几株石油烃降解菌的研究

几株石油烃降解菌的研究

易力;押辉远;李迪;张祥胜

【摘要】对从胜利油田的石油污染土壤中分离出的5株细菌进行降油能力的初步

评价发现,石油烃降解率分别为48.7％、43.2％、38.2％、51.4％和39.4％；对

这5株菌通过形态特征和生理生化特征进行分类学鉴定发现,5种菌分别属于假单

胞菌属、红球菌属、芽孢杆菌、放线菌属和微球菌属.最后研究了这5株菌在不同

盐度和pH条件下的生长状况,为石油烃降解菌的应用提供了依据.

【期刊名称】《广东农业科学》

【年(卷),期】2011(038)006

【总页数】3页(P165-167)

【关键词】石油污染土壤;生物修复;石油烃降解菌

【作者】易力;押辉远;李迪;张祥胜

【作者单位】洛阳师范学院生命科学系,河南洛阳471022;洛阳师范学院生命科学系,河南洛阳471022;洛阳师范学院生命科学系,河南洛阳471022;山东大学微生物

技术国家重点实验室,山东济南250100

【正文语种】中文

【中图分类】X131.3

随着石油工业的发展，石油在开采、运输和使用过程中的泄漏以及含油废弃物排放引起的土壤污染问题日益严重，石油污染土壤的修复技术研究日益受到人们的重视。

在诸多石油污染土壤的治理方法中，生物修复由于具有经济、有效以及对环境破坏性小等优点而被认为具有广阔的应用前景[1]。石油污染土壤的生物修复，是指利

用微生物及其他生物将存在于土壤、地下水和海洋中的有毒有害的石油污染物现场降解成CO2和H2O或转化为无害物质的工程技术系统[2]。分离筛选对石油具有

较强降解能力的菌株，是研究细菌降解石油的机理及对污染水域或土壤进行生物修复的基础。本研究对从胜利油田的石油污染土壤和油泥沙中分离和筛选出的降解石油烃的微生物进行降解石油烃评价，对筛选出的高效石油烃降解菌株进行鉴定，根据形态特征和生理生化特征进行分类学鉴定，并研究其最适生长条件，以期为生物修复石油污染土壤提供菌种资源，并为降解石油烃微生物的生长提供最佳条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验仪器 QYC-2102大容量双层全温摇床（上海新苗医疗器械制造有限公司）、奥特光学BK5000生物显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司）、SW-CJ-2F 型双人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司）、FA2104A电子天平（上海精

天电子仪器有限公司）、LD2X-40KB立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、SPX-250BS-Ⅱ生化培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）、PHS-25（数显）pH计（上海精密科学仪器有限公司）、UV-1100S紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）。

1.1.2 菌株 5株分解石油的微生物分离自山东胜利油田石油污染土壤，编号为A、

B、C、E、G。菌株由长江大学生命科学学院提供。

1.1.3 试剂草酸铵结晶紫染液；路哥尔氏碘液；95%乙醇；0.5%沙黄染液。

1.1.4 培养基（1）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 15 g，琼脂 15～20 g，蒸馏水 1 L，pH 7.2～7.4。（2）LB 培养基：胰蛋白胨 10 g，

酵母膏 10 g，NaCl 15 g，蒸馏水 1 L，pH 7.2。（3）无机盐培养基：大量元素

液：MgSO4·7H2O 0.40 g，CaCl2·2H2O 0.02 g，KH2PO41.00 g，

K2HPO41.00 g，NH4NO31.00 g，FeCl30.05 g，酵母膏 1.00 g，微量元素液

2 mL，蒸馏水 1 L，pH 7.2；微量元素液：MnSO460 mg，ZnSO4·7H2O 200 mg，蒸馏水 1 L。（4）降油培养基：无机盐培养基+5%原油，pH值7.2。（5）淀粉水解培养基（淀粉水解用）；葡萄糖蛋白胨培养基（VP和MR试验用）；西蒙斯氏柠檬酸盐培养液（柠檬酸盐利用实验用）；生化反应管（吲哚试验、尿素分解、明胶液化、七叶灵水解、硫化氢分解、葡萄糖利用、乳糖利用、蔗糖利用）。

1.2 试验方法

1.2.1 石油降解率的测定在150 mL液体无机盐培养基中接种石油降解菌，接种量为培养液体积的0.5%。并加入 5%原油，经摇床培养（28℃，120 r/min）后，

加入 20 mL石油醚于30℃～60℃萃取，并将培养液置于5 000 r/min下离心10 min，转至分液漏斗，振荡100次，静置，待分层后分离，收集上层液，用石油

醚洗涤2～3次，合并上层液，在烤箱中65℃蒸干，冷却后称重[3]。除油率的计

算采用下列公式：

除油率=（m3－m2）/m1×100%

式中，m1为最初的含油量，m2为降解后的残余油量，m3为对照组的残余油量。

1.2.2 菌株形态特征根据各株细菌的降油能力大小，筛选出降油能力高的菌株进行研究。选择合适的稀释度将菌液涂布在固体牛肉膏蛋白胨培养基上，28℃条件下

培养24 h，观察菌落大小和菌落形态，挑取单菌落进行革兰氏染色[4]。

1.2.3 菌株的生理生化鉴定采用穿刺接种法观察细菌运动性。参考崔丽虹等[5]所

列的生理生化鉴定项目，根据《常见细菌系统鉴定手册》[6]和《微生物学实验教程》[4]中的试验方法进行测定。

1.2.4 耐盐测试牛肉膏蛋白胨液体培养基培养细菌，调节培养液中NaCl的质量分数为1%、2%、5%、8%、10%，28℃条件下培养24 h。将菌液稀释5倍后测量

菌液在540 nm时的OD值。

1.2.5 耐酸碱测试牛肉膏蛋白胨液体培养基培养细菌，调节培养液 pH 值为 4.0、6.5、7.5、9.0、10.0，28℃条件下培养24 h。将菌液稀释5倍后测量菌液在540 nm时的OD值。

2 结果与分析

2.1 各菌株降油能力比较

试验结果表明，供试菌株石油烃降解率均大于35%，菌株 A、B、C、E、G 的降解率分别为 48.7%、43.2%、38.3%、51.4%、39.4%。采用重量法测定菌株的降油率，在石油的萃取和样品称量过程中不可避免地会产生误差。但本试验的目的在于筛选出高效降解石油烃的菌株，因此该试验结果有一定的参考价值，对石油烃降解率高的菌株筛选有意义。

2.2 各菌株形态特征和生理生化特征比较

各菌株形态特征和生理生化特征鉴定结果见表1。通过一系列生理生化测试结果对菌株进行对比鉴定，确定菌株A为假单胞菌属，菌株B为红球菌属，菌株C为芽孢杆菌属，菌株E为放线菌属，菌株G为微球菌属。

2.3 盐度对各菌株生长的影响

外界环境渗透压的不同会导致微生物原生质膜上的离子种类和数量出现变化，从而影响其生长和繁殖，此外也有可能是过多的Na+抑制了微生物脱氢酶和氧化酶的分泌，影响石油烃的降解率。因此，本试验设定不同的盐度值，考查其对不同菌株的影响，结果见表2。由表2可知，菌株A可以在高浓度盐下生长；菌株B和菌株C在低盐浓度下生长良好，但不能适应高盐环境；菌株E适应范围较广，但随着盐浓度增加，生长呈下降趋势；菌株G在低盐浓度下生长状况良好，但不适应高盐环境。

表1 各菌株形态特征和生理生化特征比较注：“+”表示产酸或产气“-”表示不