酶谱法测定肝星状细胞合成的明胶酶活性
明胶酶谱实验方法
明胶酶谱实验72kD（MMP-2）和92kD（MMP-9）抽提缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,150 mmol/L NaCl,20 mmol/L CaCl2,1μmol/L ZnSO4,0.01% (v/v) Triton X-100,（0.5% PMSF）。
10mmol/LPMSF 溶液：取PMSF 粉末17.4mg, 加异丙醇溶解, 定容至100ml，置-20℃备用。
注意：PMSF在临提取组织时再加入，使终浓度为0.5%，配制时不加，不然易失效。
先用新鲜肾组织，蛋白量尽量加至最大。
如果按这个还做不出来，那就是你的实验技术问题了明胶酶是锌依赖的蛋白酶. EDTA是金属离子络合剂.加了就把明胶酶的锌离子络合了，完全抑制MMP的活性。
你加了这个我保证你一辈子也做不出来。
蛋白浓度一般是先摸索一个量。
就是分别上10,20,30,40,50,60,70,80,90,100ug跑一下电泳，先看结果。
条带看不见的，或者太透明的，都不能选。
就是要半明半暗的那种。
看是哪个道分解的，我们就选其中几个量上样。
(1)、5%浓缩胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液0.5ml1mol/L Tris-HCL( PH=6.8) 0.38ml10% SDS 30μl10%过硫酸铵(AP) 30μlTEMED 3μl3ml (2)、10%分离胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液 2.31ml1.5mol/l Tris-HCL(PH=8.8) 1.75ml10% SDS 70μl10%过硫酸铵(AP) 70μlTEMED 5.6μl1%明胶0.7ml7ml (3)、4×上样缓冲液（4o C保存）：0.32% Tris-HCL 6.4ml4%SDS 8ml50%甘油 3.2 ml溴酚蓝0.024gd3H2O 2.4ml20ml①wash buffer Ⅰ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg2.5% Triton X-100 12.5ml②wash buffer Ⅱ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg③incubate buffer 500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH ) 50mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg1% Triton X-100 5.0ml（五）注意事项1）孵育时间可以根据情况而定，可以延长。
酶活测定方法
、酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
肝纤维化标志物的检验
肝纤维化标志物的检验肝纤维化又称肝硬化是一种常见的慢性进行性疾病。
病理组织学上是由肝实质细胞变性坏死、间质结缔组织增生、肝细胞结节状再生、肥大等三者穿插混合而成的病理变化。
随病情发展，使肝脏小叶正常结构逐渐被改建的假小叶和肝细胞再生结节取代，肝脏终于萎缩改变。
肝纤维化的标志物通常用于判定肝内纤维组织形成的活跃状态和程度，主要有下列方法：①形态学方法，通过肝穿组织病理学检查而定；②组织生化法，用生化法测定肝组织中脯氨酰羟化酶，此酶参与不溶性胶原的形成，在酒精性肝病中随病情进展而增高；③血清中羟脯氨酸、脯氨酰羟化酶、N-乙酰-β-葡萄糖胺酶（NAG）及Ⅲ型前胶原肽（PⅢP）等测定，目前认为PⅢP最有意义。
迄今为止，常规肝功能试验尚无法诊断肝纤维化或早期肝硬化。
蛋白电泳上β-γ桥的出现对肝硬化具有特异性，但仅于肝硬化后期，且主要为酒精性肝硬化。
肝纤维化的实质是细胞外间质的结缔组织增生，其成分主要为胶原蛋白，还有各种糖蛋白和蛋白多糖等，测定血清中这些成分和其降解产物，以及参加代谢的酶有助于诊断肝纤维化。
（一）胶原及其代谢产物的测定胶原类型多种，目前认为在肝内至少有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ型，以Ⅰ和Ⅲ型为多。
早期肝硬化以Ⅲ型胶原增多为主；晚期以Ⅰ型为主。
血清透明质酸（hyaluronic acid，HA）、层黏连蛋白（laminin，即层板素）等非胶原蛋白，在肝炎后肝硬化及慢性肝血清中亦明显升高。
血清Ⅲ型前胶原氨基端肽（PⅢP）是前胶原Ⅲ（PCⅢ）在氨基肽酶作用下的水解产物，其含量能反映Ⅲ型胶原的代谢情况，可作为早期肝纤维化的一种检验指标，但其在CPH、CAH、PBC及血色素病、酒精性肝病及其他各种肝病中均有增加。
（1）测定：多用放射免疫分析法，参考值为8.9±2.0μg/L。
（2）临床价值1）测定PⅢP不仅可帮助早期诊断肝硬化，并能无损伤地观察病程演变过程，可靠地反映肝纤维化的活动性和程度，有助于判定慢性肝病的预后及观察抗纤维化药物的疗效。
肝星状细胞详解
肝星状细胞肝脏星状细胞占肝脏固有细胞总数的15%，占非实质细胞的30%左右。
HSC存在于Disse腔中，呈梭形或多边形，胞浆内有多个富含维生素A的脂滴，其细长的突起向外延伸环绕在血窦内皮细胞外面，是体内储存视黄醛衍生物的首要部位。
在正常肝脏中，星状细胞处于静止状态，不表达α平滑肌肌动蛋白（α-SMA），增殖活性低，合成胶原能力低，其主要功能是贮存视黄醛类。
中文名肝星状细胞外文名hepatic stellate cell，HSC 科室肝胆外科简介肝星状细胞是ECM的主要来源，HSC激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFC)，各种致纤维化因素均把HSC 作为最终靶细胞。
肝星状细胞激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFC)，各种致纤维化因素均把HSC作为最终靶细胞，正常情况下肝星状细胞处于静止状态。
当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，肝星状细胞被激活，其表型由静止型转变为激活型。
激活的肝星状细胞一方面通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建，另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高。
背景早在1876年，德国CarlvonKupffer在使用氯化金染色法研究肝脏的神经系统时无意中发现肝血窦周围有呈星状形态的细胞，将其命名为星状细胞（sternzellen）。
1898年，Kupffer用印度墨水对兔肝进行染色时，观察到能吞噬墨水颗粒的肝巨噬细胞，也就是后来人们为纪念Kupffer而命名的Kupffer细胞。
因为同样为星状形态，Kupffer 误把肝巨噬细胞和星状细胞混为一谈，认为星状细胞就是肝巨噬细胞。
这种观点在当时得到了广泛的认同。
直到1951年，日本学者ToshioIto通过光学显微镜发现人的肝窦周围有一种富含脂质小滴、并且有网状纤维包绕的细胞，并将之命名为伊东细胞（ItoCel1s）或贮脂细胞（fat-storingcells）。
1958年，Suzuki用银染色法在Disse腔内观察到这种星芒状的细胞，发现其突起与肝脏内的自主神经末梢相连系，他认为这种细胞能将来自肝内自主神经的冲动传递给肝实质细胞，并将其称为“间质细胞”；1966年，Bronfenmajor证实了伊东细胞的发现，又给该细胞起新名叫脂细胞（1ipocytes）；1971年，KenjiroWake采用电镜，结合氯化金染色法和苏丹红染色法发现Ito所描述的伊东细胞和Kupffer所发现的星状细胞原来是同一类型的细胞，并指出上述细胞既不同于肝窦内皮细胞，也不是肝内的巨噬细胞。
肝纤维化讲解
ECM旳构成及主要功能
构成：蛋白质（胶原、弹力纤维）、糖蛋白 及蛋白多糖
功能：
1、支撑及维持组织构造、形态与修复 2、细胞接触面及半选择性弥散屏障 3、调整细胞分化、增殖、移行及信息传递 4、参加调整微循环、代谢及免疫反应
ECM 旳胶原蛋白质
间质性胶原（纤维形成胶原）： I、III型：为肝内主要胶原成份，各占33%，I / III百分比为1:1；
非创伤性诊疗 创伤性诊疗
组织病理学诊疗
肝活检标本组织学检验是纤维化诊疗旳金原则 常规组织形态学评估 特殊旳组织学检验 肝纤维化组织学半定量评估系统 计算机图像分析系统
几种肝纤维化分期半定量评估系统
评分 Knodell
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0
无纤维化
无纤维化
无纤维化
1
汇管区扩大 有些PF±短纤维隔
V型：分布于血窦周围和门脉区，作为关键使I、III型胶原形 成粗大旳纤维；
VI型：分布于I、III、V型胶原形成旳纤维素之间起粘附作用； 基底膜胶原（非纤维形成胶原）：
IV型：主要分布于肝血窦内皮下，是肝细胞和内皮细胞功 能性基底膜旳主要成份；
ECM 旳非胶原糖蛋白
纤维连接素（FN)：在肝纤维化早期时增多，作为后来胶原 沉积旳支架；
TGFß1在肝纤维化形成所起旳中心作用
刺激ECM合成 增长I、III、IV型胶原、 FN 诱致HSC合成胶原 调整细胞增生 克制HSC增生，但刺激其转化
克制基质降解 降低MMPS合成 增长TIMPS旳合成并调整本身活性型旳变化
受体体现增强 TGFβ辅助受体合成↑
刺激其他生长因子受体（PDGF、TGFα）体现↑及整合素家族受体↑
参加肝纤维化旳细胞成份
肝纤维化的分子机制及治疗方法研究
胞生长 因子 信号通路激活 内源性 Ｐ Ｐ Ａ Ｒ 一＾ ｙ基 因表达 ，进而抑制 ｄ— Ｓ ＭＡ、Ｔ Ｇ Ｆ —Ｂ 和 ＭＣ Ｐ — ｌ 的表达起抗纤维化 的作用 。 尽 管有大量 的药物 有抗纤维 化的作 用 ，但它们 有各 自的局 限和副作用 。因此 ，寻找 能够起 到抗 肝纤 维化作用 且副作 用较
骨髓 来源 细胞和上 皮 间充 质组织 的异常堆 积 ，均可使 肝脏细 胞 模 ，使用单 克隆抗体免疫组织化学染色 ，结果显示 Ｎ 一二 甲基亚 外 基质增 加 ，而胶 原降解 下降 。从 长远来看 ，其可 能导致肝 硬
化及 相关并发症 ，也可 能有 致癌作用 ，引起肝脏 正常功能丧失 ， 最终导致 死亡 ｌ １ ］ 。本 文综述 了关 于肝纤 维化 的分子机 制及其 对 某些生化 指标 的影响 和抗 纤维化 物质 的研 究 ，以讨 论阻止 或逆
的研究结果显示存在大量 的植物衍生物可 阻止甚 至逆转肝纤维 化的过程 ， 具 体有 效地阻止或逆转肝纤维化的策略将成为未来研究 的重点 。
【 关键词 】 肝纤维化 ； 生化异 常； 基 因疗法 ； 抗纤 维化 策略
中图分类号 Ｒ ５ ７ ５ 文献标 识码 Ａ 文章编号 １ ６ ７ ４ — ６ ８ ０ ５ （ ２ ０ １ ４ ） ６ — ０ １ ６ ２ — ０ ３
综
述 Ｚ ｏ ｎ ｇ ｓ ｈ ｕ 《 中 外医 学 研究》 第１ ２ 卷 第６ 期（ 总 第２ ３ ０ ） ２ ０ １ ４ ２ 月
肝 纤维化 的分子机 制及治疗方 法研 究
孙 吉① 李静静②
【 摘要 】 肝纤维 化是 一个渐进性过程 ，由纤 维结 缔组织过度增殖和积 聚形 成。肝纤维化过程异 常复杂 ，了解其分子机制就 显得 尤为重要 引起肝脏 内结缔 组织增 生 出现异
肝星状细胞与肝纤维化关系研究进展
肝星状细胞与肝纤维化关系研究进展李伟琴;徐光华;袁致海【摘要】在世界范围内,有数千万肝纤维化患者,这些患者可能最终发展为肝硬化,肝衰竭而死亡。
虽然在此领域的研究已经取得了长足的进展,但是由于肝纤维化的发生机制的复杂性,仍然没有十分有效的治疗办法。
现在越来越多的临床及实验证明,肝纤维化是可以逆转的,在Safad i等[1]研究中亦表明:肝纤维化在去除损伤因素后尚有逆转的可能。
肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)的激活是肝纤维化形成的中心环节,HSC在肝纤维化形成,及逆转过程的作用也成为研究热点之一。
目前[2]认为激活的HSC有两个去向:(1)由激活态转变回静止态;(2)发生凋亡而死亡。
且大多数研究表明,活化的HSC主要通过凋亡途径消除,是纤维化消退的主要机制。
这也就使HSC与肝纤维化的发生机制与治疗方面有密切关系。
1 HSCHSC是1996年为纪念德国学者Kuffer的贡献采用了Sterzellen的英译名Stellate cells(星状细胞)而得名[3]。
该细胞又名贮脂细胞,Ito细胞,窦周细胞等,位于肝内窦周间隙,既D isse腔隙,约占肝内细胞总数的5%~15%,其分布广泛,形态不规则,常伸出数个星状突起,胞质内有1~14个直径约2·0...【期刊名称】《延安大学学报（医学科学版）》【年(卷),期】2009(007)001【总页数】3页(P7-9)【作者】李伟琴;徐光华;袁致海【作者单位】延安大学附属医院感染科,陕西,延安,716000;延安大学附属医院感染科,陕西,延安,716000;长安友谊医院,陕西,长安,710118【正文语种】中文【中图分类】R5在世界范围内，有数千万肝纤维化患者，这些患者可能最终发展为肝硬化，肝衰竭而死亡。
虽然在此领域的研究已经取得了长足的进展，但是由于肝纤维化的发生机制的复杂性，仍然没有十分有效的治疗办法。
现在越来越多的临床及实验证明，肝纤维化是可以逆转的，在 Safadi等［1］研究中亦表明：肝纤维化在去除损伤因素后尚有逆转的可能。
肝星状细胞与肝纤维化
肝星状细胞与肝纤维化唐桂连【摘要】肝纤维化是各种慢性肝病共有的病理改变,逆转肝纤维化可阻止大多数慢性肝病进展.肝星状细胞(HSC)是肝内一种具有多功能、变化不定的非实质细胞,HSC活化是肝纤维化发生的中心环节.阐明其关系,有助于以HSC为靶点的肝纤维化方面的研究.【期刊名称】《国际消化病杂志》【年(卷),期】2012(032)005【总页数】4页(P270-273)【关键词】肝星状细胞;活化;肝纤维化【作者】唐桂连【作者单位】524008,广东海洋大学医院【正文语种】中文肝纤维化是肝脏对慢性损伤的修复反应，是各种慢性肝病共有的病理改变，以胶原等细胞外基质(ECM)在肝脏过度沉积为特征，属可逆病变。
晚期肝纤维化可导致肝硬化、门脉高压和肝功能衰竭[1]。
研究证实，HSC是ECM的主要来源，HSC激活并转化为肌成纤维细胞样细胞是肝纤维化(HF)发生、发展的核心环节。
各种致纤维化因素均把HSC作为最终靶细胞，通过使其转化为肌成纤维细胞这一共同复杂的网络系统，参与HF的发生及进展[2]。
现就HSC与HF的关系作一综述。
1 肝纤维化的发生与逆转肝纤维化的发生与逆转主要是ECM的产生、堆积及降解的过程。
在正常的肝脏中存在一层薄的、低密度的基底膜，在肝纤维化的发生过程中，一系列的酶，包括锌依赖的基质金属蛋白酶(MMP)与其抑制因子(TIMP)和一些逆转酶发生数量及功能的改变，导致ECM的数量及构成发生变化，正常的降解过程受到抑制，最终导致过多的不溶性基质堆积在肝脏中，引起肝脏发生结构的改变，并引起相应的功能异常，在失去肝脏自身代偿的情况下，形成肝纤维化甚至肝硬化。
HSC是肝损伤时生成细胞外基质的主要细胞来源，在20世纪80年代作为产生细胞外基质的主细胞并命名。
在四氯化碳(CCl4)、铁负荷及胆道阻塞诱导的肝纤维化模型中都得到了相似的证据，即HSC作为产生ECM的主要细胞在肝纤维化发生、发展中的机制中发挥了重要作用。
明胶酶谱法
明胶酶谱法的定义和步骤
明胶酶谱法是一种常用于检测和定量分析细菌或其他微生物产生的明胶酶活性的实验方法。
明胶酶谱法通过将待测菌株培养在含有明胶的琼脂培养基上，并利用其产生的明胶酶在琼脂中形成透明带区来检测明胶酶活性的存在和水平。
明胶酶谱法的具体实验步骤如下：
1. 准备明胶琼脂板：将明胶溶液加入琼脂培养基中，制备明胶琼脂板；
2. 菌株预处理：将待测菌株培养在适当的富含明胶的培养基上；
3. 制备样品：将培养的菌液离心，收集上清液，加入样品缓冲液中；
4. 蛋白电泳：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶电泳胶中，利用电场将蛋白质分离；
5. 明胶酶活性检测：将电泳胶浸泡在明胶酶活性染色剂中，在适当温度下孵育一段时间；
6. 显色和成像：将染色剂去除，并在电泳胶上观察到明显的透明带区，表示明胶酶活性的存在和水平。
通过明胶酶谱法，可以确定菌株是否产生明胶酶及其活性的强弱。
这种方法简单易行，并能够提供定性和半定量的结果。
这种方法在微生物学研究和临床诊断中得到广泛应用，尤其对细菌感染的相关研究具有重要意义。
明胶酶谱法
明胶酶谱法明胶酶谱法是一种新型的蛋白质分析方法，它可以提供准确准确的蛋白质质量分析和分子量分析结果。
明胶酶谱法可以快速有效地测定蛋白质中的氨基酸和糖基化激酶的活性。
这种方法通过使用蛋白质，核酸和其他复合物构成的聚合物，结合相关的酶诱发反应，来分析蛋白质的质量和分子量。
这些复合物可以在单独的氨基酸片段中用来测量激酶反应，从而识别活性位点，反映了蛋白质质量和分子量分析的结果。
明胶酶谱法的原理是基于胶质酶结合物，它由多种蛋白质，核酸和其他复合物组成，使用酶诱发反应来分析蛋白质的质量和分子量。
该方法由激酶和聚合物组成，它们分别催化了激酶和聚合物的反应，从而产生了激酶的活性。
此外，该方法还能够测量氨基酸片段的活性，这将有助于评估蛋白质的质量和分子量。
明胶酶谱法的应用可以追踪物质的合成和分解的变化，从而发现蛋白质结构及其功能的改变。
它可以用来研究蛋白质结合位点分布、激动酶及蛋白质与酶类分子识别蛋白质、以及酶促反应的参与者等，这些结果将有助于改善蛋白质的性能，这将有助于提高药物的疗效和安全性，以及有效防止药物毒性事件的发生。
明胶酶谱法在蛋白质质量和分子量分析方面具有优越性。
它可以快速有效地识别活性位点，由此提供了精确的蛋白质质量和分子量的分析结果。
同时，该方法可以提供有效的数据，可以评估蛋白质的功能和结构。
它还可以用来研究药物及其代谢物的代谢，改善药物的性能和安全性，以及有效防止药物毒性事件的发生。
由此可见，明胶酶谱法已成为药物研究和分析的一种重要的手段。
明胶酶谱法的应用可以提供准确的蛋白质质量和分子量分析结果，从而有助于研究者分析蛋白质的功能和结构，并改善药物的性能和安全性。
明胶酶谱法是一种有效的、快速的、有精度的、具有易操作性的蛋白质质量和分子量分析方法，因此它已经成为药物研究和分析的一种重要手段。
肝脏纤维化检测方法及应用
肝脏纤维化检测方法及应用肝纤维化是各种慢性肝病损伤修复过程的共同后果，在肝细胞性功能障碍和门静脉性高压的发病机制中起直接作用。
同时，肝纤维化、甚至早期肝硬化具有可逆性已成为共识。
因此早期诊断和正确评估肝纤维化程度显得十分重要。
相对于肝穿刺，利用血清学指标评价肝纤维化具有无创、无风险、可多次测定降低偶然误差等优点。
目前血清学指标包括间接指标，如临床最常应用的血常规、肝功能以及凝血酶原时间（PT）等；直接指标，如细胞外基质（ECM）成分及其裂解物包括透明质酸（HA）、层黏蛋白（LN）、Ⅳ型胶原（Ⅳ-C）和Ⅲ型前胶原氨基末端肽（PⅢNP）等。
综合多项有价值的无创指标构建诊断模型，可提高诊断准确度。
本节主要介绍直接指标的检测方法。
目前临床常用的直接指标检测法均是基于免疫学技术，包括单抗原抗体包被和酶标记抗体的三步法、双表位抗体酶免一步法、时间分辨和放免法等方法。
由于环境的污染和辐射损伤，放免法基本被淘汰；时间分辨方法需专门的仪器；酶免多步法由于采用单表位抗体包被与标记，敏感性和特异性与双抗原表位抗体的一步法没有优势，并且操作步骤复杂，故本文只介绍酶免一步法。
一、Ⅲ型前胶原氨基端肽（一）原理用纯化的Ⅲ型前胶原（procollagenⅢ，PCⅢ）制备抗血清，包被反应板，在加入样本后，样本中PCⅢ与抗血清结合，洗板后加入指示酶，通过与标准品比对显色深浅程度，测定血清中PCⅢ浓度。
（二）试剂组成PCⅢ包被板；PCⅢ标准品（2000ng/ml）及其稀释液；PCⅢ酶结合物；洗涤缓冲液10ml，使用前用蒸馏水20倍稀释；底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）缓冲液；反应终止液。
（三）操作步骤1.试剂准备按样本数量需求，提前半小时将试剂盒从冰箱中取出，平衡至室温使用。
2.标准品在酶标板孔中按A1～A8或A1～H1的顺序加入标准品稀释液100μl，取100μl标准品，按照酶标仪定量格式要求自高到低依次进行倍比稀释。
肝星状细胞在肝纤维化治疗中的研究进展
１
１．１
ＨＳＣ ＨＳＣ的概况 ＨＳＣ是１９９６年为纪念德国学者Ｋｕｆｆｃｒ的贡献采用了
于炎症受损区。ＰＤＧＦ受体的表达上调导致ＰＤＧＦ的自分泌增 加，引发信号传导系统的下游的ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、Ｐ１３Ｋ及ＳＴＡＴ的活 化，进一步促进ＨＳＣ的增殖。ＨＳＣ既是ＰＤＧＦ的产生细胞，又是 ＰＤＧＦ作用的靶细胞，由此可形成一个正反馈放大效应，进一步 激活ＨＳＣ，使ＨＳＣ的增殖、活化得以持续。 （２）细胞因子的释放：自分泌的细胞因子在调解ＨＳＣ的活 化中发挥了重要作用。这些细胞因子包括ＴＧＦ－Ｂ １、ＰＤＧＦ、成 纤维生长因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ
ＴＧＦ Ｂ
ＨＳＣ的凋亡
目前研究认为活化的ＨＳＣ有两个去向：（１）激活态变同静止 态；（２）发生细胞凋亡而死亡。大多数研究表明，活化的ＨＳＣ主要 通过凋亡途径消除，是肝纤维化消退的主要机制。 ＨＳＣ凋亡主要通过死亡因子Ｆａｓ（ＡＰＯ一１／ＣＤ９５）及其配体 ＦａｓＬ介导的信号传导途径。Ｆ鹊是死亡受体超家族成员之一，当 它和相应配体（ＦａｓＬ或阻抑抗体）结合后呈激活状态，启动凋亡。 Ｌａｎｇ等｜Ｉｌｌ研究了ＴＮＦ－ｄ对ＨＳＣ凋亡的介导作用，结果表明， ＴＮＦ—Ｏｔ对激活的ＨＳＣ可产生凋亡诱导作用，此作用可被转录因 子ＮＦ—Ｋ Ｂ所鞋Ｉ断，而ＮＦ＿Ｋ Ｂ对肝脏再生及炎症反应均有调节 作用。核因子ＮＦ—Ｋ Ｂ能抑制多种类型的细胞凋亡。它的上调可 导致靶基冈的大量激活，ＮＦ＿Ｋ Ｂ通过调控靶基因的转录参与了 ＨＳＣ的激活１１２１。 ＴＩＭＰ－Ｉ是一种多功能蛋白质，可抑制ＥＣＭ的降解，促进纤
肝星状细胞激活为基础的各种手段的综合运用刚。阒此，以肝星
状细胞作治疗标靶的理念转变将为摆脱多年来肝纤维化临床处 理的困境带来希望。 本文以下就肝星状细胞及其在肝纤维化发生中的作用，及 某些抗肝纤维化治疗的进展作一综述。
成纤维细胞活化蛋白(FAP)的研究进展
成纤维细胞活化蛋白（FAP）的研究进展?1866?(59—464.[24]KumsawaM,NumazawaS,TaniY,eta1.ERKsignalingmedi. atestheinductionofinflammatoryeytokinesbybufalininhumanmonoeyticceUs[J].AmJPhysiolCellPhysiol,2000,278(3):C50o一508.[25]JingY,WatabeM,HashimotoS,eta1.Cellcyclearrestandpm. teinkinasemodulatingeffectofbufalinonhumanleukemiaML1cells[J].AntlcaneerRes,1994,14(3A):1193—1198.[26]LiuY,Qux,WangP.WT1downregulationduringK562cell MODERNONCOLOGY,Sep.2010.VOI.18,NO.09 differentiationandapoptosisinducedbybufalin[J].ZhonghaaXueYeXueZaZhi,2002,23(7):356—359.[27]AmanoY,ChoY,MatsunawaM,eta1.Increasednuclearexpres—sionandtransaetivafionofvitaminDreceptorbythecardiotonic steroidbufalininhumanmyeloidleukemiacells[J].JSteroidBiochemMolBiol,2009,114(3—5):144—151.[28]LeeDY,YasudaM,YamamotoT,eta1.Bufalininhibitsendo- thelialcellproliferationandangiogenesisinvitro[J].LifeSei,1997,6O(2):127—134.(编校:何蛛)成纤维细胞活化蛋白(FAP)的研究进展张红霞,郭佑民ResearchprogressinfibroblastactivationproteinzHANGHong—xia.GUOYou—minDepartmentofRadiology,BengChaoyangHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100020,China.【Abstract】Fibroblastactivationprotein(FAP),asurfaceantigenespeciallyexpressedoncarcinomaass ociatedfi—broblasts(CAFs),itisallintegralmembraneserinepeptidase,amemberofthegroupofIIinteg ralserineproteases, whichhasbeenshowntohavedipeptidylpeptidaseandgelatinaseactivity.FAPhasadualfunc tionintumourpro-gression.TheproteolytieactivicyofFAPhasbeenshowntopromotecellinvasivenesstoward stheECMandalsotosupporttumourgrowthandproliferation.OverexpressionofFAPonCAFsanditsspecialend opeptidaseactivityre—presentapotentialtargetfordiagnosisandtreatmentofvariouscarcinomas,makingitfeasible tobeappliedinmolec—ularimaging,oncogenetherapyandimmunotherapyoftargetingtumorceHs.Aseriesofstudi esinvolvingFAPstruc—ture,enzymeactivities,clinicalsignificanceandsoonweresummarized.【Keywords】cancer;fibroblastactivationprotein;carcinomaassociatedfibroblasts ModernOncology2010,18(09):1866—1869【指示性摘要】成纤维细胞活化蛋白(FibroblastActivationProtein,FAP)存在于肿瘤基质成纤维细胞中,在细胞表面发挥作用,是一种膜丝氨酸肽酶,是II型丝氨酸蛋白酶家族成员之一,具有二肽肽酶及胶原酶活性,在肿瘤的生长中具有双重功能.FAP的蛋白水解酶活性可以增强肿瘤细胞对细胞外基质的侵袭力,同样也能促进肿瘤的生长和增殖.故以FAP作为靶点的分子成像以及作为肿瘤基质标志物的病理诊断,肿瘤基因治疗或免疫治疗将成为可能.近年来对FAP的研究进展进行如下综述.【关键词】肿瘤;JE纤维细胞活化蛋白;成纤维细胞【中图分类号】R730.3【文献标识码】ADOI:10.3969/j.issn.1672—4992.2010.09.76 【文章编号】1672—4992一(2010)09—1866一o4【收稿日期】【修回日期】【基金项目】【作者单位1【作者简介】【通讯作者】2010一O1—2620lO—o5—20国家自然科学基金资助项目(编号:30900364);北京市科技计划重大项目(编号:~340]010);北京市教育委员会科技计划面上项目(编号:350010920126)首都医科大学附属北京朝阳医院放射科,北京lOOO20张红霞(1985一),河南濮阳人,住院医师,硕士,主要从事肿瘤分子影像学研究.郭佑民(1955一),男,陕西西安人,主任医师,博士生导师,主要从事肿瘤分子影像学研究.E—mail:cjr.guoyoumin@vip.163.eom1研究背景FAP,曾被认为是F19细胞表面抗原,是一种可诱导的细胞表面糖蛋白,它最初是在1986年用单克隆抗体FI9在培养的成纤维细胞中发现的.1994年,F19细胞表面抗原被命名为成纤维细胞活化蛋白(FAP).1990年,一个分子量为170kDa的胶原酶在人类的恶性黑色素瘤细胞株LOX中被识别.1994年,这个170kDa的胶原酶被命名为Seprase.对FAP和Seprase的分子克隆研究发现它们是同一种细胞表面丝氨酸蛋白酶,基因定位于2q23[1I2].为了使本综述清晰,明了,本文将自始至终用FAP来表示这种蛋白酶.2FAP的结构特征和酶特性2.1结构特征现代肿瘤医学2010年09月第1鲞箍具有活性的FAP是一个170kDa的同型二聚体,包括97kDa的两个N末端糖基化的亚单位,(GenBankGI 1888316)一种Ⅱ型穿膜糖蛋白具有一个大的C末端胞外区域.FAP有5个潜在的N一糖基化位点,l3个半胱氨酸残基,3个高度保守的丝氨酸蛋白酶催化区域,一个疏水的跨膜片段和一个小的胞质尾区(6个氨基酸).另外一些研究发现了FAP的血清形式J,溶解形式抗血纤维蛋白酶(Anti—plasminCleavingEnzyme,APCE)[51,FAP的胞外晶体结构. FAP每个亚单位包括:B一螺旋结构区域(氨基酸序列54—492)和a/t3水解酶区域(氨基酸序列27—53和493—760).FAp的催化区域暴露于细胞外环境中,该区域包括起催化作用的丝氨酸($624),它与Asp702和His734组成了催化三联体.FAP保守的丝氨酸蛋白酶基序是G—w—S—Y—G_1].催化三联体定位在13,螺旋结构和B水解酶区域的交界面,它的排列顺序是亲核一酸一基底,是p水解酶区域的特征.这个催化区域是由基本平行的B片通过各个面上的单环连接,围绕着腹侧轨道呈螺旋放射状排列.具有8片"桨叶"的8螺旋结构位于催化三联体的顶端可能对蛋白底物起着"催化门"的作用』.FAP的晶体结构有5个可能的糖基化位点分别定位在天门冬氨酸49,92,227,314和679.4个位于B螺旋结构区,1个位于水解酶区J.糖基化形式使FAP同时有二肽肽酶活性和胶原酶活性,非糖基化形式则无此活性….FAP的活性由亚单位组成的二聚体形式决定,单体无活性.FAP的基因组在几种物种中发现.比如小鼠类及非洲爪蛙类.对于小鼠类的研究在组织中发现了选择剪接和3个特殊的FAP剪接变异体.一个选择性的FAP剪接体在人类的黑色素瘤细胞株LOX中发现,它编码了一个异常的缩短的变异体.剪接变体编码了一个有239个氨基酸分子量为27kDa的多肽,突变型与野生型的FAP的C末端催化区域重叠.FAP的C末端催化区域在不同物种问是高度同源的.2.2酶特性FAP属于转膜丝氨酸肽酶(serineintegralmembrane peptidases,SIMPs)小家族.FAP与二肽肽酶家族成员DPPIV (DPPIV,dipeptidylpeptidaseIV/CD26)具有52%的同源性,同属于S9b肽酶家族(脯氨酰多肽肽酶家族).FAP因此被认为是DPPIV相似基因家族的一员L9].FAP具有两种蛋白水解酶活性.首先是胶原酶活性,其次是二肽肽酶活性【】.FAP的酶活性被活性位点丝氨酸($624)介导,酶谱法分析酶底物特异性,发现FAP可以降解明胶和热的变性的I型胶原和IV型胶原但不能水解层粘连蛋白,纤维结合蛋白,纤维蛋白单体及酪蛋白….DPPIV不具有胶原酶活性,因此可用是否有胶原酶活性鉴别FAP和DPPIV…J.3FAP的组织分布FAP表达于90%以上的上皮性肿瘤的基质成纤维细胞的胞膜和胞浆中,包括结肠癌,乳腺癌,卵巢癌,膀胱癌,肺癌(原发的和转移的)D23,同时可短暂的停留于某些正常胎儿问质组织中,持续存在于上皮性肿瘤和一些肉瘤的活化基质中,也可表达于胃癌间质,一部分骨和软组织肉瘤细胞,伤口愈合的肉芽组织,特发性肺纤维化的损伤间质,慢性丙型肝炎病人的肝实质细胞,胰腺细胞,前列腺癌,甲状腺髓样癌和乳头状癌,Crohng病组织的狭窄部位,口腔鳞状细胞癌间质.1867?成纤维细胞中.FAP阳性的细胞靠近肿瘤毛细血管的内皮细胞并围绕着肿瘤结节,但在正常成人的组织,良性和癌前病变的上皮性损伤中通常不表达.4FAP的病理作用FAP的活性与许多恶性转化细胞的侵袭行为密切相关,但是它在恶性肿瘤细胞中的作用有不同的观点.4.1肿瘤抑制作用Wesley等¨朝研究显示正常人的黑色素细胞进展为恶性黑色素瘤时丧失了DPPIV的表达.DPPIV的重新表达使小鼠黑色素瘤细胞转化为高分化的正常表型并恢复了依赖外源性生长因子的表达,并发现即使是催化的非活化突变体DPPIV的表达也可导致依赖外源性生长因子的恢复;该研究小组认为内源性FAP的表达对突变体DPPIV的表达起协助诱导作用.Montagut等研究发现FAP的表达降低了小鼠恶性黑色素瘤细胞在动物体内的致肿瘤性,并且修复了接触抑制和生长因子依赖,并发现催化的突变型FAP在缺乏活化的蛋白酶活性的情况下对肿瘤起抑制作用,DPPIV的表达可诱导FAP的表达,反之,FAP并不诱导DPPIV的表达.因此,推论野生型和突变型FAP的肿瘤抑制活性很有可能是FAP的固有本能.4.2肿瘤促进作用更多的研究认为FAP有肿瘤促进作用.Goodman等FAP的人乳腺癌细胞株实验表明,该细胞株(MDA—MB一435和MDA—MB一436)正常的表达FAP,有高水平FAP表达的乳腺癌细胞较少依赖外源性的血清生长因子,并可从正常的生长调控中获得独立.从正常的生长调控中独立出来这是恶性细胞区别于正常细胞的重要特性.Huang等.'研究小组实验证明人类乳腺癌细胞株MDA—MB～231缺乏正常的FAP的表达,FAP高表达的鼠肿瘤模型肿瘤生长的更快更富有血管.还发现当细胞在体外生长时表达FAP的细胞生长率和那些不表达FAP的细胞一样.这表明FAP只有在体内乳房脂肪垫的微环境才表现显着的肿瘤促进作用.这项研究是证明FAP的血管源性功能的首个证据,可以得出结论即,FAP至少部分促进乳腺癌的血管生成,Aimes等ⅢJ 研究证明也印证了这个结论:FAPmRNA表达上调导致了上皮细胞重建或者血管形成.这些发现说明了FAP的表达有利改变乳腺癌细胞的微环境.Wang等也发现当鼠角膜中出现新生血管,角膜基质中的多种生化因子发生变化. FAP(+)的角膜细胞出现在基质中,新出现的这些细胞同时伴随着在新生血管内皮细胞的生长.再次证明了FAP的血管源性功能.小鼠的FAP转染HEK293人胚肾细胞实验显示:将同等数量转染FAP的HEK293细胞和非转染HEK293 细胞同时接种到重症免疫缺陷小鼠体内,前者肿瘤发生率比后者高2—4倍,潜伏期比后者短1O～15天,肿瘤生长率比后者提高10—40倍.用HT229肿瘤中FAP的提取物免疫兔子所产生的多克隆抗FAP抗体,可以有效抑制HT229肿瘤生长,这都说明FAP能够促进肿瘤的发生及生长n.Wang等发现过度表达FAP的人肝星形细胞LX一2细胞系,增加了细胞粘附性,转移性和侵袭性,还发现FAP的蛋白水解活性对于这些功能来说并不重要,这些研究结果进一步支持了FAP的前体纤维生成的作用,即FAP也具有重要的非酶功能.?1868?FAP和DPPIV可以形成一个复合物定位于胶原纤维成纤维细胞的表面,该复合物在细胞侵袭中有溶解明胶与明胶结合的活性,可促进细胞迁移].FAP一尿激酶型纤溶酶活化因子受体(plasminogenactivatorreceptor,uPAR)膜复合物在肿瘤侵袭中有协同作用.在模型系统中,与受体结合的uPA有活性抑制作用并限制了转移灶的形成】.因此, FAP可能是抗转移治疗的潜在靶点.在星形细胞癌中,FAP的表达是与WHO分级相关的,随着FAP表达的增加,在肿瘤组织中所有的与DPPIV相似的酶活性也增加.在结肠癌中,肿瘤的分期及体积与FAP的表达呈正相关,提示FAP的表达在肿瘤早期的发展中具有重要作用,FAP高表达的肿瘤更易扩散,因此FAP被认为是早期肿瘤的潜在治疗靶点J.在化生,非典型的食管组织和食管癌组织的FAP的表达量与食管肿瘤进展相关J. FAP在胰腺癌中高表达,肿瘤发生时达到高值.越高的FAP 表达量预示着越差的预后J.从这些研究发现FAP的活性促进了肿瘤的生长并对肿瘤的侵袭,转移起到了一定作用. FAP是肿瘤生长和转移的一个重要调节因子.4.3其他作用FAP是潜在性的判断伤口时间的有效标志物,一SMA (alpha—smoothmuscleactin)则是判断刀割伤中晚期时间的有效标志物.联合应用FAP和—SMA是潜在的可靠判断伤口时间的指标.存在于类风湿和半恶性肿瘤基质中的FAP介导了和类风湿性慢性滑膜炎中的肿瘤样组织形成.FAP和DPP～4/CD26这些丝氨酸蛋白酶在防止类风湿滑囊液纤维化从而保护关节软骨方面扮演着重要角色驯.5FAP的信号系统的破坏目前用于肿瘤免疫治疗的抗原靶位正在研究之中,该抗原靶位选择性表达于肿瘤间质成纤维细胞或毛细血管上皮细胞.通过靶向作用阻止肿瘤的基质源性及血管源性供养.FAP的缺失间接抑制肿瘤细胞的增殖,加快胶原的积累,减少肌成纤维细胞成分,降低肿瘤内血管密度.因此FAP是肿瘤靶向治疗的重要靶点.Garin—Chesa等指出与毒素结合的单克隆抗体或炎性单克隆抗体同种型显示在FAP阳性的肿瘤间质中,它的作用是诱导细胞损伤,导致肿瘤细胞坏死和炎性细胞浸润.补充添加了FAP阳性的成纤维细胞将会更新目标细胞数量并帮助纤维囊包裹和分离上皮性肿瘤细胞.将抗体定位于肿瘤问质减少了免疫逃逸的发生率.从遗传上讲,肿瘤间质中的细胞更稳定是个有希望作为肿瘤免疫治疗的靶向细胞.Loeffler等发现肿瘤问质抗原FAP能提供新的抗肿瘤疫苗靶位,尤其是联合化疗一起使用,肿瘤相关的成纤维细胞是I型胶原的重要来源,I型胶原可以降低肿瘤对化疗药的吸收并调控肿瘤对化疗药敏感性.该研究小组制作了一种口服的针对FAP靶点的DNA疫苗,在鼠类结肠癌和乳腺癌模型中,这个疫苗成功的抑制了主要肿瘤细胞的增殖和转移灶的多重耐药.而且接种了FAP疫苗鼠类的肿瘤组织显示,I型胶原在肿瘤组织中的表达被抑制, 肿瘤组织吸收的化疗药增长了70%.最重要的是接种了FAP疫苗的鼠类接受化疗治疗后生命延长了30%并显着地抑制了肿瘤的增殖,约50%的动物完全抵抗了肿瘤的侵蚀, 并且这个DNA疫苗没有阻碍创伤的愈合或损伤正常组织. MODERNONCOLOGY,Set).2010.VOI.18.N0.O9在靶向诊治方面,Lebeau『3等发现瘤内注射激活的FAP强亲和毒素,可显着地增加对人乳腺癌及前列腺癌的抑制作用,并在动物体的毒性试验证明其不良作用非常小.Adams 等发现一种小的FAP抑制剂,叫做Val—bom—Pro(PT100),通过一个大样本的大鼠肿瘤模型实验发现其可减弱和抑制肿瘤生长.Pui—Chi等口发现了一种新的FAP触发的光动力学分子探针(FAP—triggeredphotodynamicmolec. ularbeacon,FAP—PPB)由一种荧光敏感剂和一种黑洞猝灭剂3通过连接一种FAP特异性肽序列组成.FAP—PPB可被人和鼠的FAP裂解.用HEK293转染细胞(HEK—In FAP,FAP+,HEK—Vector,FAP一),经过系统的体内外实验分别证明在肿瘤细胞和小鼠的异种移植体中FAP—PPB 的FAP特异性活性.在有FAP表达的细胞可出现荧光修复,没有FAP表达的细胞不会出现这种情况.在HEK—in FAP细胞,FAP—PPB显示了FAP特异的光细胞毒性,然而在对照组HEK—Vector细胞中没有出现细胞毒性.这个实验说明了FAP—PPB是一个潜在的上皮性肿瘤的诊治的工具.6结论与展望自从1986年发现FAP,迄今在定位和表达这个蛋白酶上面做了大量的科学研究.然而FAP的生化特性和功能需要进一步研究.尽管大量的研究报告指出这个酶可能有的功能,但是FAP的生理学作用还是没有解释清楚.FAP在肿瘤细胞中通过降解细胞外物质,在侵袭和转移中扮演了重要的角色.FAP与90%的上皮细胞癌有关系,还是潜在的对疾病有预示作用的重要标志物.因此FAP可以作为肿瘤体内免疫诊治较有前途的靶分子.有效率的标准的在体内和体外都适用的FAP抑制剂的出现为FAP生理作用的研究打开了一扇门.FAP的调节功能也许是可以在不同等级上操纵的,基因的,后转录的和激素的,可是相关机制和调控方法还不知道.未来在这个领域的研究将会提供FAP的全面信息, 这些信息包括调控方式和生理功能.这样FAP作为选择性抗肿瘤诊治的靶点将成为可能.参考文献[1]MLPineim—Sanchez,LAGoldstein,JDodt,eta1.Identificationofthe170一kDamelanomamembrane—boundgelatinasefse—prase)asaserineintegralmembranepmtease[J].BiolChem, 1997,272:7595—7601.[2]SMathew,^iJSeanlan,BKMohanRaj,eta1.Thegeneforfibro? blastactivationproteinalpha(FAP),aputativecellsurfacebound sedneproteaseexpressedincancerstinmaandwoundhealing, mapstochromosomeband2q23[J3.Genomies,1995,25:335—337.【3]WTChen,TKeUy.Seprasecomplexesincenularinvasiveness [J].CancerMetastasisRev,2003,22(2—3):259—269.[4]PJCollins,GMcMahon,POBrien,eta1.Purification,identifiea- tionandcharacterisationofseprasefrombovine8erOlll[J].IntJ BiochemCellBiol,2004,36:2320—2333.[5]KNLee,KWJackson,VJChristiansen,eta1.Antiplasmin—clea- vingenzymeisasolubleformoffibroblastactivationprotein[J]. 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组织金属蛋白酶及其抑制因子与肝纤维化
组织金属蛋白酶及其抑制因子与肝纤维化（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是体内重要的水解酶之一，几乎能降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的所有成分;基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinasas，TIMPs )是MMPs的内源性抑制系统。
近年来发现，MMPs/TIMPs调节失衡与肝纤维化的关系密切，可从多方面影响肝纤维化的形成。
通过干扰MMPs与TIMPs基因的表达，研究肝纤维化的发病机制和药物治疗是有希望的途径。
【关键词】 MMPs ;TIMPs; 肝纤维化肝纤维化是许多慢性肝病的共同病理过程，是细胞外基质(ECM)的合成与降解失衡，导致在细胞间质的过度沉积[1-4 ]，肝组织结构改建。
许多细胞因子参与了这一过程，但是MMPs是最重要的一种[5]。
MMPs 几乎能降解细胞外基质(ECM) 的所有成分，而其天然抑制剂-基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)能与MMPs成员结合成复合物抑制其活性[6]。
二者的调节异常将引起ECM合成或降解的失衡，与各种器官纤维化疾病密切相关。
研究发现，通过调节MMPs与TIMPs基因的表达来治疗肝纤维化是肝纤维化治疗的新途径。
本文就MMPs/TIMPs与肝纤维化的关系及治疗前景作一综述。
1 MMPs分类、功能、结构及活性的调控MMPs是一组基质金属蛋白酶。
MMPs在肝内主要由肝星状细胞(HSC) 和 Kupffer细胞表达分泌，参与细胞外基质降解的一类锌-钙离子依赖的内源性蛋白水解酶家族，因其需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名，是迄今为止发现的唯一能分解纤维类胶原的酶，几乎能降解除多糖以外的所有ECM成分，在生理病理过程中发挥着重要的作用。
肝纤维化新进展
感染科2012-10-19
病因：
1.病毒性肝炎 2. 酒精中毒 3.遗传和代谢性疾病 4. 胆汁淤积 5.循环障碍 6. 肝脏淤血 7.免疫紊乱 8.血吸虫病 9.化学毒物或药物 10.隐源性
广泛的肝细胞坏死，导致正常 的肝小叶结构破坏
肝内星状细胞激活 细胞因子↑ 胶原形成↑降解↓ 细胞外间质成分变化 肝窦毛细血管化
1.不同人种(高加索人群和中国人群)等位基因多态性的分布和频率具有 较大差别。 2.不同肝病可能具有不同的发病机制和基因多态性相关性。 3.需要更大样本和全基因组关联研究探讨中国人群乙型肝炎肝硬化危 险相关SNPs，进行基础和临床验证 化危险积分标志。 建立中国乙型肝炎患者特异的硬
肝纤维化与基因多态性
对一筛检方法的真实性的评价使用灵敏度、特异度和约登指数三个指标。 ①灵敏度(sensitivity)：又称敏感度，是指筛检方法能将实际有病的人正确地判定为患者的比例；
②特异度(specificity)：是指筛检方法能将实际无病的人正确地判定为非患者的比例；
③约登指数(Youden index)：是评价筛查试验真实性的方法，假设其假阴性（漏诊率）和假阳性（误诊率）的 危害性同等意义时，即可应用约登指数。约登指数是灵敏度与特异度之和减去1。表示筛检方法发现真正的患 者与非患者的总能力。指数越大说明筛查实验的效果越好，真实性越大。
肝纤维化的诊断
3.肝穿刺活组织病理检查：金标准
肝穿刺标本： ①样本误差：肝组织病变分布不均，一份肝组织标本仅占肝脏的1/100000 ~
1/50000，存在样本误差。确诊大结节性肝硬化仅为40%左右，小结节性肝硬化
为60%左右。
要求：标本长度》15mm，显微镜下显示10个以上小叶范围和至少6个以上门管 区。（研究显示：标本长度》15mm，确诊率为85%；标本长度》20mm，确诊 率为90%；标本长度》25mm，确诊率为95%；标本长度》30mm，几乎无标本 误诊）
明胶酶谱实验
1) 母液配制：1. 10X明胶溶液（50ml）：称取500mg明胶，加入高压灭菌三蒸水约40ml，室温放置2h，使其吸水膨胀，然后置于65°C水浴，在15min之内溶成均匀的液体，最后定容至终浓度10mg/ml，于4°C备用。
注：样本量较多时一次性配制50ml，分装于5ml EP管中-20°C备用。
2. 10X 50mM Tris-HCl母液（2L）：即0.5M Tris-Hcl。
称取121.14g Tris-base，双蒸水溶解后浓盐酸调节pH值至7.5，定容至2L。
3. 20X 5mM CaCl2母液（1L）：即100mM CaCl2（分子量111）。
称取11.1g CaCl2，双蒸水溶解后定容至1L。
4. 2000X 1uM ZnCl2母液（1L）：即2mM/L ZnCl2（分子量136.30）。
称取0.2726g ZnCl2，双蒸水溶解后定容至1L。
（注：使用浓度实在太小，只好配大体积的母液增加精准度。
ZnCL2在水中呈絮状，用前剧烈震荡均匀）5. 10X 2.5% Triton X-100母液（400ml）：即25%TritonX-100。
100mlTriton X-100原液双蒸水稀释至400ml。
4度保存备用。
6. 10X Brij-35 0.02%母液（500ml）：即0.2%Brij-35。
称取1g Brij-35至400ml双蒸水，65度水浴加热至完全溶解后定容至500mL。
4度保存备用。
2) 使用液配制：1. 5×loadingbuffer配方:用培养细胞上清等浓度较低样本检测Tris-HCl(PH6.8) 0.4MSDS 10%Glycerol 50%Bromophenol blue 0.03%2. 2×loadingbuffer配方:用血清、组织样本等浓度较高样本检测0.125 M Tris–HCl, pH 6.84% (w/v) SDS20% (v/v) glycerol0.04% (w/v) bromophenol blue.3. 洗脱缓冲液1L：4. 漂洗液1L：5. 孵育缓冲液1L：6. 考马斯亮蓝R-250染色液（可重复使用）：Methanol 30%Acetic acid 10%Coomassie R blue 0.25%7. 脱色液：Methanol 20%Acetic acid 10%3) 操作步骤：1. SDS-PAGE胶的灌制：灌制8%SDS-page分离胶（同western blot，现配现用）和5%浓缩胶，分离胶加入1/10体积的10mg/ml的明胶溶液，使明胶终浓度为1mg/ml。
肝纤维化_精品文档
2 隔
多数PF±短纤维隔 PF，纤维隔形成 PF，少量间
3
桥接纤维化 多数PF，偶有P-P 纤维隔伴小叶
化
间隔纤维
P-P/P-C
结构紊乱
4
肝硬化
PF伴明显P-P和P-C 可能或肯定肝硬化 肝硬化
5
明显P-P/P-C偶有结节
6
可能或肯定肝硬化
注: PF为汇管区纤维化；P-P汇管桥接纤维化；P-C为汇管-中央桥接纤维化
• 玻璃体连接素（vitronectin）: 具有结合胶原的功能， 血浆VN水平和肝纤维化程度有一定相关性
• 血栓粘合素（thrombinspond）: 能结合肝素、V型胶 原、 FN等，防止细胞扩散
ECM 的蛋白多糖
• 糖胺多糖: 透明质酸、硫酸肝素、硫酸皮肤素、 硫酸软骨素等；
• 与细胞膜相关的蛋白多糖: Syndecan、 Thrombommodulin、Betaglycan；
• 粗纤维调节素（undulin） : 主要分布于紧密排列的I、 III型胶原纤维中,对于维持胶原的超分子结构起重要作 用；
• 副层粘蛋白（entactin/nidogen）: 主要分布于基底膜， 调节层粘蛋白与其受体的结合；
• 细胞粘合素（tenascins）: 分布于窦周间隙、肝窦，可 能在早期ECM的沉积中起作用
各种致肝纤维化因素通过此决定性途径, 把 HSC细胞作为最终靶细胞
肝星状细胞简介
• 1879年Kupffer发现，1952年Ito将其与枯否及内 皮细胞区分
• 1971年WaKe证实其VitA储存能力 • 为窦周细胞，位于Disse腔内皮细胞层下，占
1.4%的肝容积，HC: HSC＝20:1 • 具有双重显型表达能力，由静止型转化为肌成
MMPs及TIMPs在肝纤维化的作用机制及研究进展
MMPs及TIMPs在肝纤维化的作用机制及研究进展郭艳祥;杨迎春(综述);李冬梅(审校)【期刊名称】《贵州医药》【年(卷),期】2015(000)007【总页数】3页(P663-665)【关键词】肝纤维化;细胞外基质;MMPs/TIMPs【作者】郭艳祥;杨迎春(综述);李冬梅(审校)【作者单位】哈尔滨医科大学附属第二医院麻醉科，黑龙江哈尔滨150086;哈尔滨医科大学附属第二医院麻醉科，黑龙江哈尔滨150086;哈尔滨医科大学，黑龙江哈尔滨150086【正文语种】中文【中图分类】R575肝纤维化主要由肝脏细胞外基质（ECM）合成、分解间失衡所造起，主要涉及基质蛋白的合成增多、降解减少或二者兼备，是Ⅲ、Ⅳ型胶原或其它细胞外基质增多，破坏肝的组织结构最终损坏肝功能。
肝纤维化的过程既是初期ECM合成增加，更是后期降解降低的结果。
在肝纤维化ECM合成增多和降解减少的全过程，基质金属蛋白酶（MMPs）与基质金属蛋白酶组织抑制因子（TIMPs）二者均有不同程度的表达［1］。
1 分子结构及功能MMPs是一类含有锌原子并依赖钙原子的内切酶，以酶原形式分泌，在中性条件下降解细胞外纤维性胶原。
MMPs含有相似的分子组成，包括80个氨基酸残基组成的氨基端结构域和200个氨基酸的血红蛋白组成的羧基端结构域，除能降解胶原蛋白、聚糖等ECM成分，还能激活其他MMPs类。
其活性可被TIMPs抑制。
按作用底物不同，将26种MMPs分为五大类［2］：（1）间质胶原酶，主要分为中性粒细胞型（MMP－8）及成纤维细胞型（MMP－1），主要来源于kuppfer细胞、肝星状细胞、肝细胞、结缔组织细胞；（2）基质降解素：仅有MMP－3在肝脏中存在，由结缔组织细胞、巨噬细胞、肝星状细胞分泌，主要作用于蛋白多糖；（3）明胶酶（gelatinase），包括明胶酶 A（MMP－2）和明胶酶B（MMP－9），来源于结缔组织细胞、单核细胞、肿瘤细胞，主要降解明胶和基底膜胶原等；（4）膜型基质金属蛋白酶：可促进明胶酶原 A（Pro－MMP－2）的激活并降解间质性胶原蛋白；（5）其他酶类：主要是金属弹性蛋白酶（metalloelastase）等蛋白酶类，可降解ECM中的弹性蛋白及纤维连接蛋白等。
肝再生过程中肝星状细胞及基质金属蛋白酶的动态变化
３ 河南师 范大学体 育学院，５０ ７ ． ４３０）
（． 乡医学院基础 医学院，５ ０ ７ ． １新 ４ ３０ ；２ 河南师 范大学生命 科学学院 ，５０ ７ ４３０ ￣
【 要】 目的 研究大鼠肝大部切除（ Ｈ 后再生过程中肝星状细胞（ Ｓ ｓ的动态变化及肝 ＭＭＰ２ＭＭ － 摘 Ｐ） Ｈ Ｃ） －、 Ｐ
ａ ｔｖｔ ｓｏ ａｒｘ ｍｅ ａｌｐ ｏ ｅｎ ｓ － （ Ｍ Ｐ ２ ａ ｄ ｍａ ｒｘｍ ｅａｌｐ ｏ ｅｎ ｓ － （ Ｍ Ｐ ９ ｗｅ ｅｄ — ｃｉｉｉ ｆｍ ｔｉ ｔ ｌ ｒ ｔｉａ ｅ２ Ｍ ｅ ｏ ＿ ） ｎ ｔｉ ｔ ｌ ｒ ｔ ｉａ ｅ９ Ｍ ｏ 一） ｒ ｅ ｔｃｅ ｖ Ｓ ｅ ｔｄ ｂ Ｄ Ｇ ＰＡＧＥ ．Ｒｅｕｔ （ ） Ｃｓｗｅ ｅｅ ｔ ｎ ｉｅｙ ｄｓｒｂ ｔ ｄ ｉ ｉｅ ｏ ｕ ｅ ｎ ｏ ｓｉ ｓｌ ｓ １ ＨＳ ｒ ｘ ｅ ｓｖ ｌ ｉｔｉ ｕ ｅ ｎ ｌ ｒｌ ｂ ｌｓａ ｄｃ ｎ ｔ— ｖ ｔ ｔｄ ｔ ｅｓ ｐ ｏ ｔ ｇ ｎ ｔ ｒ ． Ｂ ｔ ｈ ｕ ｅ ｆｄ ｓ ｉ ｎ ｕ ｅ ｈ ｕ ｐ ｒ ｉ ｅ ｗｏ ｋ ｎ ｏ ｈ ｔ ｅｎ ｍｂ ｒｏ ｅ ｍ ｎ ａ ｄ ＧＦＡＰ ｐ ｓｔ ｅ Ｈ Ｓ ｅ ｌ ｅ ． ２ ｏ ｉｉ Ｃｓｄ ｃｉ ｄ （ ） ｖ ｎ
９的活性变化 ， 探讨肝 星状 细胞在肝再生中的作用。方法 按 Ｈｉｇｎ 等方 法制备肝 大部 切除动 物模型 ， ｇ ｉｓ 于术后恢 复 不 同时程取材 ， 免疫组 织化学 法检测肝 ＨＳ ｓ Ｃ 的动态变 化 ， 明胶 酶谱电泳法 检测肝 中 ＭＭＰ ２ ＭＭＰ９的变化 。结果 －、 －
（） １ 正常肝小叶内 ＨＳ ｓ呈网架 状分 布， Ｈ 后 Ｄ ｓ ｉ Ｃ Ｐ ｅｍ ｎ阳性 ＨＳ ｓ 数量递 减 ； Ｃ的 胶质 纤维 酸性 蛋 白 （ Ｆ ） Ｇ ＡＰ 阳性
中文：Hepatic fibrogenesis
肝纤维化Jinsheng Guo, M.D., Scott L. Friedman, M.D.摘要肝纤维化是肝脏对各种损伤产生的一种创伤-修复反应，在许多患者最终导致失代偿性肝硬化，全球具有较高的发病率和病死率。
激活的肝星状细胞、其它类型的肝促纤维形成细胞及骨髓和循环中的纤维细胞引起肝损伤中细胞外基质累积。
同时，基质金属蛋白酶(MMPs)对ECM的降解速度跟不上合成的增加，在一定程度上是由于MMP抑制因子(如：金属蛋白酶组织抑制因子)的持续表达。
已经鉴定出了一些能增强肝纤维化反应的循环、旁分泌和自分泌介质。
加上不断增多的信号通路和遗传决定因素方面的知识，我们期待着在新的诊断学和治疗学上取得更多的进展，这将在未来几年里转变慢性肝病的诊疗方式。
关键词：肝纤维化，细胞外基质，肝星状细胞，金属蛋白酶组织抑制因子，信号通路在过去的5到10年中，肝纤维化领域的知识得到了爆炸性增长，这主要得益于在致病机制方面的理解取得了持续进展以及意识到纤维化是一些本可以得到治疗的慢性损伤的一个共同通路。
现在，前进的步伐更快了，对肝纤维化发展和逆转过程中的关键介质的新认识将为慢性肝病的治疗开创一个令人兴奋的新时代。
本文将围绕肝纤维化治疗所取得乐观进展进行综述。
肝纤维化的病理改变肝纤维化是指继发于急性或慢性肝损伤的间质或“瘢痕”细胞外基质(ECM)累积。
不论病因如何，肝硬化和终末期肝纤维化的特点都是肝结构变形、间隔形成或肝细胞环绕瘢痕形成结节带，并与微血管结构改变相关。
这些病理变化损害了肝脏功能并能导致门脉高压。
在纤维化过程中肝脏中ECM组分的质量、数量及分布都会发生很大的变化[1]。
共同形成肝脏瘢痕、在间质中积聚的ECM组分替代了狄氏腔内皮下正常的低密度Ⅳ胶原，这些间质纤维形成的胶原(尤其是Ⅰ和Ⅲ型胶原)主要分布于肝再生结节周围的连接间隔内。
硬化肝可能含有健康肝六倍以上的胶原和蛋白多糖[2]。
而且Ⅰ型胶原要比Ⅲ型胶原增加更为显著，它们在正常肝中的比例是1：1，在硬化肝超过1：1。
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酶谱法测定肝星状细胞合成的明胶酶活性
王晓丹;时晓明;曲显俊;程艳娜;史桂云;高允生
【摘要】目的建立检测肝星状细胞(HSC)合成的明胶酶(MMP-2,MMP-9)活性的方法.方法用含SDS-明胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础的酶谱法,检测体外培养的HSC所合成的明胶酶活性.结果酶谱法能灵敏地检测到HSC分泌到培养基中的MMP-2和MMP-9,培养基中MMP-2活性高于MMP-9,并观察到药物作用以后酶活性的改变.结论酶谱法是研究HSC调节肝纤维化过程中细胞外基质(ECM)代谢的有效手段.
【期刊名称】《泰山医学院学报》
【年(卷),期】2010(031)007
【总页数】2页(P513-514)
【关键词】肝纤维化;肝星状细胞;明胶酶;酶谱法
【作者】王晓丹;时晓明;曲显俊;程艳娜;史桂云;高允生
【作者单位】泰山医学院,山东,泰安,271016;泰山医学院,山东,泰安,271016;山东大学药学院,山东,济南,250014;山东大学药学院,山东,济南,250014;泰山医学院附属医院,山东,泰安,271000;泰山医学院,山东,泰安,271016
【正文语种】中文
【中图分类】R282.71
肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是继发于各种原因引起的肝脏炎症或损伤后组织修
复过程中的代偿反应,以细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝内过量沉积为病理特征[1]。
近年的研究[2]表明肝星状细胞(HSC)在肝纤维化的病理生理过程中起着关键作用,HSC从静止转化为激活状态可合成肝脏几乎全部 ECM,因此 HSC的激活是肝纤维化发生的中心环节,同时合成大量 ECM,并通过其合成的基质金属蛋白酶(MMPs)和金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)调节 ECM降解。
为了研究 HSC在ECM降解中的作用及用 HSC研究具有促进 ECM降解的药物,我们尝试了 HSC明胶酶谱的测定方法。
1 材料与方法
1.1 实验材料明胶酶(gelatinase,17104-019,美国 Gibco BRL公司产
品);TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺),过硫酸胺(amnonium persulfate,AP,A-6761)均为美国 Sigma公司产品;考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue R-250),丙烯酰胺(acrylamide),甲叉双丙烯酰胺(bisacrylamide)均为美国 Bio.Basic.Inc.BBI 公司产品 ;Triton X-100、SDS等,美国SERVA公司产品。
其余试剂均为分析纯。
1.2 试剂配制 1%明胶：称 1.0 g明胶溶于 100 ml蒸馏水,37℃溶解,4℃保存。
样品缓冲液：0.25 mol/L Tris-HCl(pH 6.8),10%SDS,4%蔗糖,0.1%溴酚蓝。
电泳缓冲液：0.025 mol/L Tris,0.192 mol/L甘氨酸(pH 8.5),0.1%SDS。
洗脱缓冲液：
2.5%Triton X-100。
明胶酶缓冲液：50 mmol/L Tris,10 mmol/L CaCl2,200 mmol/L NaCl,1μmol/L ZnCl2。
染色液：0.25%考马斯亮蓝 R-250(溶于 1︰4.5︰ 4.5的冰乙酸、甲醇和 H2 O中)。
脱色液：冰乙酸︰甲醇︰ H2O=1︰ 4.5︰4.5。
1.3 细胞培养 HSC细胞株购于中国医学科学院肿瘤研究所生物检测中心细胞库,生长于 DMEM培养基(Gibco BRL,Rockville,MD,USA)+15%胎牛血清(含 2 mM L-glutamine,penicillin and streptomycin)中 ,置37°C(5%CO2 ～ 95%air)培养箱生长,以0.05%EDTA-PBS分散成为单细胞。
取处于对数生长期的细胞用于实验。
1.4 明胶酶的酶谱法测定
1.4.1 制胶与普通的聚丙烯酰胺凝胶的制胶过程相同,只在分离胶中加入 1%的明胶,使明胶的终浓度为 0.1%。
1.4.2 样品制备 HSC培养 24 h后的细胞培养基离心后以 2︰ 1与样品缓冲液混匀,取15μl上样电泳。
1.4.3 电泳于 BIO-RAD电泳槽中,常温 80 V电压电泳 30 min,100 V电压电泳1.5 h。
1.4.4 洗脱将胶置于洗脱缓冲液中,脱色摇床上洗脱 15 min,蒸馏水中漂洗 3次,充分除去 SDS。
1.4.5 反应将胶置于反应缓冲液中37℃反应过夜。
1.4.6 染色及脱色将胶自反应液中取出,三蒸水漂洗 2次,染色液中常温染色 4 h,蒸馏水漂洗 2次,置脱色液中常温脱色 15 min,照相、记录。
2 结果
2.1 培养的 HSC 图 1显示培养 10d的 HSC,细胞呈星形、多边形、棱形,有很长的细胞突起。
细胞复苏以后传代培养,此时的 HSC是研究 ECM合成与降解的良好材料。
图1 培养 10d的HSC(×400)
2.2 酶谱法检测到的 MMPs活性条带此方法能够灵敏地检测到 HSC分泌到细胞外的 MM--2和MMP-9,并且 MMP-2的活性高于 MMP-9(图 2)。
当A3处理
24h以后,培养基中的 MMPs活性发生了改变,培养基中检测到 MMP-9和 MMP-2并且 MMP-2活性增加(图 3)。
图2 酶谱法检测到MMPs
图3 A3处理 24h后 MMPs活性
3 讨论
肝纤维化是肝脏 ECM合成与分解代谢失衡所造成的不良结局,是临床上常见的病理生理改变。
HSC在肝纤维化的病理生理过程中起着关键作用,既参与 ECM合成,也
调节其降解,是造成 ECM在细胞外过度堆积的重要原因。
酶谱法为研究 HSC MMPs基因表达差异,内源及外源性激活条件,酶活性的调节,从而研究肝纤维化的
病理生理机制和研究具有促进肝纤维化过程中ECM降解的药物和方法有重要意义。
用含明胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础的酶谱法,能够检测到 HSC细胞内和培养基中的 MMP-2和 MMP-9,并且培养基中 MMP-2活性高于MMP-9,这与文献报道
的 HSC较高的表达 MMP-2 mRNA相一致[3]。
当药物作用后,培养基中 MMP-2
显著增加,表明 MMPs的表达发生了改变,或者酶被激活。
目前,常用于检测 MMPs 的方法主要是ELISA和放免法,这些方法只能检测其含量,不能检测其活性。
而MMPs活性受到 TIMPs调节,TIMPs通过与 MMPs非共价结合,从而抑制 MMPs
的活性和 ECM降解,MMPs的数量不反应其对 ECM的降解能力,因此,测定 MMPs 活性更有意义[4]。
酶谱法不影响 TIMPs与 MMPs的结合,能够测定 MMPs的活性,反映其在 ECM降解过程中的作用,并且此方法经济、简便、重复性好。
参考文献：
[1] 高润平,齐晓艳.肝纤维化的发生机制与治疗进展[J].世界华人消化杂
志,2006,14(23)：2263-2269.
[2] 赵稳兴,.梁崇礼.酶谱法测定肝星状细胞合成的基质金属蛋白酶活性[J].中国应用生理学杂志,2002,18(2)：56-58.
[3] Lichtinghagen R,Breitenstein K,Arndt B,et parison of matrix metalloproteinase expression in normal and cirrhotic human
liver[J].Virchows Arch,1998,432：153-158.
[4] Herron GS,Banda MJ,Clart E J,et al.Secretions of metelloproteinase by
stimulated capillary endothelial cells[J].JBiol Chem,1986,261：2814-2818.。