实时荧光定量PCR介绍

质粒
质粒提取，OD值定量。将质粒梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。
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July 25, 2013
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23
体外转录RNA标准品构建流程
目的基因
Total RNA RT
目的基因
cDNA PCR
T7 Promoter
目的基因
TTTT•••T
PCR产物
T7 RNA polymerase
发 激 射 发 光 光
Ct值
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5
Real Time PCR基础知识
1
Real Time PCR基础知识
1. Real Time PCR的用途及原理 2. Real Time PCR的检测方法
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6
Real Time PCR的检测方法
Gene Specific Primer
5’
F
目的片段
R
3’
One Step RT-PCR 只能使 用Gene Specific Primer， 但不适用于复数基因的检 出。
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15
Real Time PCR引物设计
Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同 普通PCR引物 目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚 体要求不严格。
Real Time PCR解析方法
3. 绝对定量和相对定量解析方法
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20
标准曲线制作
扩增曲线 标准曲线
105 104 3 10 2 10 1 10 0 10
105 104 103 102 101 100
• 标准品梯度的选择：5～6个梯度
• 标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为10
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21
标准品的种类
DNA样品定量标准品 RNA样品定量标准品
Total RNA & cDNA
体外转录RNA
基因组DNA 质粒
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22
质粒标准品构建流程
目的基因
基因组DNA
PCR
目的基因
目的基因克隆
目的基因
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11
SYBR Green I 法与Probe法比较
SYBR Green I 法 简便易行 价格便宜 要求反应的特异性 不能进行多重PCR
One-Step RT-PCR Probe法
特异性高
多重PCR检出
Probe设计要求高 Probe合成费用高
常用于mRNA表达量分析等
△ 引物内部或两条引物之间避免3 base以上的互补序列 △ 引物3’ 末端避免2 base以上的互补序列
使用BLAST检索，确认引物特异性 尽量在Exon junction上设计引物，限制基因组DNA扩增
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17
Real Time PCR探针设计原则
3. 绝对定量和相对定量解析方法
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30
绝对定量解析方法
提取样品
流
引物设计 标准品制备
程
Real Time PCR反应
数据分析
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绝对定量解析方法
通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度。通常应用于病 毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。
AAAA•••A AAAA•••A
体外转录RNA
RNA纯化后，测OD定量。将RNA梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。
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24
理想的标准品扩增曲线
基线平整
Negative Control为水平线
指数区较明显，陡度大
平台区汇于一起 线性范围宽
Real Time PCR用TaqMan探针设计原则
Probe长度 Tm值 序列 5’ 末端序列 互补性
特异性
★★ ★★★ ★ ★ ★★★ ★★★
20-24 bp 探针的Tm比引物高8-10℃
△ 目的序列GC含量相对较高的区域设计 △ 整体上碱基不能过偏 △ 个别部分避免GC rich或AT rich (特别是3’
（Perfect Real Time）（DRR064）
SYBR Green I
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8
SYBR Green I 法作用机理示意图
热变性
Primer
F
F
F F F
退
火
Primer
Pol.
F
F
F F F
延
伸
Primer
Pol.
F F
F
F
F
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9
TaqMan法作用机理
R
F
1,500 base
目的片段
R
5’
F
R
目的片段在mRNA任何位 3’ 置都能使用。通常mRNA 表达量分析最适。 适用于mRNA表达量分析， AAA· 3’ · · 提升反应检测的灵敏度。 Oligo dT Primer Oligo dT Primer 目的片段在距Poly(A) Tail AAA· 3’ 1.5 kbp 以内适用，RT效率 · · 较高。
检测样品
105 104 103
102
101
扩增曲线图
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检测样品
标准曲线图
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32
相对定量解析方法
进 行 相 对 表 达 量 分 析 必 要 性
Sample A
实际上目的基因表达量分析
细胞起始数相同
Sample B
RNA提取效率相同
目的基因扩增效率相同
以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正， 进行相对表达量分析。
检测灵敏度确认
35Cycles内可得到好的定量结果。 如果采用SYBR检测方法， 30Cycles内无非特异性产物扩增。
No Template Control确认
30Cycles内无引物二聚体产生。
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19
主 要 内 容
1. 标准曲线分析
3
2. 融解曲线分析
Real Time PCR引物 目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异 性反应和引物二聚体要求严格。 => 对引物设计要求严格
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16
Real Time PCR引物设计原则
扩增片段大小 Primer长度
GC含量
Tm值 序列
★ ★ ★ ★★★ ★
80-150 bp(尽量限制在300 bp以内) 17-25 base 40-60%(最好45-55%) 两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值
TaqMan探针为一寡核苷酸，
5’ 端标记一个报告基团（Reporter），
3’ 端标记一个淬灭基团（Quencher）。
R
Q
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10
TaqMan Probe法原理示意图
热变性
Primer
R
Q
退
火
Primer
Pol.
R
Q
延
伸
Primer Pol.
R
Q
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1
Real Time PCR基础知识
1. Real Time PCR的用途及原理 2. Real Time PCR的检测方法
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3
Real Time PCR的用途
Real Time PCR用途
定性分析 绝对定量 病毒及病原菌检测 物种鉴定 基因分型
定量分析
Tm值是指双链DNA分子解链一半时的温度。
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28
融解曲线分析
对PCR产物特异性进行分析
特异性产物 非特异产物
引物二聚体
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Baidu Nhomakorabea
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29
Real Time PCR解析方法
3 Real Time PCR解析方法
1. 标准曲线分析 2. 融解曲线分析
连续，A/C连续
端)；避免T/C
探针5’ 末端的第一个碱基不能是G
Probe内部或Probe与两条引物之间避免3 base以上的互补序列
BLAST检索确认Probe特异性
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18
反应性能确认
线性关系、扩增效率确认
相关系数（r2）：大于0.98 PCR扩增效率（E）：0.8-1.2
相对定量
3
Real Time PCR解析方法 ◇ 分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化 Real Time PCR应用实例
4
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35
绝对定量应用例
对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量
检测方法 TaqMan® probe 法 检测样品 3个从SARS病毒培养液中提取的Total RNA 目的基因 SARS病毒RNA 内 参 SARS Internal Control RNA 标 准 品 SARS Control RNA 试 剂 One Step PrimeScript® RT-PCR Kit
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相对定量解析方法
管家基因
维持细胞基本代谢活动所必须的基因,
如：GAPDH、β-actin等。
筛选方法
根据文献提供 通过具体实验筛选
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34
主要内容
1
Real Time PCR基础知识
绝对定量
2
Real Time PCR实验方法 ◇ 对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量分析
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宝生物工程（大连）有限公司
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主要内容
1
2 3 4
Real Time PCR基础知识
Real Time PCR实验方法 Real Time PCR解析方法 Real Time PCR应用实例
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2
Real Time PCR基础知识
SYBR Green I
荧光染料嵌合法
荧光探针法
TaqMan Probe
Cycling Probe
Molecular Beacon
etc.
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7
荧光染料嵌合法（SYBR Green I）
SYBR Green I：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的 具有绿色激发波长的染料。
△ 整体上碱基不能过偏 △ 个别部分避免GC rich或AT rich(特别是3’ 端) △ 避免T/C连续，A/G连续 △ 3’ 末端避免GC rich或AT rich
3’ 末端序列
★
△ 3’ 末端碱基最好为G 或C
△ 3’ 末端碱基尽量避免为T
互补性 特异性
RT-PCR用引物
★★★ ★★★ ★★★
常用于SNP解析，病毒、病源菌检测
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12
主要内容
2
Real Time PCR实验方法
反转录反应
Real Time PCR反应
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13
RT Primer的选择
Random Primer
Oligo dT Primer
Gene Specific Primer
Random 6mer Primer
Gene Specific Primer
Oligo dT Primer
PCR F-Primer
PCR R-Primer
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14
RT Primer的选择
Random
5’
5’
F
目的片段 Random 目的片段
相关系数
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Real Time PCR解析方法
3 Real Time PCR解析方法
1. 标准曲线分析 2. 融解曲线分析
3. 绝对定量和相对定量解析方法
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27
融解曲线分析
SYBR Green I 法进行检出时， 要根据融解曲线确认PCR产物的特异性。
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25
理想的标准曲线
相关系数（r2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。
扩增效率（E）：0.8-1.2，越接近1，越理想。
扩增效率（E）计算方法
标准曲线X轴表示起始模板浓度（log10)，Y轴表示Ct值时 E=10-1/a-1 标准曲线X轴表示Ct值，Y轴表示起始模板浓度（log10) E=10-a-1 扩增效率
相对定量
差异显示结果验证
基因芯片结果验证 siRNA效果确认 mRNA表达量分析
病毒及病原菌定量分析 导入基因拷贝数解析 GMO定量检测
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July 25, 2013
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4
Real Time PCR的原理
Real Time PCR
使用Real Time PCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。