分子荧光光度法
分子荧光光度法测定荧光素
分子荧光光度法测定荧光素分子荧光光度法测定荧光素，听起来就像是个神秘的科学实验，其实呢，它其实没那么复杂，反而充满了趣味。
想象一下，在实验室里，灯光微微暗下来，空气中弥漫着一股神秘的气息，心里暗自期待着将要发生的事情。
你手里握着的不是一把利器，而是一台看似普通的仪器，但它却能把荧光素的秘密一一揭开。
这种荧光素，它可不是个平凡的家伙，想当年可是在实验室里风光无限。
它的光芒就像是夜空中的星星，闪烁着耀眼的光辉，吸引着每一个好奇的目光。
嘿，别以为这只是个简单的过程哦。
要搞清楚荧光素是什么。
它是某些生物体内的产物，比如小青蛙的皮肤，或者某些海洋生物的体内，想想就觉得有点神奇。
我们用分子荧光光度法，简单来说，就是通过一种仪器，看看荧光素在光照下的表现。
那种色彩斑斓的光芒，简直是让人目不暇接，仿佛置身于一个色彩缤纷的梦境。
你可以想象，它在光照下跳动的样子，就像小孩在草地上追逐蝴蝶，活泼又可爱。
在这过程中，首先要准备好荧光素的样品，可能是提取自生物体的，也可能是实验室合成的，反正你得确保它的纯度。
要是杂质多，那可就麻烦了，可能会影响测量的结果。
就像做菜一样，食材的新鲜度很重要嘛，调味料也要放对了。
我们需要选择合适的波长，调好仪器。
这时候，你就像是一个调酒师，认真调整每一个细节，确保最终的“饮品”味道独特。
波长选择得当，荧光素的光芒就会如期而至，照亮整个实验室。
荧光光度法的关键在于灵敏度。
就像是你去酒吧喝酒，调酒师的手艺越好，喝到的酒就越美味。
荧光素在合适的光照下，表现得淋漓尽致，发出的光越亮，代表浓度越高。
想想看，那一瞬间，仿佛时间都静止了，你心里感到一阵小小的自豪。
看到数据一目了然，结果清晰可见，简直就像发现了新大陆，内心的小宇宙瞬间爆发。
但注意啦，处理数据也不能马虎。
这就像是填报高考志愿一样，得认真对待，不能掉以轻心。
根据测得的荧光强度，计算出浓度，公式在手，心里有谱。
将实验结果与标准曲线对比，这一步可别大意，做错了可就前功尽弃，像是拼图时缺了几块，怎么也拼不完整。
2016-2017年分子荧光法测定奎宁的含量-学生实验记录（总结）
实验十一分子荧光法测定奎宁的含量一、实验目的1. 了解荧光分光光度计的性能与结构，掌握仪器的基本操作；2．学会绘制荧光激发光谱和发射光谱图(即确定最大的λex和λem)；3．定量测定奎宁的含量（标准曲线法）二、实验原理奎宁在稀酸溶液中是强荧光物质，它有两个激发波长250nm和350nm，荧光发射峰在450nm。
在低浓度时，荧光强度与荧光物质量浓度呈正比：I f = k c，通过标准曲线法可以测定未知样品中的奎宁含量。
三、仪器与试剂1．仪器：岛津RF-5301型荧光分光光度计2．试剂：10.0 μg·mL-1奎宁储备液；0.05 mol·L-1 H2SO4溶液四、实验步骤1．系列标准溶液的配制取6支25mL的容量瓶，分别加入0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 的10.0 μg·mL-1奎宁标准溶液，用0.05 mol·L-1 H2SO4溶液稀释至刻度，摇匀。
2. 绘制荧光发射光谱和激发光谱(以1.2μg·mL-1的标准溶液找最大λem和λex)将λex固定在250 nm, 选择合适的实验条件, 在350～600 nm范围内扫描即得荧光发射光谱，从谱图中找出最大λem值；将λem固定在450 nm, 选择合适的实验条件，在220～400 nm范围内扫描即得荧光激发光谱，从谱图中找出最大λex 值。
3．绘制标准曲线将激发波长λex固定在250 nm处，荧光发射波长λem固定在450 nm左右处，在选定条件下，测量系列标准溶液的荧光强度，以荧光强度为纵坐标，标准溶液的浓度为横坐标作图，得到标准溶液的荧光强度标准曲线。
4．未知样品的测定取约4 mL待测样品，按照标准溶液相同的测定条件测定其荧光强度，扫描三次，从标准曲线上计算出对应的浓度。
五、实验结果1．发射光谱和激发光谱的绘制以1.2μg·mL-1的标准溶液测定奎宁的发射光谱，固定激发波长为250nm，激发和发射狭缝分别设定为nm和nm，激发光谱扫描范围为350 ~ 600nm，得到奎宁的发射光谱，从图中可知其最大发射波长在nm左右。
分子荧光法测定维生素B12含量实验报告
分子荧光法测定维生素B12含量实验报告【实验项目】分子荧光法定量测定维生素B2的含量【实验目的】1.掌握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理。
2.了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，掌握其基本操作。
【实验原理】荧光是光致发光。
任何荧光物质都具有激发光谱和发射光谱，发射波长总是大于激发波长。
荧光激发光谱是通过测定荧光体的发光通量随波长变化而获得的光谱，反映不同波长激发光引起荧光的相对效率。
荧光发射光谱是当荧光物质在固定的激发光源照射后所产生的分子荧光，是荧光强度对发射波长的关系曲线，表示在所发射的荧光中各种波长相对强度。
由于各种不同的荧光物质有它们各自特定的荧光发射波长，可用它来鉴定荧光物质。
有些发荧光的物质其荧光强度与物质的浓度成正比，故可用荧光分光光度法测定其含量。
维生素B2溶液在430~440nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535nm 附近。
维生素B2在pH=6~7的溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素B2溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测维生素B2的含量。
维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质一光黄素，光黄素也是一个能发荧光的物质，其荧光比维生素B2的荧光强得多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。
在稀溶液中，荧光强度F与物质的浓度C有以下关系：F=2.303ΦT0Ebc当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系：F=Kc【仪器与试剂】1.仪器：荧光分光光度计（型号：F2500HITA[H));1cm石英比色皿l:50mL容量瓶2.试剂：维生素B2标准溶液(10.0μg/mL)(已加乙酸)》【实验内容与步骤】1.系列标准溶液和待测溶液的配制取维生素B2(10.0μg/mL)标准溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL 分别置于50mL的容量瓶中，标定，摇匀。
取2.00mL待测溶液于50mL的容量瓶中，标定，摇匀。
荧光光度分析法
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浓度测定 1、如何进行校准和浓度测定 如何进行校准和浓度测定 按以下步骤，调整仪器，以便获取数据 第1步： 点击视图中的开始 开始(Stare)按扭，指向程序 开始 程序 (Program)→Cary Eclipse ， 然后选择扫描 扫描(Scan)即显示扫描功能框。 扫描 第2步： 点击设置 设置(Set up)，进入设置 设置(Set up)对话框， 设置 设置 指定检测方法的参数
荧光光度分析法
1
一、基本原理
1.荧光的定义 1.荧光的定义 在紫外光或波长较短的可见光照射 后，一些物质会发射出比入射光波长更 --------荧光 荧光。 长的光 --------荧光。以测量荧光的强度 和波长为基础的分析方法叫做荧光光度 和波长为基础的分析方法叫做荧光光度 分析法。 分析法。
2
4
分子内的光物理过程
VR 2 1 v=0 S2 2 1 v=0 S1 ic VR isc
A1、A2. 吸收 、 F. 荧光 P. 磷光 ic. 内转化 isc. 体系间窜跃 VR. 振动松弛 VR 2 1 v=0 T1
ic A2 A1 F P
isc
3 2 1 v=0 S0
5
6
3. 荧光强度与浓度的关系
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二、Varian Cary Eclipse 荧光 分光光度计的特点
1. 硬件及硬件的主要特点 ⑴ 高能闪烁光源-----氙灯 高能闪烁光源-----氙灯 由于荧光物质的荧光强度与 激发光源的强度成正比，Eclipse采用了无须预 激发光源的强度成正比，Eclipse采用了无须预 耗能12 但脉冲输出能量却高达75 热、耗能12 W 但脉冲输出能量却高达75 KW 的闪烁氙 Xe） 并利用电子技术控制, 的闪烁氙（Xe）灯，并利用电子技术控制,使其 仅在发出测量指令后才闪烁。 仅在发出测量指令后才闪烁。这一设计给荧光 分析者带来极大的方便. 分析者带来极大的方便.
紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较
紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较
紫外可见分光光度法和分子荧光光度法，是两种现代分析化学中常用的光度测定技术，它们之间有许多不同之处。
首先，紫外可见分光光度法可以用来测量悬浮液和溶液中某种物质含量，通过检测它
们吸收波长不同的光，并使用紫外可见分光仪可以很好地用来定量分析一种物质的含量，
主要原因是它可以采用强度谱的方式测定光谱分析，这是数据量最大的分光光度法。
而分子荧光光度法则与紫外可见分光光度法存在很大的不同。
分子荧光光度法是一种
用于测定物质的定量分析的光度测量技术，其原理是通过激发某种物质的激发状态，并采
用光谱分析的方式测定淬发状态下某种物质吸收的光谱，采用发射率谱测量它发射出来的
光谱，这种方法有利于识别样品中含量很小的物质。
此外，两种光度测量技术在检测样品中的某种物质的含量时也有很大的差异。
紫外-
可见分光光度法通常可以测到复杂样品中有结构特性的物质，因此适用于分析各种复杂混
合样品，分子荧光光度法则是通过向某种物质添加少量共振激发剂来标记样品中某种物质，然后进行定量分析，它可以清楚地测量某种独特结构物质，因此被广泛应用于纯化和同位
素比值等细胞研究中，并可以更明确地测量和筛选出某种物质。
综上所述，紫外可见分光光度法和分子荧光光度法是两种现代分析化学中常用的光度
测定技术，它们在原理，应用，检测样品中含量的某种物质等方面都存在差异，根据实际
情况和需要，可以依据自身需要选择不同的光度测量技术，以获得更准确的定量分析结果。
分子荧光光度法基本原理
400
450
500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
三、物质分子结构与荧光的关系
（一）荧光效率（φf） 激发态分子中以发射荧光的光量子数目和 分子吸收激发光的光量子总数之比：
φf =
发射荧光的光量子数目 吸收激发光的光量子总数
[ φf∈（0，1）]
激发态的分子有几种途径可以回到基态, 荧光去 激发比其它去激发快 ,才可以观 察到荧光发射。
（二） 荧光和磷光的产生 激发态分子在极短的时间内回到 去活化过程： 基态的过程 。
无辐射跃迁
途径 体系跨越 -----最常见 辐射跃迁
1. 无辐射跃迁
振动驰豫 内转换 体系跨越 外转换
① 振动驰豫 较高能级分子与其它分子（样品或溶剂） 碰撞，能量变为热能。 ② 内转换和体系跨越 当两个相邻电子能级相距较近以致其振 动能级重叠，电子由较高电子能级以无辐射 跃迁方式至低一级电子能级，称为内转换。
（3）镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与 激发光谱形状一样）成镜像对称关系。 镜像规则的解释：
基态上的各 振动能级分布 与第一激发态 上的各振动能 级分布类似。
基态上的零振动能级与第一激发态的二 振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也 然。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350
620
3.激发光谱与发射光谱的关系 （1）Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。 发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫 消耗了能量。 （2）发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同 波长的能量（如能级图 2 , 1），产生不同 吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振 动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧 光（如’2 ）。
荧光分光光度法
荧光分光光度法荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。
其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。
通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。
荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190-650nm，发射波长扫描范围是200-800nm。
可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。
荧光分光光度计的工作原理：物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光．不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
荧光分光光度计基本结构：①光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故②激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
③发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。
筛选出特定的发射光谱。
④样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。
⑤检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。
分子荧光分光光度法实验技术
标准样品设置
2019/12/31
待测样品设置
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空白校零
2019/12/31
开始测定
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2019/12/31
2019/12/31
重新计算
2019/12/31
2019/12/31
九、荧光光度计使用注意事项：
1、比色皿使用之前应清洗干净。若比色皿很脏， 清洗方法为：先将比色皿置于铬酸洗液中浸泡半 小时左右，再用蒸馏水洗净，凉干留用。
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一、荧光分析法
物质的基态分子受一激发光源的照 射，被激发至激发态后，在返回基态时， 发射出与吸收光波长相等或较长的荧光。 若物质分子用X射线或红外光激发，则分 别产生X射线荧光或外光荧光。
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一、荧光分析法
通常所指的分子荧光是指紫外-可见光 荧光，即利用某些物质受到紫外光照射后， 发射出比吸收的紫外光波长相等或更长的 紫外荧光或可见荧光，通过测定物质分子 产生的荧光强度进行分析的方法称为荧光 分析。
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七、荧光分光度计的性能
可检测荧光、磷光及生物发光 扫描速度快，可达24000 nm/分，数据采
集速率达80次/秒 波长范围：190-1100 nm 光谱带宽：1.5、2.5、5、10和20 nm五档
切换 具有液体池和固体池，并具有自动控温设备。
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5、罩上仪器罩，打扫室内卫生，并在仪器使用登 记本上填写使用记录。
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操作软件包
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定性分析操作
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预扫描
2019/12/31
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第三章 荧光分光光度法
螯合物中金属离子的发光机理，通常是 螯合物首先通过配位体的*跃迁而被激 发，接着配位体把能量转移给金属离子，导 致d d*跃迁或f f*跃迁，最终发射的是 d*d跃迁或f*f跃迁光谱。
3.3 荧光分析的方法及影响因素 1. 荧光参数 （1）激发光谱和发射光谱 荧光的激发光谱和发射光谱是用荧光 法进行物质的定性、定量分析的基本参数 和依据。
b. 工作曲线法 先配制一系列不同浓度的标准溶液，分 别测定其荧光值，然后将减去试剂空白荧光 值的标准溶液荧光值与其相应浓度作图，即 得其工作曲线。 根据试液及试液空白荧光值，在此曲线 上即可找到试液的浓度。同时根据工作曲线 的线性情况，可以确定试液测定的最高浓度。
b. 分子的几何排布 物质的分子为平面型，且具有一定的刚 性结构，这样的分子荧光强烈。
对于顺反异构体，顺式分子的两个基团 在同一侧，由于位阻原因不能共平面，而没 有荧光。
c. 芳环上取代基的类型和位置 类型 • 有些取代基可增强荧光。如：-OH、-OR、 -NH2、-NHR、-NR2等；
•
有些取代基可减弱荧光。如：-COOH、 -C=O、-NO2、-Cl、-Br、-I等； 有些取代基影响不明显。如：-F、-SH、 -SO3H等。
不少有机化合物虽然具有共轭双键，但 由于不是刚性结构，分子处于非同一平面， 因而不发生荧光。
若这些有机化合物和金属离子形成螯合 物后，伴随着分子的刚性增强，平面结构增 大，常会发出荧光。
例如：8-羟基喹啉本身有很弱的荧光， 但其金属螯合物具有很强的荧光。这是由于 刚性和其平面性增加所致。
一般来说，能产生这类荧光的金属离子 具有硬酸型结构，如：Be2+、Mg2+、Al3+等。
•
位置 • 邻、对位取代，荧光增强；
分子荧光光度法
分子荧光光度法
分子荧光光度法是一种常用于检测物质浓度和反应动力学的分析方法。
它基于分子在受到光激发后发射荧光的原理，通过测量荧光的强度来确定物质的浓度。
在分子荧光光度法中，首先需要选择一个适合的激发波长，以激发待测物质中的荧光染料或标记物。
当激发波长的光照射到样品中时，样品中的分子吸收光能并跃迁到激发态。
在激发态停留的时间足够长时，分子会发生非辐射跃迁，即释放出荧光。
荧光的强度与待测物质的浓度成正比，因此可以通过测量荧光的强度来确定物质的浓度。
分子荧光光度法具有许多优点。
首先，它具有高灵敏度和高选择性，可以检测到极低浓度的物质。
其次，它具有快速和简便的特点，可以在短时间内完成测定。
此外，分子荧光光度法还具有广泛的应用领域，包括环境监测、生物学研究、医学诊断等。
然而，分子荧光光度法也存在一些限制。
首先，荧光信号受到许多因素的影响，如环境条件、荧光染料的性质等。
因此，在进行分子荧光光度法测定时，需要对这些因素进行严格的控制。
其次，某些样品可能会产生背景荧光干扰，这会降低测定的准确性。
因此，需要采取适当的方法来消除背景荧光的影响。
分子荧光光度法是一种重要的分析方法，它在物质浓度测定和反应
动力学研究等方面具有广泛的应用。
通过合理选择激发波长和采取适当的控制措施，可以获得准确和可靠的分析结果。
这种方法的发展将进一步推动科学研究和实际应用的进步。
第三章 分子荧光光度法
测器，检测方向与激发光成直角。
由光源发射的光经激发单色器得到所需的激发波 透光强度为I；荧光物质被激发后，发射荧光F。 为消除入射光的影响，荧光测量通常在与激发光 成直角的方向上进行。
长I0，经样品池后，一部分光能被荧光物质吸收，
第二发射单色器的设置是为了消除可能共存的
其它光线的干扰，如散射光以及溶液中其它杂 质所发生的荧光，以获得所需要的荧光，让其 作用于检测器上，得到相应的电信号，经放大 后作记录。 §3-5 分子荧光光度法的特点及应用
一.荧光光度法的特点 1.灵敏度
与紫外—可见光度法比较，荧光法检测是在
黑背景下进行，所以其灵敏度要高出2∼4个
数量级，测定下限为0.1∼0.001g/mL。
2.选择性强
荧光法既能依据特征发射又能依据特征吸收
来检定物质。如某几个物质的发射光谱相
似，则可从激发光谱的差异来区分；而如果
它们的激发光谱相同，则可通过发射光谱将
激发光谱和荧光发射
光谱的特点：
(1)荧光发射光谱与激
发波长无关，如前所述，
无论引起物质激发的波
长是1还是2，但荧光
发射波长都为3。
这是由于分子吸收了不同能量的光子可由基 态激发到不同的电子激发能级而产生几个吸收
带；由于较高激发态可通过内转换及振动弛豫
回到第一激发态的几率很高，远远大于由高能
决定于第一电子激发态中各振动能级的分布状况；
三．荧光和分子结构的关系 产生荧光的分子必须具备下列条件： (一)物质分子必须具有与所照射的光辐射相同频
率的吸收结构，才能吸收激发光。
(二)吸收了与其本身特征频率相同的能量之后， 必须具有一定的荧光效率。 荧光效率也称为荧光量子产率，表示物质发 射荧光的本领，为发出荧光量子数和吸收激发 光量子数的比值。
分子荧光法测定蒽
分子荧光法测定蒽一、 实验目的1. 掌握荧光光度分析法的基本原理和方法以及荧光激发光谱和发射光谱的关系；2. 掌握荧光光谱仪的基本组成及使用方法；3. 掌握荧光光谱定量分析的基本方法。
二、 实验原理处于基态的荧光物质分子吸收与其对应的特征电子能级相一致的光能后，将跃迁到能量较高的电子激发态。
处于较高电子激发态的分子，经振动弛豫、内转换等非辐射方式跃迁到单重激发态的最低振动能级，然后在10-9~10-7s 的短时间内发射光子返回基态，产生分子的荧光发射光谱。
每种荧光物质都具有特征的荧光激发光谱和荧光发射光谱，通常荧光发射光谱和它的激发光谱呈镜像对称关系。
对同一物质的稀溶液而言，荧光强度I f 与该物质的浓度c 有如下关系：lc I I f εϕ0f 303.2=当入射光强度I 0和吸光光程l 一定时，上式可简写为：Kc I =f 。
式中K 为常数。
因此，在低浓度下，荧光物质的荧光强度与浓度成线性关系，可利用标准曲线法对低浓度荧光物质进行定量分析。
三、 仪器与试剂仪器：荧光分光光度计（光谱仪）。
容量瓶若干。
试剂：10 mg·L -1蒽标准储备液。
四、 实验步骤1. 测量溶液的配制准确移取10 mg·L -1蒽标准储备液0.5、1、1.5、2和2.5mL 于5个50mL 容量瓶中，分别加入无水乙醇稀释至刻度，所得溶液浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg·L -1。
2. 激发光谱和发射光谱的绘制开启仪器，预热10分钟，预扫描确定最佳激发波长和发射波长，在最佳发射波长下绘制激发光谱；在最佳激发波长下绘制发射光谱。
改变不同的激发光波长，观察激发光波长对荧光发射光谱的影响。
3. 不同浓度下荧光光谱的绘制分别对浓度为1.00、2.00、3.00、4.00和5.00 mg·L -1的蒽的无水乙醇溶液扫描荧光光谱，并进行比较，观察浓度对荧光光谱的影响。
4. 蒽样品的定量分析（1）标准系列溶液荧光强度的测定分别由稀到浓测定浓度为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg·L -1的蒽的无水乙醇溶液的荧光强度。
荧光分光光度法
荧光分光光度计的结构与操作
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荧光分光光度计的结构
荧光分光光度计由光源、单色器、样品池、检测 器等部分组成，各部分协同工作完成荧光光谱的 测量。
荧光分光光度计的操作步骤
操作步骤包括样品准备、仪器调试、参数设置、 数据采集与分析等，操作时应严格按照仪器说明 书进行。
荧光分光光度计的维护与保养
为了保持仪器的性能和延长使用寿命，应定期对 仪器进行维护和保养，如清洁光学元件、检查电 路连接等。
荧光分光光度法
目录
CONTENTS
• 荧光分光光度法简介 • 荧光分光光度法的基本原理 • 荧光分光光度法的实验技术 • 荧光分光光度法的应用实例 • 荧光分光光度法的挑战与展望
01 荧光分光光度法简介
CHAPTER
定义与原理
定义
荧光分光光度法是一种基于荧光物质与激发光的相互作用， 通过测量荧光光谱来研究荧光物质性质的分析方法。
利用荧光染料标记DNA或RNA，通过 荧光光谱法检测基因表达和突变，以 及DNA和RNA的定量分析。
在环境监测领域的应用
污染物检测
荧光分光光度法可用于检测水体、土壤和空气中的有 害物质，如重金属、农药、酚类化合物等。
饮用水安全
通过荧光光谱法检测饮用水中的消毒副产物，确保饮 用水安全。
生态毒理学研究
荧光光谱的定量分析方法
荧光光谱的定量分析原理
荧光光谱的定量分析基于荧光物质浓度与荧 光强度之间的线性关系，通过测量荧光强度 可以推算出荧光物质的浓度。
荧光光谱的定量分析方法
定量分析方法包括标准曲线法、内标法、外标法等 ，应根据实验需求选择合适的分析方法。
荧光光谱的定量分析误差 来源
误差来源包括仪器误差、样品不均匀性、操 作误差等，应采取相应措施减小误差，提高 分析精度。
现代生物仪器分析第三章 分子荧光光谱法
第二节 荧光分析的原理
（一）荧光发生机理 物质的基态分子受一激发光源的照射， 被激发至激发态，在返回基态时，产生 波长与入射光相同或较长的荧光。 通过测定物质分子产生的荧光强度进行
分 析 的 方 法 称 为 荧 光 分 析 (fluorescence analysis)。
1、分子的激发态
荧光和磷光这两种光致发光过程的机理不同， 可从实验观察激发态分子寿命的长短来加以区 别： 对于荧光来说，当激发光停止照射后，发光 过程几乎立即停止（在10-9～10-6秒，荧光寿 命fluorescence life time ）。 磷光则将持续一段时间（在10-3～10秒）。
荧光分析法发展简史
2、分子荧光和磷光的产生
分子在室温时基本上处于电子能级的基态。当吸 收了紫外—可见光后，基态分子中的电子只能跃 迁到激发单线态的各个不同振动—转动能级，根 据自旋禁阻规律，不能直接跃迁到激发三重态的 各个振--转能级。 处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射 跃迁和无辐射跃迁等分子内的去活化过程释放多 余的能量而返回至基态，发射荧光是其中的一条 途径。
世界上第一次记录荧光现象是16世纪 西班牙的内科医生和植物学家 N.Monardes。 1575年他提出在含有一种木头切片的 水溶液中，可观察到极可爱的天蓝色。
1852年，stokes在考察奎宁和叶绿素的 荧光时，用分光光度计观察到其荧光的 波长比入射光的波长稍微长些，从而导 入了荧光是光发射的概念。 18工作。应用铝—桑色素配 合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行 的，直到1928年，才由Jette和West完成 了第一台荧光计。
激发单重态与激发三重态的性质不同
紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较
紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较定义：紫外可见分光光度法：根据被测量物质分子对紫外-可见波段范围（150～800纳米）单色辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性、定量或结构分析的一种方法；分子荧光光度法：利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对物质定性或定量分析的方法。
可以从发射光谱或激发光谱进行分析。
组成部件：紫外可见分光光度法：①辐射源。
必须具有稳定的、有足够输出功率的、能提供仪器使用波段的连续光谱，如钨灯、卤钨灯（波长范围350～2500纳米），氘灯或氢灯（180～460纳米），或可调谐染料激光光源等。
②单色器。
它由入射、出射狭缝、透镜系统和色散元件（棱镜或光栅）组成，是用以产生高纯度单色光束的装置，其功能包括将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需的单色光束。
③试样容器，又称吸收池。
供盛放试液进行吸光度测量之用，分为石英池和玻璃池两种，前者适用于紫外到可见区，后者只适用于可见区。
容器的光程一般为 0.5～10厘米。
④检测器，又称光电转换器。
常用的有光电管或光电倍增管。
⑤显示装置。
这部分装置发展较快。
较高级的光度计，常备有微处理机、荧光屏显示和记录仪等，可将图谱、数据和操作条件都显示出来。
分子荧光光度法：激发光源、单色器、样品池、检测器和记录显示部分。
1. 光源能发射紫外到可见区波长的光、强度大、稳定。
常用的有溴钨灯、高压汞灯、氙灯。
2. 单色器，两个单色器。
3. 样品池通常用石英制成。
4. 检测器：光电倍增管。
常见类型：紫外可见分光光度法：1.单光束。
简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。
2.双光束自动记录，快速全波段扫描。
可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。
仪器复杂，价格较高。
3.双波长。
将不同波长的两束单色光(λ、λ1 ) 快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。
荧光分光光度计(分子荧光)
荧光分光光度计（分子荧光）Fluores_cence •1楼1、基本原理在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。
跃迁到较高能级的分子，很快通过振动弛豫、内转换等方式释放能量后下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。
再由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。
荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。
物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。
如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（ex citation spectrum）。
实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。
在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。
在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。
激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。
某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluoresc ence analysis）。
对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。
2、检测荧光的仪器测定荧光可用荧光计和荧光分光光度计，其二者的结构复杂程度不同，但其基本结构是相似的。
紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较
紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较定义：紫外可见分光光度法：根据被测量物质分子对紫外-可见波段范围（150～800纳米）单色辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性、定量或结构分析的一种方法；分子荧光光度法：利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对物质定性或定量分析的方法。
可以从发射光谱或激发光谱进行分析。
组成部件：紫外可见分光光度法：①辐射源。
必须具有稳定的、有足够输出功率的、能提供仪器使用波段的连续光谱，如钨灯、卤钨灯（波长范围350～2500纳米），氘灯或氢灯（180～460纳米），或可调谐染料激光光源等。
②单色器。
它由入射、出射狭缝、透镜系统和色散元件（棱镜或光栅）组成，是用以产生高纯度单色光束的装置，其功能包括将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需的单色光束。
③试样容器，又称吸收池。
供盛放试液进行吸光度测量之用，分为石英池和玻璃池两种，前者适用于紫外到可见区，后者只适用于可见区。
容器的光程一般为 0.5～10厘米。
④检测器，又称光电转换器。
常用的有光电管或光电倍增管。
⑤显示装置。
这部分装置发展较快。
较高级的光度计，常备有微处理机、荧光屏显示和记录仪等，可将图谱、数据和操作条件都显示出来。
分子荧光光度法：激发光源、单色器、样品池、检测器和记录显示部分。
1. 光源能发射紫外到可见区波长的光、强度大、稳定。
常用的有溴钨灯、高压汞灯、氙灯。
2. 单色器，两个单色器。
3. 样品池通常用石英制成。
4. 检测器：光电倍增管。
常见类型：紫外可见分光光度法：1.单光束。
简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。
2.双光束自动记录，快速全波段扫描。
可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。
仪器复杂，价格较高。
3.双波长。
将不同波长的两束单色光(λ1、λ) 快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。
分子荧光光谱法(原理和方法)
概述
分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )又称
为荧光光谱法或荧光分析法．是以物质所发射的荧光强度 与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光光 谱的形状和荧光峰对应的波长进行行的定性分析．
荧光团杂化纳米二氧化硅微球
化合物
C6H5OH C6H5O— C6H5NH2
+ C6H5NH3
相对荧光 强度 18 10 20
0
荧光分光光度计
荧光分光光度计既可用于定量分析， 也可用于测绘激发光谱和荧光光谱
。荧光分光光度计既可用于定 量分析，也可用于测绘激发光谱 和荧光光谱。第一单色器选择激 发光波长（＞250nm的 紫外光）故称为激发单色器 第二单色器（荧光单色器） 与激发光入射方向垂直， 并选择荧光波长，可提高方法的选择性和准确度。
1. 激发
在室温下物质分子大部分处于基态的最低振动能级且电子自旋配对为单重
态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态
的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-
15秒.
激发
2 去活化过程
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态
对于很稀的溶液，投射到样品溶液上的被吸收的激发光不到2%时， 即εbc＜=0.05时，上式的第二项后的各项可以忽略不计。则
F = φI0[1-(1-2.303 εbc)]=2.303 φ I0 εbc
当I0一定时 并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比
F = K·C
(K = 2.303 φ I0 εb)
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体系跨越 S1*→T1*
③ 外转换
受激分子与溶剂或其它溶质分子间的相互 作用和能量转移。
外转换使分子的荧光或磷光减弱甚至消失， 这一现象称为“熄灭”或“淬灭”。
2. 辐射跃迁 ---- 荧光和磷光
处于电子激发态的分子（S1*或 T1*）通过光发射 回到电子基态，称为辐射跃迁
S1* → S0
---- 荧光
③ 电子能级分类：
电子自旋配对 ---- 单重态或单线态 S 自旋方向相反，S=(+ 12)+(- 12)=0, M=1
电子自旋非配对 ---- 三重态或三线态 T 自旋方向相同，S=1, M=3
基态能级 ---- S0
注意： a. 单线态是反磁性，三线态是顺磁性的 b. 允许跃迁：单线态→单线态，S*→S0，S0→S1、S2等 c. 禁阻跃迁：单线态→三线态，S0→T1、T2等 d. 能量大小：S1>T1 e. 寿命：激发单线态 ~ 10-8 s，激发三线态 10-4 ~ 1s
0‘
←F
S0
λ
↑
4
3 2
长
1
波
0
F→ 分子基态和激发态的位能曲线及电子跃迁示意图
三、物质分子结构与荧光的关系
（一）荧光强度（F）
1. 荧光量子效率 ΦF 激发态分子中以发射荧光的光量子数目和
分子吸收激发光的光量子总数之比：
F
发射荧光的量子数目 吸收激发光的量子数目
[ΦF∈（0，1）]
2. 荧光强度 F 荧光强度与吸收光的强度 Ia有关
① 振动驰豫
外转换
较高能级分子与其它分子（样品或溶剂）碰撞， 能量变为热能。
② 内转换和体系跨越 当两个相邻电子能级相距较近以致其振动能级重叠，
电子由较高电子能级以无辐射跃迁方式至低一级电子能 级，称为内转换。
电子由激发单重态向激发三重态的无辐射跃迁 称为体系跨越。
内转换
S2*→S1* T2*→T1*
例一 尿液中色胺的测定 尿液中色胺的含量是色胺酸新陈代谢的一个标志。
色胺有天然荧光，激发峰为285nm，荧光峰为 360nm。 利用苯可从尿或组织液中萃取出来， 即可进行检测。 在0.1~ 8 μg / 15mL范围内，F与色胺浓度呈线性关系。
例二 尿液中维生素B2的测定 维生素B2在430~440nm激发光照射下会发生绿色
F = ΦF Ia = ΦF ( I0 – It )
根据比尔定律 I t I 0 e bc
F F I a F (I0 I0 ebc )
F I0 (1 ebc )
当吸光度很小时（ A ≤ 0.05 ）
ebc
1bc
(bc)2
2!
(bc)n
n!
1 bc
∴ F = ΦF I0 εbc
T1* → S0
---- 磷光
E E ① S1* S0
T1* S0
② λ荧<λ磷
③ 强度 F 磷 < F 荧
④ τ 荧 = 10-6 ~10-9 s ， τ磷 = 10-4 ~ x s
二、激发光谱与荧光光谱Fra bibliotek1. 激发光谱：以激发光波长（ λ ）为横坐标，以 荧光强度（F）为纵坐标作图。
2. 荧光光谱：固定激发光波长，以 F 作纵坐标，以 发射出荧光波长（ λ ）为横坐标作图。
3. 图形特点：
① m激a、x 荧max既可定性，又可定量；
② λ激<λ荧；
③ 荧光光谱形状与激发光波长无关；
④ 荧光光谱与激发光谱呈镜像对称关系；
⑤
ma 激
x处产生的荧光强度
F
最强。
4. 光谱解析（互为镜像）
λ ↓
S1*
S----电子能级
长
波
4‘ 3‘ 2‘
0,1,2… 振动能级
1‘
0‘,1‘,2‘…
固定液层厚度：
F = K ·c
( A ≤ 0.05 )
3. 荧光强度与光吸收的关系
（1）产生荧光的必要条件
n → π* 去活化
① 对紫外可见光有吸收
荧光
π → π*
② 荧光物质的 ΦF 须较大
（2）吸收带与 F 的关系
n → π* 跃迁，为 R 吸收带， ε 小，
吸收弱，产生 F 小
π → π* 跃迁，为 K 吸收带， ε 大，
吸收强，产生 F 大
（二）有机化合物结构与荧光之关系
1. 共轭 π 键结构 π 键共轭程度大， ΦF 大，F ↗，λ F ↗。
① 能够产生荧光的物质多含有芳环或杂环的 一大类化合物。
② 含高共轭双键的脂肪烃类化合物。
2. 刚性平面结构 具有刚性平面结构， ΦF 大，F ↗，λ F ↗。
3. 取代基的影响 ① 给电子基，使 ΦF 大，F ↗， λ F ↗。 ② 吸电子基，使 ΦF 小，F ↘， λ F ↘。
NH
+ 3
OHH+
OHNH2 H+
NH-
pH < 2
pH 7--12
pH > 13
无荧光
蓝色荧光
无荧光
4. 荧光熄灭 荧光物质分子与溶剂或溶质分子的相互作用
引起荧光强度下降或荧光强度与溶液浓度不成线 性关系的现象。
荧光熄灭剂； 与荧光物质分子发生相互作用引起 荧光熄灭的物质。
如：X- 、重金属离子、O2、-NO2、重氮化合物、 -COOH、等。
3. 样品池 常用石英材料，四面透明
4. 检测器 光电池或光电倍增管
第四节 荧光分析方法实例
荧光法的优点： 灵敏度高、选择性好、取样量少等。
荧光法在临床检验、药物分析和生物化学上应用 在不断扩大。如血液和组织液中极微量的肾上腺素、 组胺、多巴胺、5-羟色胺和胆碱的测定，均可用荧光 法达到目的。药物检测分析如对抗生素、强心剂、麻 醉剂等，亦可用荧光法进行。
待测物浓度过大时，会发生分子间碰撞，使 荧光强度减弱，称为自熄灭。
第二节 荧光定量分析
一、基本原理
在稀溶液中，A≤ 0.05时，有：
F = K ·c 二、定量分析方法
1. 标准曲线法
（F - F0）
以（F - F0）对 C标作图， 测出 Fx ，查（ Fx - F0）
对应 Cx 。
（ Fx - F0）
Cx
C标
2. 标准对照法
（ Fs – F0 ）= K ·Cs （ Fx – F0 ）= K ·Cx
c c Fx F0
x
s Fs F0
第三节 荧光分析仪器
一、荧光计的主要部件
电源
光源
狭缝
光电倍增管
狭缝
发射 单色器
狭缝
激发 单色器
光电荧光计及荧光分光光度计示意图
光度表
1. 激发光源
特点：强度大、适用波长范围宽
③ 引入高原子序数原子如 Br、I 到 π 电子体系，
造成体系跨越，减弱荧光，增强磷光。
四、环境对荧光的影响
1. 温度：T ↗,内转换↗， ΦF 小，F ↘ 2. 溶剂： ① 极性↗， π → π*的ΔΕ ↘，跃迁几率↗，F ↗.
② 粘度↗，碰撞几率↘，F ↗。
③ 重原子溶剂（CBr4、C2H5I）， F ↘。 ④ 形成氢键，F ↘。 3. pH值：荧光物质为弱酸或弱碱时影响较大。
（一）分子的激发与驰豫
1. 分子的能级跃迁 ① 每个分子具有严格分立的能级。 ② 基态分子吸收了特征频率能量后，从低能级
向高能级跃迁，即处于不同的激发态。
Ej
hv
ΔE = Ej – Ei = hv
Ei
2. 分子的能态
① 每个电子其自旋量子数为
s= ±
1 2
② 能态的多重性M：分子光谱中电子能态的多少 M = 2 S + 1 （ S = ∣ ∑s ∣）
（二） 受激分子的弛豫方式
去活化过程： 激发态分子在极短的时间内回到 基态的过程 --- 亦称为驰豫 无辐射跃迁 *
去活化过程的途径 体系跨越 * ---- 最常见 辐射跃迁 *
内转换
无辐射跃迁
S2
体系跨越
S1
T1
外转换
S0 吸收λ1
吸收λ2 荧光λ 3
磷光λ 4
1. 无辐射跃迁
振动驰豫 内转换 体系跨越
光致发光：物质分子吸收一定能量的紫外光后发射 出的光辐射。
荧光（Fluorescence)，持续时间：10-9~10-6 s
磷光（Phosphorescence)，持续时间：10-3~10s 荧光光度法：利用测量荧光强度而建立的物质含量
分析方法。
第一节 荧光的发生及其与化 学结构的关系
一、荧光的产生
荧光，发射光波长为535 nm。在pH6 ~ 7时荧光最强， pH 11 时荧光消失。
常用：高压汞灯、氙弧灯、卤钨灯 2. 单色器
光电荧光计常用干涉滤光片，荧光分光光度计 常用光栅。 激发滤光片的作用：把不需要的光线滤去，让所选 择的激发光透过而照射在测定物质上。
荧光滤光片的作用：把激发光所发生的反射光、溶 剂的散射光以及溶液杂质所产生的荧光滤去，只让 样品物质所产生的荧光通过而照射到检测器上。