 4.外源蛋白对酵母菌的毒性作用
单独的DNA结合域或转录激活域不能激活下游基因的转录，它们之间只有 通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能
它的基本原理是转录因子通过结合上游激活序列（UAS）启动下 游报告基因的转录
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通过因工程的方法，构建BD-X、AD-Y载体（X一般是已知的诱饵蛋白, Y可以是单 一已知蛋白或者文库蛋白或者未知蛋白），在GAL4 UAS和启动子的下游构建了3 个报道基因——Ade，His，LacZ），可以通过营养缺陷筛选、X-α-gal显色和酵母 表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用
其原理是： 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质之间的相 互作用被保留了下来。如果用一种蛋白质的抗体免疫沉淀该蛋白，那么与 该蛋白在体内结合的另一种蛋白也能沉淀下来。
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优点为： （1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态； （2）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
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可替代方法： 免疫共沉淀 噬菌体表面展示 GST pull-down assay 蛋白质芯片
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免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）
是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的，用于研究蛋白质之间的相互 作用，这种方法也常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于 确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
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蛋白质芯片
原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定 其上，根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白经 洗涤、纯化，再进行确认和生化分析
它具有以下优点： 1. 直接用粗生物样品（血清、尿、体液）进行分析 2. 同时快速发现多个生物标记物 3. 具有高通量的验证能力 4.可以发现低丰度蛋白质 5. 在同一系统中集发现和检测为一体 特异性高 利用单克隆抗体芯片，可鉴 定未知蛋白质，以减少测定蛋白质序列的工作量。
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局限性
（1）在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还 要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。 （2）不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，蛋白质功能的实现是 一个复杂的过程，部分未折叠的蛋白在细菌中很容易被降解，因此，必须小 心控制条件，以保证在噬菌体表面展示的文库没有降解。 （3）噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限 制了文库中分子遗传的多样性。 （4）由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒 性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。
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若X、Y相互作用，BD、AD间接连 接，AD靠近转录起始位点激活下 游报告基因的转录； 反之X、Y之间没有相互作用，报 告基因不表达
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优点
1. 双杂交技术不需尖端设备，几乎在任何实验室都可以实现 2.作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 3.检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。 4. 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于蛋白质之 间的微弱的或暂时的相互作用。
缺点为： （1）可能检测不到低亲和力的蛋白质－蛋白质相互作用； （2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有其它蛋白在中间起桥 梁作用；
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噬菌体表面展示(phage display technology)
将外源蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白表达在病毒颗粒的 表面，而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内，使大量多肽与其DNA 编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子的多肽配体通过淘选得以 快速鉴定。
2.易于纯化
重组噬菌体的纯化步骤简单、不要求昂贵的试剂与设
备。用于鉴定表位和受体所用的噬菌体载体为M13噬菌体。由于M13噬
菌体是温和型噬菌体，不裂解宿主菌，成熟的噬菌体可分泌到培养基中，
通过离心收集培养上清，再向其中加入沉淀剂即可将上清中大量噬菌体
粒子沉淀下来，从而富集得到含外源基因产物的重组噬菌体。
Hale Waihona Puke Baidu
噬菌体肽库与靶分子的相互作用
洗涤去未结合的或非特异性
结合的噬菌体
将特异性结合的噬菌体洗脱下来
三轮淘
选后，克隆测序
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优点
1.高通量的淘选 将靶标分子（抗体）固定在固相载体上，加入噬 菌体展示肽库，利用抗原-抗体的特异性亲和力将与抗体结合的噬菌体 吸附在固相载体上，不能结合的噬菌体仍在溶液中，可以通过洗涤去 除，再将特异结合的噬菌体洗脱下来，如此反复数轮扩增、淘选，即 可将有用的基因从多达百万以上的噬菌体克隆中分离出来
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GST pull-down assay
其基本原理是将靶蛋白-GST（GST是谷胱甘肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在 谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的 蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物 后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋 白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以 及体外转录翻译系统等方法获得。
蛋白质相互作用
20160222
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酵母双杂交用于检测两种蛋白质之间的相互作用
酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始的认识，真核生物完 整的转录因子是由：DNA结合结构域（DNA-Binding domain，BD）和转录激 活结构域（transcription-activating domain，AD）构成的，它们是结构上可以 分开的、功能上相互独立的结构域，BD识别DNA上的特异序列，并使AD定位 于基因的上游，从而激活转录
局限性
1.双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内， 而许多蛋白间的相互作 用依赖于翻译后加工， 而这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠 和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助， 这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体 蛋白等的研究。 2.酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。由于某些蛋白本身具有激活 转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用， 使DNA结合结构域杂交蛋白在 无特异激活结构域的情况下可激活转录，即自激活。 3.另外，某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成 稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生"假阳性"结果。 4.外源蛋白对酵母菌的毒性作用
单独的DNA结合域或转录激活域不能激活下游基因的转录，它们之间只有 通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能
它的基本原理是转录因子通过结合上游激活序列（UAS）启动下 游报告基因的转录
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通过因工程的方法，构建BD-X、AD-Y载体（X一般是已知的诱饵蛋白, Y可以是单 一已知蛋白或者文库蛋白或者未知蛋白），在GAL4 UAS和启动子的下游构建了3 个报道基因——Ade，His，LacZ），可以通过营养缺陷筛选、X-α-gal显色和酵母 表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用
其原理是： 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质之间的相 互作用被保留了下来。如果用一种蛋白质的抗体免疫沉淀该蛋白，那么与 该蛋白在体内结合的另一种蛋白也能沉淀下来。
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优点为： （1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态； （2）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
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可替代方法： 免疫共沉淀 噬菌体表面展示 GST pull-down assay 蛋白质芯片
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免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）
是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的，用于研究蛋白质之间的相互 作用，这种方法也常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于 确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
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蛋白质芯片
原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定 其上，根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白经 洗涤、纯化，再进行确认和生化分析
它具有以下优点： 1. 直接用粗生物样品（血清、尿、体液）进行分析 2. 同时快速发现多个生物标记物 3. 具有高通量的验证能力 4.可以发现低丰度蛋白质 5. 在同一系统中集发现和检测为一体 特异性高 利用单克隆抗体芯片，可鉴 定未知蛋白质，以减少测定蛋白质序列的工作量。
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局限性
（1）在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还 要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。 （2）不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，蛋白质功能的实现是 一个复杂的过程，部分未折叠的蛋白在细菌中很容易被降解，因此，必须小 心控制条件，以保证在噬菌体表面展示的文库没有降解。 （3）噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限 制了文库中分子遗传的多样性。 （4）由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒 性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。
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若X、Y相互作用，BD、AD间接连 接，AD靠近转录起始位点激活下 游报告基因的转录； 反之X、Y之间没有相互作用，报 告基因不表达
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优点
1. 双杂交技术不需尖端设备，几乎在任何实验室都可以实现 2.作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 3.检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。 4. 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于蛋白质之 间的微弱的或暂时的相互作用。
缺点为： （1）可能检测不到低亲和力的蛋白质－蛋白质相互作用； （2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有其它蛋白在中间起桥 梁作用；
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噬菌体表面展示(phage display technology)
将外源蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白表达在病毒颗粒的 表面，而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内，使大量多肽与其DNA 编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子的多肽配体通过淘选得以 快速鉴定。
2.易于纯化
重组噬菌体的纯化步骤简单、不要求昂贵的试剂与设
备。用于鉴定表位和受体所用的噬菌体载体为M13噬菌体。由于M13噬
菌体是温和型噬菌体，不裂解宿主菌，成熟的噬菌体可分泌到培养基中，
通过离心收集培养上清，再向其中加入沉淀剂即可将上清中大量噬菌体
粒子沉淀下来，从而富集得到含外源基因产物的重组噬菌体。
Hale Waihona Puke Baidu
噬菌体肽库与靶分子的相互作用
洗涤去未结合的或非特异性
结合的噬菌体
将特异性结合的噬菌体洗脱下来
三轮淘
选后，克隆测序
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优点
1.高通量的淘选 将靶标分子（抗体）固定在固相载体上，加入噬 菌体展示肽库，利用抗原-抗体的特异性亲和力将与抗体结合的噬菌体 吸附在固相载体上，不能结合的噬菌体仍在溶液中，可以通过洗涤去 除，再将特异结合的噬菌体洗脱下来，如此反复数轮扩增、淘选，即 可将有用的基因从多达百万以上的噬菌体克隆中分离出来
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GST pull-down assay
其基本原理是将靶蛋白-GST（GST是谷胱甘肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在 谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的 蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物 后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋 白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以 及体外转录翻译系统等方法获得。
蛋白质相互作用
20160222
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酵母双杂交用于检测两种蛋白质之间的相互作用
酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始的认识，真核生物完 整的转录因子是由：DNA结合结构域（DNA-Binding domain，BD）和转录激 活结构域（transcription-activating domain，AD）构成的，它们是结构上可以 分开的、功能上相互独立的结构域，BD识别DNA上的特异序列，并使AD定位 于基因的上游，从而激活转录