实时荧光定量PCR介绍

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实时荧光定量PCR方法简介

实时荧光定量PCR方法简介一．实时荧光定量PCR的基本原理理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。

但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。

因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性.如采用常规的终点检测法（利用EB 染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量),即使起始模板量相同经PCR扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。

为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数-—Ct值,定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。

Ct值是如何得到的在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行,定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。

Ct值的定义Ct值中的“C”代表Cycle（循环）,“t”代表检测threshhold(阈值）,其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对应的横坐标。

Ct值与样品中模板的对应关系Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系(y=ax+b,x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。

与终点法相比利用Ct值的优势由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数,该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确,重复性也更好。

传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少,从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。

下图中是96个复孔的实时扩增曲线(完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度)，可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。

实时荧光定量PCR原理与分析方法

实时荧光定量PCR原理与分析方法实时荧光定量PCR（qPCR）是一种基于PCR技术的DNA定量方法，可以在实时反应过程中实时监测PCR产物的累积情况。

与传统的终点PCR相比，qPCR具有更高的灵敏度和准确性，可以定量检测非常低浓度的目标DNA。

实时荧光定量PCR的原理是利用荧光染料与PCR产物结合发出荧光信号，通过监测荧光信号的强度来测定PCR产物的数量。

qPCR有两种常用的检测方法：SYBR Green I染料法和探针法（如TaqMan探针法）。

SYBR Green I染料法是一种简单而常用的qPCR检测方法。

SYBR Green I是一种DNA结合荧光染料，在PCR反应过程中会与PCR产物的DNA结合，从而产生荧光信号。

这种方法的优点是简便、经济，但缺点是非特异性，可能产生假阳性结果。

探针法是一种更为特异和准确的定量PCR方法。

在这种方法中，需要设计一对特异性引物和一个包含荧光探针的引物。

在PCR反应过程中，引物与目标DNA特异性结合，探针结合在引物的靶区上，当PCR反应进行到延伸阶段时，Taq聚合酶会切割探针上的荧光标记，导致断裂，这样就分离出信号的发射荧光信号。

探针法具有高特异性和准确性，能够避免假阳性结果。

无论是SYBR Green I染料法还是探针法，实时荧光定量PCR的分析方法都是通过构建标准曲线并计算目标DNA的模板数量来定量分析样品中的目标物质。

首先，需要用已知浓度的目标DNA制备标准品，根据不同浓度标准品的CT值（荧光信号阈值）绘制标准曲线。

然后，将样品DNA与引物一起进行PCR扩增反应，监测荧光信号强度并记录CT值。

利用标准曲线可以计算出样品中目标物质的浓度。

实时荧光定量PCR仪

实时荧光定量PCR仪仪器原理及应用实时荧光定量PCR仪是一种基于PCR技术的分子生物学仪器。

它可以实时监测PCR 反应过程中的荧光信号，从而实现对靶标DNA的定量分析。

该仪器的原理基于原始的聚合酶链式反应（PCR）技术，通过PCR产生的DNA序列与特定荧光探针的结合，释放出荧光信号进行定量测量。

实时荧光定量PCR仪在生物医学研究、基因表达分析、病原体检测等方面具有广泛的应用。

通过该仪器，科研人员可以快速、准确地检测靶标DNA的含量，并获得相应数据用于后续分析。

仪器特点实时荧光定量PCR仪具有以下几个特点：1. 高灵敏度实时荧光定量PCR仪可以检测非常低浓度的靶标DNA，甚至达到单个分子的级别。

这一特点使得该仪器在医学诊断和疾病早期检测中具有很大潜力。

2. 高准确性该仪器采用荧光定量技术，能够实时监测PCR反应过程中的荧光信号，从而避免了传统PCR反应后的测量误差。

同时，实时荧光定量PCR仪还具有内标校正功能，能够准确地计算出靶标DNA的含量。

3. 广泛应用实时荧光定量PCR仪在生物医学领域有着广泛的应用。

它可以用于基因表达分析、病原体检测、遗传疾病的检测等方面。

同时，该仪器还可以应用于农业科学、环境监测、食品安全等领域。

使用方法使用实时荧光定量PCR仪进行实验需要以下步骤：1. 样本制备首先需要从待测样品中提取目标DNA，并进行纯化和扩增。

这一步骤可以根据具体实验目的选择不同的提取方法。

2. 反应液的配置将所需的PCR反应药物配置出合适的反应液。

其中包括靶标DNA的引物和荧光探针，以及聚合酶和其他辅助物质。

3. 仪器设置将PCR反应液加入到实时荧光定量PCR仪的孔板或管条中，然后将样品放入仪器中。

根据实验需要设置合适的温度和时间条件。

4. 实时检测启动仪器后，开始进行PCR反应和实时荧光检测。

仪器会不断地记录PCR反应过程中的荧光信号，并将数据输出保存。

5. 数据分析使用相应的分析软件对实时荧光定量PCR仪的输出数据进行处理和分析。

实时荧光定量PCR

1、实时定量PCR是什么?定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。

实时荧光定量PCR技术（real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR）是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，实现了PCR从定性到定量的飞跃。

白话版：简单的说，就是在PCR体系中加入荧光，以便对反应体系和反应进程进行监测，记录，分析。

而PCR仪无非是在普通PCR的基础上加上个荧光探头和相应的数据处理软件而已。

所以说，FQ-PCR不神秘。

2、为什么要发展出FQ-PCR?早期定量PCR 技术的难点主要在于：（1）如何确定PCR 正处于线性扩增范围内（只有在此范围内PCR 产物信号才与初始模板的拷贝数成比例）。

（2）一旦线性扩增范围确定以后，如何找到一个合适的方法检测结果。

为了保证线性，研究者要扩增一系列梯度稀释的cDNA(1)或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整；有的研究者加一个竞争性模板，有的做限制性的稀释梯度分析，或者加一个PCR 模拟（mimic）反应，即用相似的引物与目标产物共扩增。

而扩增产物的检测通常在跑胶以后通过染料，放射活性或者探针进行检测。

在实时PCR 中，不再需要担心扩增的线性和放射性污染，也不再需要跑胶和手工收集数据，2到3小时之内就可以拿到数据。

除此之外，实时PCR 还有其它的一些优点：灵敏度大大提高；可以实现高通量；所有实验在封闭系统内完成，可变因素大大减少；可以进行多重PCR 反应，而且不需要后期处理。

白话版：定量PCR是为了测定或比较扩增前样品的量，普通PCR的扩增有线性(中期)和平台期(后期)，而到了平台期，拷贝数不一样的样品会得到相同的终产物量；早期的定量只能称为半定量，而且定量是终产物采用跑胶，染EB，测光密度的方法，不仅不准确，而且繁琐。

FQ-PCR的出现真是应时而现啊！3、科学研究中核酸定量有何意义?白话版：科研中最基本，最常用的是比较基因表达的差异。

实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用PPT课件

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它利用荧光染料或荧光探针标记特异性引物，在PCR反应过程中，随着DNA或RNA的扩增，荧光信号被逐渐释放，通过检测荧光信号的强度，可以实时监测DNA或RNA的扩增量。
实时荧光定量PCR的原理概述
实时荧光定量PCR的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，这些荧光物质与DNA或RNA结合后，在特定波长光的激发下产生荧光信号。
环介导等温扩增技术
在恒温条件下进行核酸扩增，具有快速、特异性强和灵敏度高等优点。
纳米材料与PCR的结合
利用纳米材料的特性，提高PCR的检测效率和灵敏度。
提高检测灵敏度与特异性
信号放大技术
通过使用信号放大系统，提高检测信号，从而提高检测灵敏度。
特异性引物和探针的设计
针对目标基因设计特异性引物和探针，降低非特异性扩增和交叉污染的风险。
选择合适的内参基因
选择稳定的内参基因
01
内参基因应具有稳定的表达水平，不受实验处理的影响。
验证内参基因的稳定性
02
通过实时荧光定量PCR技术，对候选内参基因进行稳定性评估。
使用多个内参基因参基因进行数据校正。
数据解读与报告
标准化处理
对原始数据进行标准化处理，消除不同样本间的差异。
样本处理
对样本进行破碎、离心、提取核酸等处理，以获得待测的DNA或RNA。
浓度和纯度测定
使用紫外分光光度计等设备测定核酸浓度和纯度，确保符合实验要求。
引物设计与选择
引物设计
根据目标基因序列，利用引物设计软件进行引物设计。
引物筛选
根据实验需求，筛选出特异性好、扩增效率高的引物。

实时荧光定量PCR技术详解和总结

实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。

它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。

二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。

实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。

根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。

实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。

三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。

（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。

实时荧光定量PCR

制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板 • • • • • • • • • 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 反应物 10× PCR缓冲液 MgCl2 溶液上游引物F 下游引物R dNTP混合液 Taq聚合酶 cDNA 加水至总体积为剂量 2.5 ul 1.5 ul 0.5 ul 0.5 ul 3 ul 1 ul 1 ul 25ul
• PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数
平台期
Rn（荧光强度） Rn（荧光强度）
指数期 Ct值
基线期
Cycle（循环数）（循环数）
Ct值与模板起始量的关系
• 模板DNA量越多，荧光
达到域值的循环数越少，即Ct值越小。
扩增效率
• 扩增效率与标准曲线的斜率相关，计算方程为：扩增效率E＝10-1/斜率。理论上，在每个指数扩增循环中，PCR产物的量加倍 • 一般说来，扩增效率接近100％是优化的重复性好实验的最好标志，实际操作时，反应的扩增效率应该在90％－105％之间。
实时定量荧光PCR仪
荧光PCR的定义荧光PCR的标记荧光PCR的简介荧光PCR特点
实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应软件可以对产物进行分析，从而精确定量计算待测样品的初始模板量的方法。
管家基因反应体系 • • • • • • • • • 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 反应物 SYBR Green 1 染料内参照上游引物F 内参照下游引物R dNTP Taq酶待测样品cDNA ddH2O 总体积剂量 10µl 0.5µl 0.5µl 0.5µl 1µl 5µl 32.5µl 50µl

实时荧光定量pcr原理

实时荧光定量pcr原理实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）是一种用于检测和定量DNA或RNA的技术。

它结合了PCR技术和荧光探针技术，能够实时监测PCR反应过程中的荧光信号变化，从而实现对目标核酸的定量分析。

本文将介绍实时荧光定量PCR的原理及其在科研和临床中的应用。

实时荧光定量PCR的原理基于PCR技术，PCR是一种体外扩增DNA的方法，通过DNA聚合酶酶链反应（PCR）使目标DNA序列在体外得到扩增。

而实时荧光定量PCR则在PCR反应中引入了荧光探针，利用荧光信号的变化来监测PCR反应的过程。

在实时荧光定量PCR中，通常使用的荧光探针包括SYBR Green和TaqMan探针。

SYBR Green是一种DNA结合染料，它能够与PCR反应中产生的双链DNA结合并发出荧光信号，因此可以用来监测PCR反应的进程。

TaqMan探针则是一种双标记探针，包括一个荧光素和一个荧光淬灭器，它能够在PCR反应中特异性结合目标DNA序列并发出荧光信号，因此可以用来定量PCR反应中的目标DNA。

实时荧光定量PCR的原理可以简单概括为，首先，将待扩增的DNA样品与引物和荧光探针一起加入PCR反应体系中；然后，利用热循环装置对PCR反应体系进行多次循环加热和降温，使目标DNA序列得到扩增；在PCR反应过程中，荧光探针与目标DNA结合并发出荧光信号，这些信号会被实时监测和记录下来；最后，通过分析监测到的荧光信号的变化，可以计算出PCR反应体系中目标DNA的起始量，并进行定量分析。

实时荧光定量PCR在科研和临床中有着广泛的应用。

在科研领域，实时荧光定量PCR可以用于基因表达分析、病原微生物检测、基因型分析等方面，其高灵敏度和高特异性使其成为了研究人员进行生物学研究的重要工具。

在临床诊断中，实时荧光定量PCR可以用于疾病的早期诊断、疾病的病原体检测、药物代谢酶基因型分析等方面，其快速、准确和可靠的特点使其成为了临床诊断中不可或缺的手段。

实时荧光定量pcr的原理及应用

实时荧光定量PCR的原理及应用1. 简介实时荧光定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction，简称qPCR）是一种强大的分子生物学技术，能够在同一反应体系中完成DNA扩增和定量，具有高灵敏度、高特异性和高精确性的优势。

本文将介绍实时荧光定量PCR 的原理和应用。

2. 原理实时荧光定量PCR基于传统PCR技术的基础上，引入荧光染料或探针来实时监测PCR反应过程中产生的增量扩增DNA量。

其原理如下：1.DNA模板的变性：通过加热将DNA模板的双链DNA变性成两个单链。

2.引物结合：待扩增的特定DNA序列的引物（Forward primer和Reverse primer）与模板DNA的互补序列结合。

3.DNA聚合酶扩增：DNA聚合酶沿着模板DNA链酶解附近的单链DNA，并将新的DNA链合成。

4.荧光信号监测：引入特定的荧光染料（如SYBR Green）或探针（如TaqMan探针），实时监测PCR反应体系中DNA扩增量的变化。

5.数据分析：使用特定的PCR仪器记录和分析荧光信号，根据荧光信号的变化量确定目标DNA序列的起始量。

3. 应用实时荧光定量PCR技术在许多领域中有广泛的应用，主要包括以下方面：3.1 疾病诊断与检测实时荧光定量PCR可以用于快速检测和诊断各种疾病，例如：•新型冠状病毒（COVID-19）检测•癌症标志物的检测•细菌和病毒感染的检测•遗传性疾病的检测3.2 基因表达分析实时荧光定量PCR可以用于研究基因的表达水平，包括：•基因表达差异分析•基因调控网络的研究•基因表达谱的分析•转录因子的研究3.3 环境监测实时荧光定量PCR可以应用于环境监测领域，用于检测和量化环境中的微生物和污染物，例如：•水质监测中细菌和病毒的检测•土壤中污染物降解菌的鉴定和定量•空气中微生物的检测3.4 遗传学研究实时荧光定量PCR在遗传学研究中也有广泛的应用，包括：•DNA定量和质量检测•突变检测和鉴定•群体遗传学分析•基因组学研究4. 总结实时荧光定量PCR技术是一种准确、高效、灵敏的分子生物学技术，广泛应用于医学、生物学、环境科学和农业等领域。

实时荧光定量pcr名词解释

实时荧光定量pcr名词解释
实时荧光定量 PCR 是一种用于检测和分析 DNA 或 RNA 的方法，通过在 PCR 反应体系中添加荧光基团，实时检测 PCR 扩增产物对应的荧光信号，从而对起始模板进行定量和定性分析。

荧光基团包括荧光染料和荧光探针两种形式。

荧光染料如 SYBRGreen 是一种结合于
双链 DNA 的双螺旋小沟区域的绿色荧光染料，在游离状态下发出微
弱的荧光，一旦与双链 DNA 结合后，荧光大大增强，可以根据荧光
信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量。

而 TaqMan 荧光探针则是在 PCR 扩增时添加的一条特异性的荧光探针，其中 5"端标记一个报告荧光基团，3"端标记一个淬灭荧光基团。

在 PCR 扩增时，Taq 酶的 5"-3"外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。

实时荧光定量 PCR 具有灵敏度高、操作简单、实时监测等优点，广泛应用于基因表达分析、基因突变检测、病毒检测等领域。

实时荧光定量PCR(qPCR)技术简介

实时荧光定量 PCR 技术简介实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一项以PCR 反应为基础的DNA定量技术，通过对目标基因在扩增过程中产生的拷贝数进行实时的定量，从而达到对目的基因的定性和定量分析。

现有两种常用的方法对PCR 产物进行荧光定量：一种是利用荧光染料与双链DNA 结合，通过荧光强度进行定量；另一种是利用携带了荧光报告基团的特异DNA探针对目标基因进行定量。

一、利用荧光染料进行定量一种最为常用的定量方法就是在PCR 反应体系中加入荧光染料，此类荧光染料会与所有的双链DNA 结合，并产生荧光。

游离的荧光分子不会产生荧光信号，只有与双链DNA结合的荧光分子才会释放荧光，随着DNA 拷贝数的增加，测得的荧光强度也会增强。

利用荧光染料进行定量的优势就是成本低廉，只需要一对普通的引物就能完成定量。

然而，常用的诸如SYBR Green 染料会与所有的双链DNA 无差别地结合，包括引物二聚体，因此有可能会导致对目标基因的定量不精确，灵敏度偏低。

二、利用荧光探针进行定量荧光探针只能检测出与自身序列互补的DNA 片段，因此用探针法定量可以有效地避免引物二聚体的干扰，使定量结果更加精确。

此外，通过使用携带不同荧光信号的多种探针，我们可以同时对一个样品中的多个靶序列进行定量。

荧光探针的5’端携带有一个荧光报告基团，3’端则为淬灭基团，在正常情况下两个基团间的距离很近，淬灭基团会抑制报告基团使其无法发出荧光。

在PCR 反应过程中，引物和荧光探针在退火阶段都会与目的片段结合；在延伸阶段，Taq 酶因为具有5’-3’核酸外切酶活性，会将探针，使得报告基团和淬灭基团相互分开，从而释放出荧光。

每增加一条目的基因的拷贝，就会有一个探针被切开并释放荧光信号，因此随着PCR 反应的进行，荧光信号会逐渐增强。

使用探针进行荧光定量的优点就是精确度和灵敏度都要比荧光染料高，且可以做到同时对多个基因进行定量，但是相应的合成探针的成本也要比使用荧光染料高出许多。

实时定量荧光pcr原理

实时定量荧光pcr原理
实时定量荧光PCR（quantitative Real-Time PCR）是一种基于PCR技术的高效、准确且可靠的DNA分析方法。

其主要原理
是通过在PCR反应过程中实时监测DNA扩增产物的累积量，从而定量测定起始DNA模板的数量。

实时定量荧光PCR的核心是使用荧光探针的方法来定量检测PCR反应过程中的DNA扩增产物。

在PCR反应中，荧光探
针包含一个荧光染料和一个荧光素（quencher）分子。

当探针
与PCR反应中的模板DNA序列互补结合时，荧光染料与荧光素分子之间距离较远，荧光信号强度较高。

而当PCR反应进
行到延伸阶段，DNA聚合酶酶活将荧光探针的酶切位点切除，导致荧光染料与荧光素分子之间距离缩小，荧光信号强度降低。

根据荧光信号的变化情况，可以推算出PCR反应过程中DNA
扩增产物的实时累积量。

为了实现定量测定，实时定量荧光PCR还需要设置一个标准
曲线。

首先，制备一系列包含已知浓度的DNA标准品，然后
通过实时定量荧光PCR测定这些标准品的荧光信号。

根据标
准品荧光信号与其对应浓度之间的关系，构建标准曲线。

最后，通过比较待测样品的荧光信号与标准曲线，可以确定样品中的DNA起始数量。

实时定量荧光PCR在科学研究和临床诊断中具有广泛应用。

它可以用于分析基因表达水平、研究遗传变异、检测病原体等。

相比传统的定量PCR方法，实时定量荧光PCR具有灵敏度高、
精确性好、操作简便等优点，成为分子生物学领域中不可或缺的实验技术之一。

实时荧光定量PCR技术详解和总结

实时荧光定量PCR技术详解和总结实时荧光定量PCR技术是一种用于测定DNA样本中特定序列的数量和表达水平的分子生物学技术。

它能够在PCR反应进行过程中实时监测PCR 产物的扩增情况，通过检测荧光信号的强度和PCR循环次数来确定起始模板的数量。

该技术具有高灵敏度、准确性和广泛的应用领域，被广泛用于基因表达分析、病原微生物的定量检测和分子诊断等领域。

在使用引物和探针系统进行实时荧光定量PCR时，引物通过与模板DNA序列的互补配对，在PCR扩增过程中结合并扩增目标序列，而探针是一种荧光标记的序列，通过与目标序列的特定区域配对来检测PCR产物的扩增。

当目标序列存在于DNA模板中时，引物与探针结合扩增会释放出荧光信号。

荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过监测荧光信号的强度和PCR循环数，可以推导出起始模板的数量。

SYBR Green是一种无标记引物的特殊荧光染料，可以与扩增产物的双链DNA结合并发出荧光信号。

在PCR扩增反应中，SYBR Green会通过与扩增产物结合形成复合物，并发出荧光信号。

由于SYBR Green能与任意DNA结合形成复合物，所以在使用SYBR Green进行实时荧光定量PCR 时，需要进行特异性验证和内参基因的设计，以确保准确测量目标序列的数量。

在实时荧光定量PCR技术中，还需要进行标准曲线法来定量PCR产物的数量。

标准曲线法是通过制备一系列已知浓度的标准DNA模板并进行PCR反应，测量荧光信号的强度和标准DNA模板的浓度之间的关系，建立一个标准曲线。

然后，通过测量待测样品PCR反应的荧光信号强度，根据标准曲线来计算待测样品中目标序列的起始模板数量。

总结来说，实时荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、准确度和广泛应用的分子生物学技术，可以实时监测PCR反应中荧光信号的强度来确定PCR产物的数量。

它的基本原理包括使用引物和探针系统或SYBR Green 染料来检测PCR反应产物的扩增，并通过荧光信号强度和PCR循环数来推导起始模板的数量。

实时荧光定量pcr的基本原理

实时荧光定量pcr的基本原理宝子们！今天咱们来唠唠一个超酷的生物技术——实时荧光定量PCR。

这玩意儿听起来是不是有点高大上？其实呀，理解起来也没那么难啦。

PCR呢，全称是聚合酶链式反应，就像是一个基因复印机。

它能把咱们想要研究的那一小段基因，像复印机复印文件一样，不断地复制，让本来很少很少的基因变得多多的，这样咱们就好研究啦。

但是呢，普通的PCR只能告诉我们有没有这个基因，就像只知道有没有这个东西，却不知道有多少。

这时候，实时荧光定量PCR就闪亮登场啦。

实时荧光定量PCR的特别之处就在这个“荧光”和“定量”上。

咱先说说这个荧光。

想象一下，基因就像是一群小怪兽，而我们给它们身上都贴上了会发光的小标签。

这个小标签就是荧光染料或者荧光探针啦。

当PCR在复制基因的时候呢，每复制出一份新的基因，就会有一个小标签亮起来，就像小怪兽每繁殖一个就会亮起一盏小灯一样。

随着反应的进行，小灯越来越多，荧光也就越来越强啦。

那这个定量是咋回事呢？这就像是数小灯的个数来知道小怪兽有多少一样。

仪器会一直盯着这些荧光，然后根据荧光的强度来计算出最开始有多少个基因。

比如说，荧光强一点，那就说明最开始的基因数量多一些；荧光弱一点，那最开始的基因就少一些。

是不是很神奇呀？而且哦，这个实时荧光定量PCR可聪明啦。

它在反应的过程中就一直在检测荧光，不像普通的PCR要等反应结束了才知道结果。

这就好比我们做蛋糕，普通PCR是等蛋糕烤好了才知道烤得咋样，而实时荧光定量PCR呢，在烤蛋糕的过程中就一直在看，要是发现有点不对劲，马上就能调整。

这样就可以更准确地知道基因复制的情况啦。

在实际应用里，实时荧光定量PCR可帮了大忙呢。

比如说在医学上，要是怀疑一个人感染了某种病毒，就可以用这个技术来看看他身体里病毒的基因有多少。

如果病毒基因数量在增加，那就说明病毒在身体里还很活跃，得赶紧想办法治疗。

在科研上，研究人员想知道某个基因在不同环境下的表达情况，也可以用这个技术。

实时荧光定量pcr的原理和方法

实时荧光定量pcr的原理和方法实时荧光定量PCR（qPCR）是一种分子生物学技术，用于检测和定量特定DNA或RNA序列的存在和相对丰度。

它可以在短时间内快速、准确地测量目标序列的数量，并在许多领域中被广泛应用，包括基因表达分析、病原体检测和基因突变分析等。

实时荧光定量PCR的主要原理是通过放大DNA模板，并使用荧光探针或染料进行实时监测。

这些荧光探针通常是DNA寡核苷酸序列，带有一个共振能量转移对（RET pair），由一个荧光引物（donor）和另一个荧光引物（acceptor）组成。

在初始的PCR循环中，通过在高温下使DNA变性，使两个引物和DNA分离。

在下一个低温的退火步骤中，这两个引物会与DNA互补结合。

当两个引物结合到DNA模板上时，它们的荧光引物也会接近彼此，从而使共振能量转移发生，导致荧光信号减弱或消失。

这种现象被称为荧光淬灭。

当PCR循环继续进行时，每个复制周期会以指数级增加DNA模板的数量。

由于引物的结合会导致荧光淬灭，因此在每个PCR循环的末尾，荧光信号将与DNA模板的数量成正比。

实时荧光定量PCR中常用的荧光探针有探针PCR和SYBR Green。

探针PCR使用两个引物和一个荧光探针，该探针带有一个荧光团和一个辅助荧光团。

在荧光探针与DNA模板结合时，两个荧光团之间的共振能量转移会发生，导致荧光信号的减弱。

SYBR Green则是一种将DNA结合的染料，在PCR循环中，SYBR Green会与所有DNA结合，并发出荧光信号。

使用探针PCR时，可以通过测量荧光信号的减弱来确定目标DNA的存在量。

而使用SYBR Green时，可以通过测量荧光信号的增加来判断目标DNA的数量。

实时荧光定量PCR的操作过程如下：1. DNA提取和纯化：从样品中提取所需的DNA或RNA，并经过纯化处理，以去除可能干扰PCR反应的杂质。

2. 引物设计：设计适合的引物和荧光探针，以在PCR反应中特异性地扩增目标序列。

实时荧光定量PCR技术

简述实时荧光定量PCR技术1.实时荧光定量PCR技术的原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

该技术结合了实时定量PCR仪、实时荧光定量试剂、通用电脑和自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。

实时PCR的设想是由Higuchi于1992年最早提出[1]。

荧光探针技术是根据标记基团的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)原理而实现的。

当某个荧光基团的发射光谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且2个基团距离足够近时，能量可以从短波长(高能量)的荧光基团传递到长波长(低能量)的荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为FRET。

定量原理：实时荧光定量PCR是在反应体系中加入荧光基团，使产物的数量与检测到的荧光强度成线性关系，从而得出产物的扩增曲线。

理想的扩增曲线应为J型，符合2N方程(其中N为PCR的循环次数)，但实际上扩增曲线为S型。

在PCR 反应早期，不能将产生荧光的水平与背景明显区别，之后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在指数期的某一点上检测PCR产物的量，并由此推断起始模板含量[2-3]。

实时荧光定量PCR的标准扩增曲线如图1。

其中Rn+表示每点测量的荧光强度，代表反应管含有模板DNA；Rn-表示荧光基线强度，代表反应管不含有模板DNA，其在理想情况下是一条平线，只具有背景荧光数值；△Rn的值表示PCR过程中，探针降解的量，也即PCR产物的量。

基线(baseline)是背景曲线的一段，范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定，到所有反应管的荧光都将要但是还未超出背景。

图1 实时荧光定量PCR的标准扩增曲线荧光阈值(threshold)是以PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline)，荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号标准差的10倍，即：Threshold=10SD(cycle 3-15)，一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。

实时荧光定量PCR

2. SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。
实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：
1. TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收； PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。
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3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。

实时荧光定量PCR技术

Real Time PCR 原理
• 定量PCR通过Ct和初时模板量的关系进行定量。 • 同一样品的96个重复的终点荧光强度差别很大，但是Ct相同。
C(t)
Ct值的特点：终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性
Cycle
Real Time PCR 原理

模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。
THANKS
非特异性 SYBR Green I染料法
SYBR Green I与 DNA双螺旋小沟区域结合示意图
• SYBR Green I 与dsDNA结合 • SGI 与dsDNA结合后受激发荧光强度增加1000倍
• 随着产物的积累，越来越多的SGI与dsDNA 结合，
SYBR Green I作用机理示意图使得荧光信号增强.

Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作
出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。
Real Time PCR 检测方法
分别是DNA结Βιβλιοθήκη 染料法、水解探针法、分子信标法、杂交探针法、荧光引物法。

核酸染料技术代表：SYBR Green I (SGI)
荧光探针技术
代表：TaqMan probe
非特异性 SYBR Green I染料法
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下， SYBR Green I 发出微弱的荧光，但一旦与双链 DNA 结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链 DNA 数量。SYBR G reen I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为 520nm。