悬浮细胞的传代培养
叙述悬浮细胞、半贴壁细胞和贴壁细胞的传代方法。
6叙述悬浮细胞、半贴壁细胞和贴壁细胞的传代方法。
答：（一）悬浮生长细胞的传代：有以下两种方法：
1、直接传代法：①悬浮细胞自然沉淀瓶底；②用吸管吸去上清1/2～2/3；③轻轻吹打成细胞悬液；④等分装入数个培养瓶（皿）
2、离心传代法：①将细胞悬液转移到离心管内；②800～1000r/min离心5min，弃上清；③加新的培养液到离心管内；④吸管吹打成为细胞悬液；⑤分瓶（皿）培养。
（二）半贴壁细胞和贴壁细胞的传代：采用消化法。
消化液是：0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA、二者混合液、最好在37℃或室温（25℃以上）环境进行。
其操作步骤（以25ml培养瓶为例）: （1）弃去旧培养液；（2）漂洗：加入2mll 无Ca2+、Mg2+的PBS，漂洗1次后倒掉；（3）消化：加入消化液，使之铺满细胞表面（待肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液，残液继续作用2~3min，轻轻摇动，细胞层可随残液呈片状脱落下来，显微镜下发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时立即终止消化）；（4）吹打：加入完全培养基5mll，用吸管按顺序进行反复吹打瓶壁，吹打时不要用力过大。
（5）调整至合适细胞浓度，分瓶培养。
贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同培训
贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同培训
首先，在细胞生长形态上，贴壁细胞通常呈现典型的单层或多层附着
细胞的形态，细胞扩张生长速度较慢，细胞形态变化较小。
而悬浮细胞则
以单个细胞或细胞集合体的形式存在于液体培养基中，生长速度较快，细
胞形态较为多样化。
其次，在培养条件上，贴壁细胞需要在培养基中添加黏附分子或包袋
来增加其附着能力，以保持细胞在培养皿底部的黏附和生长。
而悬浮细胞
则需要在培养基中添加抗聚集剂或搅拌设备来避免细胞结块，以保持细胞
的均匀悬浮和生长。
再次，在传代方法上，贴壁细胞传代通常采用单层脱离法或酶消化法。
单层脱离法利用细胞与培养皿表面的非共价键结合进行脱离，可通过物理
刮擦或液体冲击等方法将细胞从培养皿上收集下来。
酶消化法则通过加入
蛋白酶等酶类物质分解黏附细胞与基质之间的胶原纤维等结构，使细胞能
够从培养皿表面脱离。
而悬浮细胞传代则更为简单，通常只需要将培养基
中的细胞离心沉淀后，将上清液中的细胞重新悬浮于新的培养基中即可。
此外，在培养基的选择上，贴壁细胞通常需要使用固体培养基，例如
含有胶原蛋白、明胶或滤纸等的培养基。
而悬浮细胞则需要使用液体培养基，例如含有血清或植物基因表达培养基等。
最后，在细胞应用方面，贴壁细胞通常用于细胞粘附、增殖和分化等
研究领域，如肿瘤细胞、成纤维细胞和内皮细胞等。
而悬浮细胞则常用于
细胞悬浮培养、蛋白质表达和病毒培养等研究领域，如白细胞、骨髓细胞
和病毒感染细胞等。
细胞大规模悬浮培养流程简介
•.
4•
细胞复苏注意事项
· 注意全程无菌操作 · 溶解冻存细胞时速度一定要快 ，避免缓慢升温细胞内形成冰
晶 ，对细胞造成损伤 · 计算合适的接种密度 ，一般CHO细胞培养的接种密度范围在
3.0-6.0*10E5个/ml · 注意安全：取出冻存管时防止冻伤 ， 同时注意有无液氮渗透
细胞株 摇瓶 WAVE或者种子罐
收货细胞液
反应器培养
•.
1 细胞复苏
· 将水浴管 ，用镊子夹住迅速放入水浴锅中晃动， 直至完全溶解后将冻存管表面消毒转移至超净工作台内进行 操作
· 将细胞悬液转移至15ml离心管内，加入约10ml培养液，轻 轻吹打混匀
· 将细胞悬液经800-1000rpm离心5分钟，弃去上清液
CHO细胞培养流程简介
•.
一 悬浮培养特点 （suspension culture)
· 非贴壁依赖型细胞的一种培养方式 · 细胞悬浮于培养基中生长或者维持 · 某些贴壁依赖型细胞经过适应和选择后也可
用此方法培养 · 使用振荡或者转动装置使细胞始终处于悬浮
状态
•.
二 CHO细胞大规模悬浮培养工艺流 程
液打入反应器进行扩培 · 当反应器内细胞密度达到要求后 ，接种至下一级反应器开始
生产阶段培养
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4 反应器生产阶段培养
· 取样 · 补碱 · 补料 · 补糖 · 收获
•.
取样
· 取样瓶灭菌 · 将取样瓶连接至反应器取样口 ，开始管路灭菌 · 灭菌完成后等待管路冷却 · 开始取样 · 取样完成后用纯蒸汽冲洗取样管路 · 将所取细胞液测定细胞密度、活力、pH值等参数
细胞传代培养实验
实验步骤
注意事项
1. 吹打制悬：用吸管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 2. 吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入 10 ml 离心管中。 3. 平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以 1 000 转/分钟离心 5 分钟。 4. 弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入 2 ml 培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬 液。 四、分装稀释细胞 1. 分装：将细胞悬液吸出分装至 2~3 个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的 5 生长，传代细胞的密度应该不低于 5×10 /ml，最后要做好标记。 五、传代培养 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入 CO2 培养箱中继续培养。传代细胞 2 小时后开始贴附 在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积 25%时为一个+，占 50%为++，占 75%时为+++。
（细胞培养技 术）实验方法 原理
培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。 贴壁生长的细胞用消化法传代； 部分贴壁生长的细胞 用直接吹打可传代； 悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代， 或用自然沉降法吸除上 清后，再吹打传代。
实验材料
细胞
试剂、试剂盒
D-Hanks 液小牛血清 RPMI1640 双抗胰蛋白酶 EDTANHClNaHCO3
收起
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
注意事项
1. 严格的无菌操作 2. 适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消 化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立 即终止消化。 附：0.25% 胰酶（胰蛋白酶，Trypsin） 配方：100 ml PBS，0.25 g 胰酶。 步骤：先配 100 ml PBS。 称胰酶 0.25 g。加入 PBS 中，低速搅拌。调 pH7.4。过滤，分装，-20℃ 保存，4℃短期内用完。 注意：低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，酶就变性了。低温，防止酶失活；对难 消化的细胞，在上述配方中，加入 0.02 g 的 EDTA（0.02%） 根据细胞生长的恃点，传代方法有 3 种：悬浮生长细胞传代、半悬浮生长细胞传代（Hela 细胞） 、贴壁生长细胞传代。
悬浮细胞培养流程
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悬浮细胞培养技术课件
悬浮细胞传代及细胞计数一、细胞传代实验目的：掌握悬浮细胞传代技术。
进一步掌握细胞培养的操作技术。
实验原理：培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。
为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。
实验用品：（一）仪器净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱；（二）玻璃器皿吸管（弯头、直头）、培养瓶、废液缸、（三）塑料器皿吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架（四）其他物品微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪（五）试剂1640培养液、PBS操作步骤：1.准备：打开培养液，PBS；取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。
从吸管筒中依次取出吸管，装上吸头，插入离心管备用。
2.从培养箱内取出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。
3.首先观察培养板孔中培养液量。
用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液，转入离心管中。
再另取一只吸管吸取PBS，放入培养板孔中，轻轻吹打孔壁，吸出转入离心管。
4.离心，设置离心机1000转/分，4-5分钟。
5.取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。
吸取培养液约7ML放入离心管，轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮。
6.吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中，备计数用。
7.其余的细胞分别放入六个孔中，每孔约1ML。
8.吸取培养液加入板孔中至1/3孔容量。
9.镜下观察细胞是否分布均匀，放入培养箱培养。
二、细胞计数及生长曲线测定培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期潜伏期(latent phase)细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。
一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。
原代和传代细胞的培养和维持
原代和传代细胞的培养和维持一、原代细胞的培养与维持1、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性，细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L，培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养，小牛血清浓度为10%～80%．在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。
贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增多，pH变酸，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。
其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。
2、悬浮细胞的培养凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞．若要将淋巴细胞及白血病细胞进行长期培养，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长，待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明细胞生长繁殖良好，一般每隔3天需半量换液一次（换液时尽量使细胞不丢失），待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变化时，此时可考虑传代。
悬浮细胞在未达到饱和密度时，但培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求时，只能采用半量换液的方式．二、原代细胞培养的首次传代 (Subculture)这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。
每进行一次分离再培养称之为传一代，传至5～10代以内的细胞通常称为次代培养细胞，传至10~20代以上的细胞，通常确定为传代细胞（或称传代细胞系）。
传代细胞系的建立，关键是初代培养的首次传代。
应注意如下几点：(1)细胞生长密度不高时，或未能达到覆盖整个瓶底时不能急于传代。
(2)原代培养的贴壁细胞多为混杂细胞，形态各异，往往是上皮样细胞和成纤维样细胞并存，采用胰蛋白酶消化时要掌握好消化时间，因成纤维细胞易于脱壁，上皮细胞不易脱壁，因此，可根据需要选用适当的消化时间及时中止消化。
悬浮细胞培养技术讲义
悬浮细胞传代及细胞计数一、细胞传代实验目的：掌握悬浮细胞传代技术。
进一步掌握细胞培养的操作技术。
实验原理：培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。
为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。
实验用品：（一）仪器净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱；（二）玻璃器皿吸管（弯头、直头）、培养瓶、废液缸、（三）塑料器皿吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架（四）其他物品微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪（五）试剂1640培养液、PBS操作步骤：1.准备：打开培养液，PBS；取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。
从吸管筒中依次取出吸管，装上吸头，插入离心管备用。
2.从培养箱内取出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。
3.首先观察培养板孔中培养液量。
用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液，转入离心管中。
再另取一只吸管吸取PBS，放入培养板孔中，轻轻吹打孔壁，吸出转入离心管。
4.离心，设置离心机1000转/分，4-5分钟。
5.取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。
吸取培养液约7ML放入离心管，轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮。
6.吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中，备计数用。
7.其余的细胞分别放入六个孔中，每孔约1ML。
8.吸取培养液加入板孔中至1/3孔容量。
9.镜下观察细胞是否分布均匀，放入培养箱培养。
二、细胞计数及生长曲线测定培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期潜伏期(latent phase)细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。
一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。
细胞传代
贴壁细胞：弃去培养液，加胰酶消化，加培养液终止胰酶作用，吹打成悬液，分装传代。
由于贴壁细胞贴壁生长，接触抑制，长满一瓶后贴壁较紧，不易取出。
这时必须用胰蛋白酶或者胶原蛋白酶处理，使其分散开后取出，然后在放入新的培养瓶中培养。
悬浮细胞：离心，弃上清液，加新鲜培养基，分装传代。
悬浮细胞其实也有贴壁现象，只是贴壁不牢。
可以直接用吹打发是细胞掉落下来，进行传代。
传代培养中的细胞传代培养（subculture），当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。
此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。
这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。
对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。
传代方法1．悬浮生长细胞传代传代培养中的细胞离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。
2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。
3．贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。
常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。
培养材料1、无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’sphosphate-bufferedsaline,Ca++/Mg++free,D-PBS,GibcoBRL21600-010)传代培养中的细胞2、trypsin-EDTAsolution(0.05%trypsin-0.53mMEDTA-4Na,GibcoBRL25300-062)：以10ml分装于15ml无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回温。
3、新鲜培养基4、无菌吸管/离心管/培养瓶编辑本段培养步骤1、附着型胞(adherentcell)（1）吸掉旧培养液。
悬浮细胞复苏传代冻存详细步骤
THP1细胞复苏传代以及冻存步骤
一,复苏
1,将液氮中冻存细胞拿出，迅速放在37℃水浴锅1-2min至融化。
2,1640培养液提前放入37℃,用1640培养基6ml左右洗涤一次，注意吹打使细胞分散，然后300g（rcf）5min离心（活细胞最大1400g）3,弃掉上清，用6ml左右培养基重悬。
4,加入到T25培养瓶，镜下观察细胞状态。
5,悬浮细胞竖立放入温箱。
二，传代（传代两次以上再用于后续实验）
1,镜下观察细胞密度，计数板计数，确定稀释倍数。
2,300g（rcf）5min离心，去除培养液。
3,加入适量预热的培养基，制成10^5个细胞/ml 的细胞悬液。
4,分装到2-3个新培养基，将其放入培养箱，24h观察一次（变黄了就传一次，2d左右）
三,冻存细胞
1，离心弃上清，用冻存液（领商品化试剂或者领血清，DMSO等配制），1ml左右混匀，注意避免气泡。
2,商品化的先放进-80℃，4h左右，再放入液氮罐，自己配制的要缓冻，先将-80℃盒子拿出来平衡，然后放入-80℃过夜，然后放液氮，或者在4℃，-20℃，-80℃依次放4h，然后转入液氮。
悬浮细胞培养步骤
悬浮细胞培养步骤悬浮细胞培养是一种常用的细胞培养方法，适用于那些不依附于培养基底的细胞，如血液细胞、淋巴细胞等。
本文将介绍悬浮细胞培养的具体步骤。
步骤一：选择适当的培养基在进行悬浮细胞培养前，需要选择适合细胞生长的培养基。
常用的培养基有RPMI-1640、DMEM等，其中含有丰富的营养物质和生长因子，可以满足细胞的生长需求。
步骤二：准备培养器具在进行悬浮细胞培养前，需要准备一些必要的培养器具，如离心管、培养瓶、移液管等。
这些器具需要事先进行无菌处理，以确保培养过程的无菌性。
步骤三：收集细胞将需要培养的细胞收集起来。
对于血液细胞等悬浮细胞，可以通过采血或离心分离的方式获得。
将细胞悬浮在培养基中，使细胞均匀分散。
步骤四：培养细胞将细胞悬浮液转移到培养瓶中，并加入适量的培养基。
将培养瓶放入恒温培养箱中，设置适当的温度和湿度，提供细胞生长所需的条件。
步骤五：观察细胞生长定期观察细胞的生长情况。
可以通过显微镜观察细胞形态的变化，或使用细胞计数仪测定细胞数量的变化。
根据细胞的生长情况，可以调整培养基中的营养物质浓度或添加适当的生长因子来促进细胞增殖。
步骤六：细胞传代当细胞密度达到一定程度时，需要进行细胞传代，即将细胞转移到新的培养瓶中。
传代的目的是避免细胞过度生长而导致细胞凋亡或失去特性。
传代时要注意保持细胞的无菌性，避免细菌或真菌的污染。
步骤七：采集细胞上清液在培养过程中，细胞会释放出一些细胞因子或代谢产物，这些物质存在于培养基的上清液中。
可以定期采集上清液，进行进一步的分析或利用。
步骤八：实验操作悬浮细胞培养可以用于各种细胞实验，如细胞增殖实验、药物筛选实验等。
根据实验的要求，可以对培养条件进行调整，如改变培养基中的成分或添加特定的试剂。
步骤九：细胞收获当需要收获细胞时，可以通过离心的方式将细胞从培养基中沉淀下来。
收获的细胞可以用于细胞分析、蛋白质提取等后续实验。
总结：悬浮细胞培养是一种常用的细胞培养方法，适用于不依附于培养基底的细胞。
悬浮细胞培养及siRNA转染
悬浮细胞培养及siRNA转染1.悬浮细胞培养用T25的培养瓶，一般密度较少时培养基最多5ml2.换液，动作缓慢的将培养瓶拿出，将上面无细胞的培养基弃去2ml加入新鲜培养基置于37℃，5%CO2培养箱中培养3.传代培养，将细胞吹匀，计数后，将细胞放入离心管内进行离心，1000rpm，5min后，弃去上清，用新鲜培养基重悬后放入T25中进行传代置于37℃，5%CO2培养箱中培养4. siRNA转染24孔板中以2x105细胞/孔密度进行接种后（6孔板或96孔板接种密度进行相应调整）准备进行siRNA转染，实验每组设置3个复孔，siRNA以Nuclease-Free Water稀释至储存液浓度，通常为20 μM。
（实验组一般设置：阴性对照，阳性对照，空白对照，siRNA 实验组，其他siRNA荧光标签组（要避光保存））。
5.根据siRNA终浓度进行溶液配制（以下溶液配制以50 nM为siRNA 最终浓度，24孔板中终液体体积为500 μl为例），溶液1配制：每孔1.25 μl siRNA储存液以无血清无双抗培养基稀释至25 μl，按此比例依照孔数进行扩大，将最终液体进行充分混匀；溶液2配制：每孔2 μl Lipo 2000转染试剂（可用其他替代，用量参照说明书推荐或自行优化）以无血清无双抗培养基稀释到25 μl，按此比例依照孔数进行扩大，将最终液体进行充分混匀；上述2种溶液混匀后分别室温静置5min；6.将溶液1滴加至溶液2中并进行充分混合（每孔为50 μl），室温静置20-30 min；静置完成后，将上述混合液滴加进去24孔板中，每孔50 μl，注意滴加不要过快，以防冲起细胞，滴加完成后每孔加入450 μl无血清无双抗培养基，充分混匀，将板放入37℃，5%CO2培养箱中培养7.6h后，将板取出放入cytation5中看荧光显色，siRNA是否转染成功8.在细胞操做台上，将24孔中每孔细胞液移入1mlEP管内进行离心，6000 rpm离心5min，弃去上清，加入有10%FBS无双抗的培养基进行重悬后加入24孔板进行培养。
悬浮细胞传代步骤
悬浮细胞传代步骤简介悬浮细胞传代是一种常用的细胞培养技术，用于扩增和维持悬浮细胞系的生长。
本文将详细介绍悬浮细胞传代的步骤，包括准备工作、传代操作和培养条件的调整。
准备工作在进行悬浮细胞传代之前，需要做一些准备工作，以确保实验顺利进行。
1.消毒操作：在进行任何实验之前，必须对实验室台面、培养器具和试剂进行彻底消毒，以防止污染和交叉感染。
2.培养基准备：根据所需的培养基配方，准备好足够的无菌培养基。
常用的培养基有DMEM、RPMI-1640等。
保持培养基在4摄氏度下保存，并避免阳光直射。
3.培养器具准备：准备好所需的培养器具，包括离心管、移液管、离心机、显微镜等。
确保这些器具已经消毒并无污染。
4.细胞培养条件调整：根据所需的细胞系，调整培养条件，包括温度、CO2浓度和湿度等。
一般来说，细胞在37摄氏度、5% CO2和95%湿度下生长最为理想。
传代操作悬浮细胞传代的步骤如下：1.收获细胞：将培养好的悬浮细胞系从培养瓶中收获出来。
可以使用离心机将细胞沉淀到离心管中，或者使用吸管等工具将细胞转移至新的培养器具中。
2.计数细胞：使用显微镜或自动计数器对收获的细胞进行计数。
这一步是为了确定需要传代多少个细胞，以便保持适当的密度。
3.离心沉淀：根据所需的传代比例，将计数好的细胞进行离心沉淀。
离心速度和时间根据不同的实验要求而定，一般为1000-1500rpm，5-10分钟。
4.去除上清液：倒掉上清液，并留下适量的液体悬浮细胞沉淀。
5.细胞重悬：将沉淀的细胞用适量的培养基进行重悬，使细胞均匀分散在培养基中。
注意避免产生气泡，以免对细胞造成机械损伤。
6.接种新培养器具：将重悬的细胞转移到新的培养器具中。
可以是新的培养瓶、离心管或96孔板等，根据实验要求选择合适的培养器具。
7.补充培养基：将足够量的新鲜培养基加入到新的培养器具中，使细胞能够正常生长和繁殖。
保持适当的培养基液面高度，以确保细胞获得足够的营养和氧气。
8.培养条件调整：将新接种的培养器具放入恒温箱中，并根据之前调整好的培养条件进行调整。
细胞复苏、传代、冻存
细胞复苏操作说明（针对冻存细胞）实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，水浴锅 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需复苏的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 从液氮罐中取出冻存管 ，直接浸入 37℃温水中 ，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从 37℃水浴中取出冻存管 ，打开盖子 ，移液枪吸出细胞悬液 ，加到离心管并滴加 5 倍以上完全培养 基并混匀 。
3. 操作离心 ， 调至1000 转/分 ，时长 10 分钟4. 弃去上清液 ，重悬离心管底部细胞沉淀 ，在 T25 培养瓶中加入 5-6ml 完全培养基 ，计数 ，调整细胞 密度，接种培养瓶 ，37℃培养箱静置培养。
5. 次日更换一次培养液，继续培养。
6. 注意：冻存细胞建议三管一起复苏到一个 T25 培养瓶。
细胞传代操作说明（贴壁细胞）实验仪器 ：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，0.25%胰酶 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 细胞于培养箱中 ，愈合度达到 80% ，可进行传代。
2. 按 T25 培养瓶计 ，吸出完全培养基 ，并 PBS 缓冲液轻冲 3 遍 ，添加 0.25%含 EDTA 胰酶 2ml ， 消 化 2min（具体时间视细胞而定） ，后用完全培养基将细胞冲洗下来。
1000r/min 离心 10 min ，弃上清 收集细胞，铺至 2 个 T25 培养瓶中培养，各添加 7ml 完全培养基。
3. 注意： 消化时间不易过长，消化前血清成分务必去除干净，终止消化请用新鲜完全培养基，原瓶培养基不可继续使用（终止消化或传代） 。
细胞传代操作说明（悬浮细胞）实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 细胞于培养箱中，密度达到悬浮细胞传代标准（沉降后可铺满底面），可进行传代。
悬浮细胞传代方法
我公司认为购买细胞的客户有培养细胞的经验，客户收到细胞，因运输途中细胞会有分泌物，所以原瓶中的培养液不能循环利用，将其全部倒掉，使用自己实验室的培养基（我司推荐的培养基）购买细胞注意事项客户收到细胞后请务必仔细阅读细胞注意事项，确保细胞的培养条件一致，如果由于培养条件不一致导致细胞出现问题，责任有客户自行承担。
1. 客户在收到细胞时，请首先观察培养瓶是否完好，培养液是否外渗，培养液是否混浊。
如发现有瓶破、渗漏、培养液混浊等问题，请在收到细胞后立即与我们联系。
2. 收到细胞时如无异常情况，请按照悬浮细胞处理方法处理细胞。
悬浮细胞传代方法1. 客户收到细胞先不开盖，放在培养箱静置半小时后在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行拍照（建议收到细胞时的培养基拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，显微镜下拍细胞100X ，200X 各两张，拍摄照片应清晰），排除细胞本身污细胞英文名称 NCI-H929细胞 细胞中文名称 人浆细胞白血病细胞形态特性淋巴母细胞样 生长特性 悬浮生长 培养体系 RPMI-1640+10%FBS 进口传代方法 保持细胞密度在5×105～1×106 cells/ml 之间，每周换液2～3次 传代情况冻存条件90%FBS+10%DMSO 支原体检测 阴性 使用权限A 类 实物状态 可用备注1、换液离心2、传代离心 保藏单位上海素尔生物科技有限公司 联系方法 张昕 189********染的情况；2.细胞在培养瓶中培养至良好状态后灌满完全培养液并封好瓶口是细胞运输的最好办法。
从细胞资源中心获得细胞回到自己的实验室后，先打开外包装，用75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到超净台内，严格无菌操作。
3.传代方法：（1）将培养瓶直立静置20 min，让细胞沉淀到瓶底，将上层培养液小心吸出至新的50 ml 离心管中，可以留待日后培养用。
（收到细胞，建议弃去原基培养，使用新鲜完全培养基培养）（2）将培养瓶底部的15ml左右完全培养液转移到无菌离心管中，800g室温离心3-5min，收集细胞沉淀。
细胞传代方法
细胞传代方法
关键词：细胞培养液试剂标准物质北京标准物质网
根据细胞生长的特点，细胞传代方法可分为三种。
1.悬浮生长细胞传代悬浮细胞离心(1000rpm)去上清，沉淀的细胞加入新鲜培养液后混匀再转至新的培养器皿培养。
2.直接传代法悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1
／2～2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液后再加入新鲜培养液。
3.贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代，常用的是0．25％的胰蛋白酶液。
主要步骤如下：弃除培养瓶中的培养液，加入0. 25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准)，静置2～10分钟，显微镜下动态监测细胞消化情况。
加入等体积的培养液中和胰蛋白酶液的消化作用，吸取瓶内细胞悬液，1000rpm离心5分钟。
使用适量培养液重悬细胞沉淀，吸取适当比例的细胞接种于新的培养器皿内放入培养箱中培养。
常用细胞培养技术 传代1原代培养细胞的首次传代
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4.反复贴壁法
– 成纤维细胞：贴壁快（10-30min）； – 上皮细胞：短时间不能附着或附着不稳定，
稍振荡即浮起
据此纯化细胞。
方法： – 镜下观察，部分细胞贴壁后 – 摇荡培养基，倒掉 – 反复多次，达到去除上皮细胞的目的。
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5.克隆法
• 稀释细胞，使单个细胞在体外增殖6代以上，形成的细胞群称 作克隆。每个克隆含50个以上细胞，一个克隆起源一个细胞，
2、生长的密度抑制。
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贴壁细胞的消化传代步骤
(1)吸除旧培养基 (2)加2mLPBS（无钙、镁），漂洗一次 (3)加1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混
合液）
(4)轻摇培养瓶，消化液铺满细胞表面
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(4) 镜下见细胞回缩，细胞间隙增大，倒掉消化
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(4) 镜下见细胞回缩，细胞间隙增大，倒掉消化液，再继续
作用2～3分钟。
(5)镜下见变圆，立即终止消化。 (6)加完全培养基，反复吹打；
– 吹打按顺序进行，确保所有瓶壁均吹到 – 吹打要轻柔，不要出现泡沫，避免机械损伤
(7) 计数，调整浓度，分瓶培养。
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抑制其他细胞生长。
主要有以下5种方法：
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1.培养基限定法：细胞生长过程中，必须存在或去
除某种物质，否则无法生长，而其他细胞与之相反。
– 例如加入特殊的细胞因子而纯化出只依赖于这种细胞因子 生长的细胞系。
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悬浮细胞的传代培养
关键词：细胞菌株标准物质中心北京标准物网
1)训练目的
熟练掌握悬浮细胞的传代培养法。
2）买验原理
体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，维持细胞种的延续。
放平细胞瓶，当发现悬浮细胞长到瓶壁85％～90％时，从容器中取出细胞，以1：2或1：3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为悬浮细胞的传代培养。
3)实验材料
CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75％酒精棉球、酒精灯、悬浮细胞株、完全培养基(RPMLl640或DMEM)。
4)操作步骤
A.热培养用液：把已经配制好的培养液瓶子放人37℃水浴锅内预热。
B.用75％酒精棉球擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
C.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
D.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
E.超净工作台内拆除已消毒空培养瓶的外包装。
F.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后放人超净工作台内。
G.从培养箱内取出悬浮细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用75％酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
H.静置：超净工作台内将需传代的培养瓶直立静置半小时左右，待大部分细胞都沉降到细胞瓶底，轻轻吸出1／2～2／3的旧培养基。
I.分瓶：加入新鲜培养液，按1：2或1：3的比例分装到2或3个培养瓶中，再逐瓶加入新鲜培养基。
若想节约时间，并且离心对细胞影响也不大，可采用离心的方式取代静止分离。
将培养瓶中的悬浮细胞从培养箱中取出，超净工作台内将所有含细胞的培养液转入离心管，1000r／min。
离心5 min，弃上清。
加入定量新鲜培养基重悬后以1：2或1：3的比例分装到2或3个培养瓶中培养。
如果实验需要，可以在分瓶前计数，细胞的浓度一般不低于5x105个／mL。
做好标记。