分子荧光光度法

Cx
C标
2. 标准对照法
（ Fs – F0 ）= K ·Cs （ Fx – F0 ）= K ·Cx
c c Fx F0
x
s Fs F0
第三节 荧光分析仪器
一、荧光计的主要部件
电源
光源
狭缝
光电倍增管
狭缝
发射 单色器
狭缝
激发 单色器
光电荧光计及荧光分光光度计示意图
光度表
1. 激发光源
特点：强度大、适用波长范围宽
例一 尿液中色胺的测定 尿液中色胺的含量是色胺酸新陈代谢的一个标志。
色胺有天然荧光，激发峰为285nm，荧光峰为 360nm。 利用苯可从尿或组织液中萃取出来， 即可进行检测。 在0.1~ 8 μg / 15mL范围内，F与色胺浓度呈线性关系。
例二 尿液中维生素B2的测定 维生素B2在430~440nm激发光照射下会发生绿色
常用：高压汞灯、氙弧灯、卤钨灯 2. 单色器
光电荧光计常用干涉滤光片，荧光分光光度计 常用光栅。 激发滤光片的作用：把不需要的光线滤去，让所选 择的激发光透过而照射在测定物质上。
荧光滤光片的作用：把激发光所发生的反射光、溶 剂的散射光以及溶液杂质所产生的荧光滤去，只让 样品物质所产生的荧光通过而照射到检测器上。
体系跨越 S1*→T1*
③ 外转换
受激分子与溶剂或其它溶质分子间的相互 作用和能量转移。
外转换使分子的荧光或磷光减弱甚至消失， 这一现象称为“熄灭”或“淬灭”。
2. 辐射跃迁 ---- 荧光和磷光
处于电子激发态的分子（S1*或 T1*）通过光发射 回到电子基态，称为辐射跃迁
S1* → S0
---- 荧光
T1* → S0
---- 磷光
E E ① S1* S0
T1* S0
② λ荧<λ磷
③ 强度 F 磷 < F 荧
④ τ 荧 = 10-6 ~10-9 s ， τ磷 = 10-4 ~ x s
二、激发光谱与荧光光谱
1. 激发光谱：以激发光波长（ λ ）为横坐标，以 荧光强度（F）为纵坐标作图。
2. 荧光光谱：固定激发光波长，以 F 作纵坐标，以 发射出荧光波长（ λ ）为横坐标作图。
③ 电子能级分类：
电子自旋配对 ---- 单重态或单线态 S 自旋方向相反，S=(+ 12)+(- 12)=0, M=1
电子自旋非配对 ---- 三重态或三线态 T 自旋方向相同，S=1, M=3
基态能级 ---- S0
注意： a. 单线态是反磁性，三线态是顺磁性的 b. 允许跃迁：单线态→单线态，S*→S0，S0→S1、S2等 c. 禁阻跃迁：单线态→三线态，S0→T1、T2等 d. 能量大小：S1>T1 e. 寿命：激发单线态 ~ 10-8 s，激发三线态 10-4 ~ 1s
NH
+ 3
OHH+
OHNH2 H+
NH-
pH < 2
pH 7--12
pH > 13
无荧光
蓝色荧光
无荧光
4. 荧光熄灭 荧光物质分子与溶剂或溶质分子的相互作用
引起荧光强度下降或荧光强度与溶液浓度不成线 性关系的现象。
荧光熄灭剂； 与荧光物质分子发生相互作用引起 荧光熄灭的物质。
如：X- 、重金属离子、O2、-NO2、重氮化合物、 -COOH、等。
③ 引入高原子序数原子如 Br、I 到 π 电子体系，
造成体系跨越，减弱荧光，增强磷光。
四、环境对荧光的影响
1. 温度：T ↗,内转换↗， ΦF 小，F ↘ 2. 溶剂： ① 极性↗， π → π*的ΔΕ ↘，跃迁几率↗，F ↗.
② 粘度↗，碰撞几率↘，F ↗。
③ 重原子溶剂（CBr4、C2H5I）， F ↘。 ④ 形成氢键，F ↘。 3. pH值：荧光物质为弱酸或弱碱时影响较大。
① 振动驰豫
外转换
较高能级分子与其它分子（样品或溶剂）碰撞， 能量变为热能。
② 内转换和体系跨越 当两个相邻电子能级相距较近以致其振动能级重叠，
电子由较高电子能级以无辐射跃迁方式至低一级电子能 级，称为内转换。
电子由激发单重态向激发三重态的无辐射跃迁 称为体系跨越。
内转换
S2*→S1* T2*→T1*
3. 图形特点：
① m激a、x 荧max既可定性，又可定量；
② λ激<λ荧；
③ 荧光光谱形状与激发光波长无关；
④ 荧光光谱与激发光谱呈镜像对称关系；
⑤
ma 激
x处产生的荧光强度
F
最强。
4. 光谱解析（互为镜像）
λ ↓
S1*
S----电子能级
长
波
4‘ 3‘ 2‘
0,1,2… 振动能级
Biblioteka Baidu
1‘
0‘,1‘,2‘…
F = ΦF Ia = ΦF ( I0 – It )
根据比尔定律 I t I 0 e bc
F F I a F (I0 I0 ebc )
F I0 (1 ebc )
当吸光度很小时（ A ≤ 0.05 ）
ebc
1bc
(bc)2
2!
(bc)n
n!
1 bc
∴ F = ΦF I0 εbc
3. 样品池 常用石英材料，四面透明
4. 检测器 光电池或光电倍增管
第四节 荧光分析方法实例
荧光法的优点： 灵敏度高、选择性好、取样量少等。
荧光法在临床检验、药物分析和生物化学上应用 在不断扩大。如血液和组织液中极微量的肾上腺素、 组胺、多巴胺、5-羟色胺和胆碱的测定，均可用荧光 法达到目的。药物检测分析如对抗生素、强心剂、麻 醉剂等，亦可用荧光法进行。
荧光，发射光波长为535 nm。在pH6 ~ 7时荧光最强， pH 11 时荧光消失。
（二） 受激分子的弛豫方式
去活化过程： 激发态分子在极短的时间内回到 基态的过程 --- 亦称为驰豫 无辐射跃迁 *
去活化过程的途径 体系跨越 * ---- 最常见 辐射跃迁 *
内转换
无辐射跃迁
S2
体系跨越
S1
T1
外转换
S0 吸收λ1
吸收λ2 荧光λ 3
磷光λ 4
1. 无辐射跃迁
振动驰豫 内转换 体系跨越
光致发光：物质分子吸收一定能量的紫外光后发射 出的光辐射。
荧光（Fluorescence)，持续时间：10-9~10-6 s
磷光（Phosphorescence)，持续时间：10-3~10s 荧光光度法：利用测量荧光强度而建立的物质含量
分析方法。
第一节 荧光的发生及其与化 学结构的关系
一、荧光的产生
（一）分子的激发与驰豫
1. 分子的能级跃迁 ① 每个分子具有严格分立的能级。 ② 基态分子吸收了特征频率能量后，从低能级
向高能级跃迁，即处于不同的激发态。
Ej
hv
ΔE = Ej – Ei = hv
Ei
2. 分子的能态
① 每个电子其自旋量子数为
s= ±
1 2
② 能态的多重性M：分子光谱中电子能态的多少 M = 2 S + 1 （ S = ∣ ∑s ∣）
0‘
←F
S0
λ
↑
4
3 2
长
1
波
0
F→ 分子基态和激发态的位能曲线及电子跃迁示意图
三、物质分子结构与荧光的关系
（一）荧光强度（F）
1. 荧光量子效率 ΦF 激发态分子中以发射荧光的光量子数目和
分子吸收激发光的光量子总数之比：
F
发射荧光的量子数目 吸收激发光的量子数目
[ΦF∈（0，1）]
2. 荧光强度 F 荧光强度与吸收光的强度 Ia有关
固定液层厚度：
F = K ·c
( A ≤ 0.05 )
3. 荧光强度与光吸收的关系
（1）产生荧光的必要条件
n → π* 去活化
① 对紫外可见光有吸收
荧光
π → π*
② 荧光物质的 ΦF 须较大
（2）吸收带与 F 的关系
n → π* 跃迁，为 R 吸收带， ε 小，
吸收弱，产生 F 小
π → π* 跃迁，为 K 吸收带， ε 大，
吸收强，产生 F 大
（二）有机化合物结构与荧光之关系
1. 共轭 π 键结构 π 键共轭程度大， ΦF 大，F ↗，λ F ↗。
① 能够产生荧光的物质多含有芳环或杂环的 一大类化合物。
② 含高共轭双键的脂肪烃类化合物。
2. 刚性平面结构 具有刚性平面结构， ΦF 大，F ↗，λ F ↗。
3. 取代基的影响 ① 给电子基，使 ΦF 大，F ↗， λ F ↗。 ② 吸电子基，使 ΦF 小，F ↘， λ F ↘。
待测物浓度过大时，会发生分子间碰撞，使 荧光强度减弱，称为自熄灭。
第二节 荧光定量分析
一、基本原理
在稀溶液中，A≤ 0.05时，有：
F = K ·c 二、定量分析方法
1. 标准曲线法
（F - F0）
以（F - F0）对 C标作图， 测出 Fx ，查（ Fx - F0）
对应 Cx 。
（ Fx - F0）