几株石油烃降解菌的研究
石油烃降解菌Rhodococcus sp.15—3的分离鉴定及特性研究
（．ｐ ｎＫ ｙＬｂ ｒｔｙｏ ｃｏ ｉ ｏｉ ｌ ｎ ｉｅｒ ｇ ｆ ｇｉ ｌ ｒ ｎ ｉ ｎ ｅ ｔＭｉｉｒ ｇｉｕ ｕｅ Ｎ ｎｉｇ ｇｉｕ ｕａ Ｕ ｉ ｒ ｔ １ ｅ ｅ ａ ｏａ ｒ Ｍｉ ｂｏ ｇ ａ Ｅ ｇ ｅｉ ｒ ｕｔ ａ Ｅ ｖ ｏ ｍ ｎ， ｎｓ ｙ ｆ ｒ ｌ ｒ， ａｊ Ｔ ｌ ｒｌ ｎｖ ｓｙ Ｏ ｏ ｆ ｒ ｌ ｃ ｎ ｎ ｏ Ａ ｃ ｕｌ ｒ ｔ ｏＡ ｃ ｔ ｎ Ａ ｃｔ ｅ ｉ，
关键词 ： 红球菌 ； 分离鉴定 ； 石油生物降解
中图 分 类 号 ： ７ 文 献 标 识 码 ： Ｘ１２ Ａ 文 章 编 号 ：６２ ２ ４ （０ ８０ — ７ ７ ０ １７ — ０ ３２ ０ ）５ １ ３ — ５
ＴｈｅＩ ｏ ａｔｏ ａ ｓ ｌ ｉ ｎ ｎｄ Ｃｈａｒ ｃ ｅ ｉ ａ ｉ ｓｏ ｋａ ｓ Ｄｅ ｒ ｄｉ ｃ ｅ ｉ ａ ｔ ｒ ｚ ｔｏｎ ｆａＡｌ ｎｅ － ｇ ａ ｎｇＢａ ｔ ｒｕｍ Ｒｈｏ ｃ ｃ ｕｓｓ １ －３． ｄｏ ｏ ｃ ｐ ５
最适温度 、Ｈ值和盐浓度 （ ａ １分别 为 ３ ｐ Ｎ Ｃ） ０℃、．、 ％， ７０ ２ 在低温（０℃） 高盐 （ ５ Ｎ Ｃ） １ 及 ４ ％ ａ １环境下也有 良好 的降解 能力 。１— ％～ ５ ３菌株
可 以降解原油 中 Ｃ Ｃ 的正构烷烃 、 芳香烃及姥鲛烷 。在含 ５ｇＬ ・ 原油的培养基 中，０℃培养 ５ ３ ， ｄ后 菌株 １ — ５ ３对原油 的降解 率
ａｕ ｅ ｐ ａ ｄ Ｎ Ｃ ｏ ｃ ｎ ｒ ｔ ｎ ｆｒｄ ｇ ａ ｉｇ ｎ ｏ ｔ ｄ ｃ ｎ ｙ ｓｒ ｉ ５ ３ ｗ ｒ ０ ， Ｈ７ ０ ａ ｄ ２ Ｎａ １ ｅ ｐ ｃｉ ｅｙ Ｉ ｓ ｌ ｈ ｄｈ ｇ — ｔ ｒ ， Ｈ ｎ ａ １ ｎ ｅ ｔ ｉ ｅ ｒ ｄ ｎ — ｃ ａ ｅ ａ ｅｂ ｔａｎ １ － ｅ ｅ ３ ｐ ． ｎ ％ ｃ ａｏ ｏ Ｃ ｓ ｅ ｔ ｌ ．ｔ ｔ ｌ ａ ｉｈ ａ ｒ ｖ ｉ
石油对土壤的污染研究分析
石油对土壤的污染研究分析【格林大讲堂】由于油量丰富，石油烃降解菌大量繁殖，石油烃表观降解率高;随着时间的推移，易降解的石油烃组分被大量消耗，残留物主要为芳香烃等难降解组分，这导致了降解速率的降低和残留量的相对稳定.同时可以看到，不投加菌剂的污染土壤中石油烃的表观降解率随时间的延长有缓慢上升，但降解40d后只有16.8%的石油烃被去除，其主要原因是土壤中土著微生物对石油烃的降解及石油烃中易挥发组分的挥发.武汉格林环保有完善的服务体系和配套的专业环境工程团队，秉着崇高的环保责任和义务长期维护提供免费的污水处理解决方案，是湖北省工业废水运营管理行业中的品牌。
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如何修复石油污染土壤已成为世界性的环境问题.石油污染土壤的生物修复技术因具有投入成本低、对土壤生态环境破坏作用小、无二次污染和可操作性强等优点，石油工业的发展使得石油污染土壤呈日益扩大化趋势.石油中的烷烃类、芳香烃类及苯类物质毒性大且具有致癌作用，进入土壤后难以去除，并会引起土壤理化性质变化和地下水污染等一系列重大生态问题，因此，正逐步成为石油污染土壤治理领域的一个具有广阔应用前景的研究方向.然而，石油污染土壤生物修复的成功运作并非易事.理论与实践证明，恢复污染土壤至其原有的生态功能是一个长期而复杂的系统生态过程.在生物修复过程中，污染土壤逐渐向健康状态恢复，并伴随着一系列生化指标的变化.因此，有必要对土壤的生物修复过程及此过程中土壤的健康状况进行指示、监测及生态毒理学研究.但涉及同种植物各指标指示效果对比，以及不同植物指示之间的一致性分析的研究还比较少.由于通过不同指示植物对土壤生态毒性进行指示和评价可以有效地集合土壤中不同食物链生物对有毒有害物质的整体毒性效应，能较为全面地反馈土壤的污染信息.在这些生态毒性指示方法中，高等植物毒性试验以其相关性好、灵敏性高等优点而被国内外学者广泛用于石油污染土壤修复过程中土壤生态毒性的检测与评价.另外，高等植物作为土壤生态系统中的基本组成部分，利用其生长发育状况来指示土壤生态毒性也是土壤污染生态毒理学诊断的重要组成部分.虽然各种植物指标在生态毒性指示方面各有优势，因此，石油污染土壤微生物修复过程需要整合各种生态毒性指示和评价方法对土壤系统的生态安全性做出全面、科学地判断.课题组利用前期分离筛选出的3种石油组分降解菌株构建了混合菌体系，该混合菌对石油污染土壤表现出良好的修复效果.然而，之前的研究尚未确定究竟何种高等植物及具体哪些指标能够敏感地指示微生物修复的效果;并且在石油污染土壤修复过程中，该混合菌对污染土壤的各种生化指标影响的变化规律尚不清楚.因此，本研究以莴苣、黑麦草、小青菜、小麦、萝卜为供试植物进行高等植物毒性试验，考察石油污染土壤微生物修复过程中土壤的生态毒性.通过度量石油污染土壤对不同高等植物生长发育的抑制程度来考察不同修复时期土壤中的生态毒性强弱及变化规律，并以此确定石油污染不同高等植物指示的可行性与敏感性.此外，本文从高等植物毒性试验结果出发，从生态学角度揭示石油污染土壤微生物修复过程中残留的石油污染物和中间代谢产物对土壤生态系统的影响，在证明小麦和萝卜作为指示植物可行性的同时，也探究石油污染土壤修复过程中污染土壤的各种生化指标的变化规律.课题组前期分离出3种石油烃降解菌株，包括洋葱伯克霍尔德氏菌中的烷烃降解菌GS3C，鞘氨醇单胞菌中的菲降解菌GY2B，伯克菌科菌属的种中的芘降解菌GP3B.将上述3种菌株分别取1环进行富集培养，然后在25mg·mL-1的原油无机盐培养基(磷酸盐缓冲液5.0mL，FeCl3水溶液1.0mL，CaCl2水溶液1.0mL，MgSO4水溶液3.0mL，微量元素溶液1.0mL，蒸馏水1000mL)中分别加入1mL富集液，接着将加入了石油降解菌的原油无机盐培养基置于的摇床中驯化(30℃，150r·min-1)，每5d为一个周期，重复驯化11个周期后离心分离分别获取3种驯化产物.最后将驯化后的GS3C、GY2B、GP3B菌(4.0×108CFU·mL-1)按等量配比的原则(1∶1∶1，体积比)复配后形成石油降解混合菌.与不投加菌剂的污染土壤相比，投加菌剂的污染土壤表现出更高的表观降解率和更低的残留量，这表明在该微生物修复过程中，石油烃降解菌发挥了对污染物的去除的主导作用.不同修复时期土壤中总石油烃残留量及表观降解率可以看出，投加菌剂的污染土壤中石油烃表观降解率远高于未投加菌剂的土壤，相应地，残留量远低于未投加菌剂的土壤.具体而言，投加菌剂的污染土壤中石油烃表观降解率随时间的推移不断上升，石油烃表观降解率在修复的第8、16、24、32、40d分别达到54.0%、57.5%、60.2%、64.1%、64.4%，修复32d后石油烃残留量基本保持稳定(约1.79343mg·g-1).在生物修复前期.为了更深入地探讨石油污染土壤微生物修复技术的关键问题，分别对修复结束后的石油污染土壤中原油各组分(饱和烃、芳烃、沥青+胶质)的去除率进行了测定和分析，结果表明，40d的修复期结束后，烷烃的去除率达到了66.9%±2.3%，芳烃的去除率为36.6%±3.8%，而石油烃中最难降解的沥青和胶质，它们的去除率为18.5%±3.4%，石油烃组分的去除率高低顺序为：烷烃>芳烃>沥青和胶质.这说明微生物对石油烃各组分的生物利用存在差异.石油中的沥青质和胶质进入土壤后，由于其粘稠性大和难降解性等特点，在土壤中长期积累会破坏土壤结构，影响农作物的生长和发育.石油烃组分中的芳香烃是一类具有致癌变、致突变、致畸变等“三致”作用的有毒有害物质.而恰好相反的是，这两类石油烃组分在石油污染土壤微生物修复过程中的去除率相对较低.具体而言，植物各指标的响应并不是随着石油烃浓度的变化呈现相应的变化趋势;当石油烃浓度最高时，供试植物幼苗各生长指标的抑制效果不是最明显;相反，在石油污染土壤修复过程的前中期，石油污染土壤的抑制作用最强.这说明在石油污染土壤的修复过程中，目标污染物残留量的减少并不能笼统地说土壤的修复效果好，应结合土壤的生态学毒性试验，综合评价土壤的修复效果和健康质量.研究表明，土壤生态系统中的敏感指示物或指示指标能较全面地反映土壤生态毒性.将土壤生态毒性指示与化学诊断方法有效结合起来，能够更为全面、有效地表征土壤的整体健康状况.针对石油污染土壤生态毒性指示和评价系统，国内外学者提出了包括土壤酶活性试验、高等植物毒性试验、蚯蚓毒性试验和发光菌毒性试验在内的多种生态毒性试验方法.结果表明，去繁殖率、卵茧量和回避行为等指标能很好地指示该污泥的生态毒性.采用发光细菌试验来评价480d生物堆肥后的石油污染土壤的生态毒性，得出在最初土壤毒性最大，随着时间的延长，土壤毒性逐渐减弱，但仍存在较高的毒性.同时，通过发光细菌生态毒性试验研究了两种不同堆肥条件下的石油污染土壤，发现自然条件下堆肥处理(8个月)的毒性是人工强化堆肥的2~4倍.有学者考察了柴油污染土壤生物修复过程中土壤酶活性的变化情况，结果表明，β葡萄糖苷活性与土壤中石油烃残留量呈显著正相关，而土壤脱氢酶和脂肪酶与石油烃残留量显显著负相关.Banks等采用莴苣、粟、萝卜、红三叶草和小麦作为供试对象，以它们的种子发芽率为依据，考察了它们的适用性，结果表明，只有莴苣种子能较好地表征石油污染土壤和未受石油污染土壤的生态毒性差异.用蚯蚓来评价中国胜利油田污泥的生态毒性.。
原油降解菌株Pseudomonas.aeruginosa AS1生理生化性质及分类研究
原油降解菌株Pseudomonas.aeruginosa AS1生理生化性质及分类研究梁凯强;贾东林;侯亚妮;王飞;惠鑫;马志峰【摘要】原油降解菌株AS1筛选自延长油田油水样,对延长轻质原油具有良好降解能力,通过生理生化指标和16SrDNA基因序列分析进行了菌种鉴定,原油降解菌株AS1的16SrDNA基因序列与Pseu-domonas aeruginosa的相似度为99.1％,因而将其命名为P.aeruginosa AS1.该菌株的最适生长温度为37℃,能以延长轻质原油、液体石蜡为唯一碳源生长,并能合成鼠李糖脂类生物表面活性剂,该表面活性剂对柴油、煤油和原油等均有很好的乳化效果,在常温下形成EI24值为100％的乳状液.鉴于P.aeruginosaAS1的良好生物属性,该菌株有进一步进行微生物矿场试验的潜力.【期刊名称】《内蒙古石油化工》【年(卷),期】2011(000)020【总页数】4页(P120-123)【关键词】原油降解菌株;Pseudomonas aeruginosa;生物表面活性剂;EI24【作者】梁凯强;贾东林;侯亚妮;王飞;惠鑫;马志峰【作者单位】陕西延长石油(集团)有限责任公司研究院,陕西西安710075;陕西延长石油(集团)有限责任公司瓦窑堡采油厂,陕西子长717400;陕西延长石油(集团)有限责任公司瓦窑堡采油厂,陕西子长717400;陕西延长石油(集团)有限责任公司瓦窑堡采油厂,陕西子长717400;陕西延长石油(集团)有限责任公司瓦窑堡采油厂,陕西子长717400;陕西延长石油(集团)有限责任公司瓦窑堡采油厂,陕西子长717400【正文语种】中文【中图分类】TE357.9微生物提高石油采收率(M icrob ial Enhanced O il Recovery,M EOR)是目前国内外发展迅速的一项提高原油采收率的技术,被视为一种很有潜力的采油方法。
其主要方法是将地面分离培养的微生物菌液(外源微生物)和营养液注入油层,或单纯注入营养液激活油层内源微生物,使其在油层内生长繁殖,利用微生物及其代谢产物对油藏原油、地层产生作用,提高原油的流动能力,或改变液流方向,从而提高采收率[1]。
石油降解菌株的筛选 鉴定及其石油降解特性的初步研究
（2）pH值对菌株降解效率的影响：在pH值为7.0时，菌株X的降解效率最高， 达到60%以上。当pH值偏离7.0时，其降解效率明显下降。
（3）盐度对菌株降解效率的影响：在低盐度条件下，菌株X的降解效率较高。 随着盐度的增加，其降解效率逐渐降低。当盐度超过5%时，其降解效率显著下降。
（4）产物分析：利用GC-MS等技术，我们对菌株X降解石油烃的产物进行了 分析。结果显示，菌株X能够将石油烃主要降解为脂肪酸、酚类化合物等中间产 物。这些中间产物在进一步降解过程中转化为二氧化碳和水，从而实现石油烃的 生物修复。
2、筛选流程：首先，采集油污土壤和石油废水样品，进行富集培养；其次， 通过初筛和复筛，获得具有较强石油降解能力的菌株；最后，通过形态学和分子 生物学鉴定，确定菌株种类。
3、鉴定步骤：将筛选得到的菌株进行16S rDNA分子鉴定，利用细菌分类学 软件进行比对分析，最终确定菌株的种属。
4、石油降解特性分析：采用液体培养法测定菌株的石油降解能力，通过测 定不同时间点石油烃类物质的含量，计算菌株的降解速率和降解效率。
1、菌株筛选
从石油烃污染地区采集土壤样品，采用富集培养法，经过多步筛选，获得具 同温度、pH值、盐度等条件下，对菌株降解石油烃的能力进行测定。通 过改变环境因素，观察其对菌株降解效率的影响。同时，利用气相色谱-质谱联 用（GC-MS）等技术，对菌株降解的产物进行分析。
参考内容
一、引言
石油烃是石油和天然气的主要成分，它们在自然环境中的存在和降解对全球 碳循环和环境生态有着重要影响。厌氧降解菌在石油烃的降解过程中扮演着关键 角色。本次演示旨在筛选出具有高效石油烃厌氧降解能力的菌株，并对其降解特 性进行研究，以期为石油烃污染的生物修复提供理论依据。
二、材料与方法
石油降解菌代谢途径和分子机制的研究
石油降解菌代谢途径和分子机制的研究近年来，全球的环境问题日益严重，其中包括海洋油污染，这种污染对海洋生态环境造成了极大的破坏。
而石油降解菌的发现以及对其代谢途径和分子机制研究的深入，为海洋油污染的治理带来了新的希望。
石油降解菌，是指能够利用石油为唯一碳源利用的微生物。
石油降解菌的代谢途径因种类不同而异，但通常可以分为两种类型：一是利用石油中的芳香族化合物产生生长能量和维持生长维度的芳香族代谢途径；二是利用脂肪族化合物代谢获得生长能量和维持生长维度的脂肪族代谢途径。
对于芳香族化合物代谢途径，石油降解菌的分子机制已经相对明确，其中最为典型的是通过间歇性氧化途径代谢芳香族化合物的Pseudomonas菌株。
Pseudomonas菌株利用芳香族化合物的分子骨架，产生内源性的好氧代谢中间体，不断利用辅基酶A进行代谢反应，最终代谢产生了乙酰辅酶A和丙酮酸。
此外，还有一些石油降解菌是利用芳香族化合物的邻核或者间核位进行代谢，代谢产物有时候会进入苯酚类或者羟基多环芳烃类。
对于脂肪族化合物代谢途径，石油降解菌的分子机制尚不清楚。
其中最为典型的是在土地上分离出的一种广泛存在的绿色假单胞菌Sphingomonas sp. 2F2，其代谢特征为利用双酚A类化合物。
这种细菌利用许多类型的双酚A作为其唯一的碳源，利用产生的辅酶A，利用类似芳香族化合物代谢途径的间歇性氧化途径进行代谢反应，分解生物碱基和产生蒽醌和亚甲基蒽醌等中间代谢物。
这些代谢物是相当有毒的，为了保证细胞的生存而不致于受到中毒的影响，Sphingomonas sp.细胞利用一种特殊的运输蛋白，它能将有毒代谢物从膜外运输到膜内，保持代谢通畅。
总体来说，石油降解菌的代谢途径和分子机制的研究还处于比较初级的阶段，值得进一步深入探索。
通过对石油降解菌的深入研究，人们可以更好地了解石油降解的机理，为海洋油污染的治理提供参考，保障海洋生态的可持续发展。
4株石油降解真菌的生长及降解特性分析
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｔ ｏ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｚ ｅ ｔ ｈ ｅ ｄ ｅ ｇ ｒ ａ ｄ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｐ ｒ ｏ ｐ ｅ ｒ ｔ ｉ ｅ ｓ ｏ ｆ ｆ ｏ ｕ ｒ ｏ ｉ ｌ — ｄ ｅ ｇ ｒ ａ ｄ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｆ ｕ ｎ ｇ ｉ ，ｔ ｈ ｅ ｍｙ ｃ ｅ ｌ ｉ ｌ ａ ｇ ｒ ｏ ｗ ｔ ｈ ｒ ａ ｔ ｅ ｓ ｏ ｎ ｔ ｈ ｅ ｓ ｏ ｌ ｉ ｄ ｍｅ ｄ ｉ ｕ ｍ，ｔ ｈ ｅ ｄ ｒ ｙ
石油烃 的降解特性 。结果表 明， Ｊ １ ２ （ Ｆ ｕ ｓ ａ ｒ ｉ ｕ ｍ ｓ ｐ ． ） 菌株在液体和 固体培养基中的生长速率最大 。在原油液体 培养基培养 ３ ０ ｄ后 ， 色 谱一 质谱检测表明 ： Ｊ １ ２菌株对 Ｃ ｃ ， 的直链烃具 有较强的降解能力 ； Ｊ ３ （ Ｂ ｉ ｏ ｎ ｅ ｃ ｔ ｒ ｉ ａ ｓ ｐ ． ） 和Ｊ ４ （ Ｓ ｔ ａ ｃ ｈ ｙ ｂ ｏ ｔ ｒ ｙ ｓ ｓ ｐ ． ） 菌株 能够完全 降解 原 油 中的芳香烃 和支链 烃 ， 并且Ｊ ４菌株还可 以完全降解 Ｃ 的直链烃 ， 但 是新增 了 Ｃ 的直链烃和一种 ｃ ６ Ｈ ０ ； Ｊ １ １ （ Ｆ ｕ ｓ ａ ｒ ｉ ｕ ｍ ｓ ｐ 。 ） 菌 株可 以完全降解 Ｃ 。 的芳香烃 ， 但是产生 了两种 Ｃ 。 ６ Ｈ Ｏ 。 从原油 降解后 的组分及土壤 中污油的组分检测结果推断 ， Ｃ 和Ｃ 。 芳香 烃
海洋微生物降解石油的研究
海洋微生物降解石油的研究石油污染已成为全球性的环境问题，由于石油的不完全分解和有毒物质的释放，对海洋生态系统造成了严重的破坏。
为了寻求有效的石油降解方法，研究者们越来越多的海洋微生物在石油降解中的作用。
本文将对海洋微生物降解石油的研究进行综述，以期为石油污染的生物治理提供理论支持和实践指导。
海洋微生物降解石油的过程主要涉及生物氧化、水解、脱氢等反应。
通过这些反应，石油中的长链烃分子被逐渐分解为短链烃、脂肪酸等小分子物质。
虽然已有不少研究者这一领域，但大部分研究集中在降解过程中的某一环节，对整个降解过程的系统研究仍显不足。
尚有部分有毒物质在微生物降解过程中无法被完全分解，可能会对海洋生态系统造成长期威胁，这也是需要进一步探讨的问题。
本文采用文献综述和实验研究相结合的方法，对海洋微生物降解石油的过程进行深入探讨。
实验研究包括接种培养、生理生化指标测定、脂肪酸分析等。
为了便于比较和评价，实验中采用统计分析方法，对不同处理组的结果进行多重比较。
实验结果表明，经过接种培养的海洋微生物能够有效降解石油。
在降解过程中，微生物通过产生一系列酶类物质，实现对石油中不同成分的分解。
通过对生理生化指标的测定，发现微生物在降解过程中细胞生长迅速，生物量增加明显。
同时，通过脂肪酸分析，发现微生物细胞中的脂肪酸含量随着降解过程的进行而逐渐降低。
这些结果与文献综述中提到的研究结果基本一致，但尚有部分有毒物质无法被完全分解，需进一步探讨其原因及解决方法。
通过对海洋微生物降解石油的研究，我们发现虽然微生物能够有效降解石油中的大部分成分，但对于某些有毒物质仍无法完全分解。
因此，未来研究需要以下几个方面：深入研究海洋微生物降解石油的机制，找出未能完全分解的原因，以期发现更有效的降解方法；开展更为系统性的实验研究，比较不同环境因素对海洋微生物降解石油的影响，为实际应用提供指导；探讨如何将海洋微生物降解石油的研究成果应用于实际环境中，例如构建高效石油降解菌群落，为实现石油污染的生物治理提供技术支持；考虑到全球石油污染问题的严重性，有必要加强国际合作，共同应对这一环境挑战。
Fenton氧化—微生物法降解土壤中石油烃
Fenton氧化—微生物法降解土壤中石油烃韩旭;李广云;尹宁宁;许锐伟;王丽萍【摘要】以长期被苯系物污染的活性污泥为菌源,采用液相“诱导物-中间产物-目标污染物”驯化模式驯化出专性混合石油降解菌群,并将其用于Fenton氧化—微生物法处理模拟石油污染土壤.高通量测序结果表明,产黄杆菌属(Rhodanobacter)、分支杆菌属(Mycobacterium)和根瘤菌属(Rhizobiales)为主导菌属.实验结果表明:接种混合菌群后降解50 d,土样的总石油烃(TPH)去除率较土著菌提高了13.4～20.5百分点;对于TPH含量(w)分别为4％,8％,11％的土样,Fenton氧化的最佳H2O2加入量分别为3,4,4 mol/L (Fe2+加入量0.04 mol/L),TPH总去除率分别可达88.8％,65.0％,47.7％,较单独Fenton氧化或单独微生物法均有很大程度的提高,且缩短了降解时间,增加了土壤有机质.%Using the activated sludge which was long-term polluted by benzene as bacteria source,the specific mixed petroleum-degrading bacteria were acclimated in liquid phase by the model of "inducer-intermediate product-target pollutant",and used for treatment of simulated petroleum contaminated soil by Fenton oxidation-microbial method.The high-throughput sequencing results showed that Rhodanobacter sp.,Mycobacterium sp.and Rhizobiales sp.were the dominant bacteria.The experimental results indicated that:After 50 d of degradation,the removal rate of total petroleum hydrocarbon (TPH)in the soil samples by mixed bacteria was 13.4-20.5 percentage points higher than that by native bacteria;When the TPH content (w)were4％,8％,11％,the optimum H2O2 concentration for Fenton oxidation were 3,4,4 mol/L respectively (with 0.04 mol/L of Fe2+ concentration),the totalremoval rate of TPH were 88.8％,65.0％,47.7％ respectively,which were much higher than those by single Fenton oxidation or single microbial method.The degradation time was shortened and organic matters in soil were increased by the combined process.【期刊名称】《化工环保》【年(卷),期】2017(037)002【总页数】6页(P237-242)【关键词】专性混合石油降解菌;Fenton氧化;微生物法;石油烃【作者】韩旭;李广云;尹宁宁;许锐伟;王丽萍【作者单位】中国矿业大学环境与测绘学院,江苏徐州221116;中国矿业大学环境与测绘学院,江苏徐州221116;中国矿业大学环境与测绘学院,江苏徐州221116;中国矿业大学环境与测绘学院,江苏徐州221116;中国矿业大学环境与测绘学院,江苏徐州221116【正文语种】中文【中图分类】X53石油是一种重要的化石能源，伴随着石油的开采、运输、分离提纯等作业过程，引发了不同程度的环境污染。
石油降解菌的降解特性研究
Ｉ ２ ３柴油 降解 菌的 性 能 实验 ．．
将菌 悬液 按 ２ ％的接 种 量放入 两种 不 同无机 培养
本研 究 以柴 油 为 目标 污 染物 ，从油污 土 壤 中筛 选
出石 油烃 降解 菌 ，考 察菌 株 生长 、疏 水性 、产 表面 活
性剂 、脱氢 酶 活性 等 自身 降解 特 性 ，为该 菌株 在生 物 修复 的实 际应 用 中提供 依据 。
维普资讯
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８ ２７ 月 ・ ０ 年６ ０
油 气 田 环 境 保 护
治理技术与研究
石油 降解菌 的降解特 性研究
赵 敏 马宏 瑞
（． １ 陕西科技大学资源 与环境学 院；２ 南京大 学地球科 学系 ） ．
摘 要 以Ｏ ’ 柴油为唯一碳 源，对石油降解 菌Ｄ Ｐ Ｓ 菌的生长、疏水性、产表 面活性剂、脱氢酶活性及降解 能力进行研究。结果表明：Ｄ Ｐ Ｓ 菌在生长过程 中可产生糖脂类生物表 面活性剂，对石油烃的降解有很好的促进 作用， 其脱氢酶活性与降解率有较好的相关性。 当土壤 中柴油含量为Ｉ ％时， Ｏ 利用ＤＰ Ｓ 菌经过４ ｄ ０ 的处理（ ０℃， ３ ｐ值为６ ，油含量下降到Ｉ ８ ％，降解率最高可达６． ％。 Ｈ ） ．２ ５４ 关键词 微生物降解 疏水性 生物表面活性剂
广 泛进 展 ，但 很 多是对 外 界影 响因素 的研 究 。
１２ ２ 菌悬液 的制备 ．． 将 活 化 后 的 菌 液 在 ４０ ／ ｉ 条件 下 离心 １ ００ｒ ｍ ｎ ０ ｍ ｎ 去除 上 清 液 并用 Ｎ ｚＰ ａ ２０ 缓 冲 液 （． ｉ， ａ Ｏ—ＮＨＰ Ｈ ０２ ｍ ｌＬ Ｈ值为 ７０ 洗 涤 ２次 ，使 细胞 浓度 达 到 ｌ。 ｏ ／ ，ｐ ．） ０
低温石油烃降解菌LHB16的筛选及降解特性
已经 取得长 足发展 ，而我 国 与此相 关 的研 究则 刚起 步 。本 文就低 温石油 降解 微生物 的选 育 及 其降解 特性 进行 了报 道 。
的菌落在牛肉膏蛋 白胨固体平板上划线纯化 。
１４石 油含量 的测定 ．
采用 紫外 分光光 度法 测定 降解体 系 中残
油量。
ｌ 材 料 与 方 法
一
斜 面培养基 ： 肉膏 蛋 白胨 培养 基 。 牛 甘油保 存培 养基 ：０ 甘油 ： ５％ 种子 液 ＝１ １ ：， ２ ℃低温保 存 。 ５
１３降解菌 的富集 和筛 选 ． 取 １ ０ ｇ石 油 污染 土 样 加 入装 有 １ 富 ０ ｍｌ ０ 集培 养基 的 ２ ０ ｍｌ 角 瓶 中 ，０ ｏ １０ ｒｍ， ５ 三 ２ Ｃ，５ ｐ 摇床 培养 １ 。取 ｌ ｌ ０ｄ ０ｍ 富集 培 养液 同条件 培 养 ， 复二 次 。用 接种 环 蘸 取 富 集 液在 分 离 培 重 养基 上划线 分 离 。挑 取 生 长 速度 快 ， 长 良好 生
作者简介 ： 李兵 （９ ３一） 男， １８ ， 硕士 ，ｍａ ：ｎ７ ６ ＠１６ ｃｎ Ｅ ｉ ｃｙ５６ ２ ．ｏ ｌ
极端环 境微 生物是 目前微 生物 学研 究 的热 点 。低温菌 是极端 微生 物之 一 ， 据 其生 长 温 根
无 机 盐 培 养 基 ： ａ １ ０ ｇ Ｈ Ｃ ． ， Ｎ Ｃ ，Ｎ ４ １ ５ ｇ １ ０
大 连 大 学
低 温 石 油 烃 降解 茵 Ｌ Ｂ 筛 选 及 降解 特 性 Ｈ １ ６的
李 兵 张 庆 芳 ‘窦 少华 孙 子 羽 ， ， ， ， 王 羽 迟 乃 玉 ，
（． １ 大连大学生物 工程 学院，辽 宁 大连 １６ ２ ； １６２
微生物降解石油烃
唐山学院毕业设计设计题目：微生物降解石油烃最适条件研究系别：环境与化学工程系班级：09 石油化工生产技术2班姓名：张贺松指导教师：程磊2012年6月11 日微生物降解石油烃最适条件研究摘要从学校腐蚀质土囊中筛选到2株对机油等相关石油制品具有高效降解能力的菌种ZL1 ZL2。
通过生长条件正交实验测定了温度、油量和pH值对其降解能力的影响。
实验表明：4天对于含油300mg/L的去除率分别达到67.9%和76.2%，其中ZL2菌对底物浓度和PH值有较广的适应范围。
关键词：正交实验高效降解菌菌种筛选Microbial degradation of petroleum hydrocarbons in the optimum conditionsAbstractCorrosion from the school the quality of soil in the bag filter to the 2 strains of bacteria degrading ability of oil and other petroleum products ZL1 ZL2. Orthogonal experimental determination of the growth conditions of temperature, substrate concentration and PH value of their degradation ability. The experimental results show that: four days for oily 300mg / L, the removal rate of 67.9% and 76.2%, which ZL2 bacteria have a wider range of substrate concentration and pH value.Keywords：Orthogonal experiment Efficient degradation bacteria Strain screening目录1 引言 (1)1.1石油污染的危害 (1)1.2微生物法治理石油污染 (2)1.3微生物降解石油途径 (4)1.4微生物降解石油影响因素 (5)1.5各国对微生物降解石油烃的研究 (6)1.6微生物降解石油烃类污染物的代谢机制 (6)1.7微生物降解菌的种类 (6)2 试验 (8)2.1材料 (8)2.1.1菌种 (8)2.1.2 培养基 (8)2.1.3试验药品 (8)2.1.4试验仪器 (9)2.2 优势菌筛分试验 (9)2.2.1取样 (9)2.2.2 准备实验用品 (9)2.2.3制作培养基 (9)2.2.3 高温灭菌 (9)2.2.4 初次富集分离 (10)2.2.5 连续富集分离 (10)2.2.6 平板分离 (10)2.2.7 划线分离 (10)2.3生长条件正交实验 (10)2.4 混合菌机油降解效率 (11)2.5分析方法 (11)3结果分析 (12)3.1 优势菌筛分实验 (12)3.2生长条件正交试验 (12)3.3混合菌种实验 (13)4结论 (15)谢辞 (16)参考文献 (17)外文资料 (18)唐山学院毕业设计1 引言上世纪初以来,石油的重要性日益突显。
石油污染土中微生物的分离鉴定及降解特性
石油污染土中微生物的分离鉴定及降解特性石油污染是环境污染中的一种常见问题，对自然环境和人类健康造成严重影响。
因此，寻找高效的石油降解菌是解决这一问题的重要途径。
本文从石油污染土壤中分离鉴定了一株降解菌，并探究了其降解特性。
（1）样品的采集及处理从受污染的土壤中取样，再分离出单个菌株。
将样品加入到NaCl0.9%的生理盐水中，摇动15分钟后，离心上清，然后采用1%的蒸馏水进行0.5小时热灭菌。
（2）分离鉴定将上述处理后的样品，分别接种于处理好的LB及玉米精蛋白培养基中，置于30℃恒温振荡培养箱中培养48h。
在此基础上，通过对菌落形态、菌株生长速度、菌落气味、荧光反应、产酶等特征，对细菌进行鉴定。
最终，筛选出一株石油降解菌。
（3）降解特性分析选取某种石油类物质，将其加入到LB培养基中，最终浓度设置在30mg/L左右。
将选出的石油降解菌接种进去，接种数量为OD600=0.1。
进液管任意长度分别设置于接种前及接种后，能够记录pH值及菌量。
取样分析的样品保持30℃培养48小时，过程中定时测量液体的pH值。
分析降解特性时，发现石油降解菌能够将石油类物质中的碳链分解，并分解成细胞利用的有机物质。
在石油降解过程中，菌落数逐渐增加；液态培养基中pH值不断降低，并最终将其稳定在中性状态。
另外，菌落色素通过两次衍生化反应生成焦磷酸一茎丙酮醇酯，之后通过JB-4消失化学反应结晶，能够得到石油降解特性的分析结果。
综上所述，石油降解菌是一种能够有效降解石油类物质的微生物。
因此，在现实中，可以对这类石油降解菌进行大规模培养及应用，以降低环境中的石油污染。
石油污染物的生物降解机制研究
石油污染物的生物降解机制研究石油是现代社会的重要能源来源，然而，石油开采和使用过程中产生的污染物却给环境带来了巨大的威胁。
石油污染物的生物降解机制的研究对于环境保护和污染治理具有重要意义。
本文将重点讨论石油污染物的生物降解机制以及相关的研究进展。
一、石油污染物的种类及影响石油污染物主要包括原油、石油产品和石油废弃物等。
这些污染物的存在会对土壤、水体和空气产生严重的污染影响，导致环境生态系统的紊乱和生物多样性的丧失。
目前，人们主要关注的石油污染物有石脑油、苯、甲苯、二甲苯和苯并芘等。
二、石油污染物的生物降解机制石油污染物的生物降解是指利用生物体、微生物和酶等生物组分将石油中的有机物转化为无机物的过程。
生物降解可以通过多种途径进行，主要涉及到以下几个环节：1. 吸附和降解基因的表达生物体吸附石油污染物后，通过基因的表达来降解有机物。
这一过程涉及到一系列的代谢途径和酶系统，如脱脂酶、醌酸酶和过氧化物酶等。
这些酶可以将石油中的多环芳烃等有机物降解为低毒或无毒的物质。
2. 微生物共代谢通过微生物共代谢作用，多种微生物合作降解石油污染物。
微生物共代谢作用是指除了产生生物降解产物外，还产生了其他代谢物的过程。
这种方式能够提高降解效率，并进一步减少对环境的影响。
3. 微生物协同降解微生物之间的相互作用和协同降解在石油污染物的生物降解过程中起着重要的作用。
一些微生物在降解石油污染物时，通过分泌物和细胞间通信物质来促进菌群的协同作用，提高降解效率。
4. 生物修复除了微生物降解外，植物也可以通过吸附和转运等方式去除环境中的石油污染物。
植物的根系和叶片表面具有很强的吸附能力，在重金属和有机物的修复中发挥着重要作用。
三、石油污染物生物降解机制研究的进展近年来，随着对石油污染问题的关注度不断提高，科学家们对石油污染物的生物降解机制进行了广泛研究。
他们通过实验室模拟和野外调查等手段，探索了石油污染物的降解过程和机制。
1. 微生物种类和功能的研究科学家们通过分离和鉴定环境中的微生物，研究它们的降解能力和代谢途径。
高效石油降解菌的筛选、鉴定及其配比优化的研究
42工业安全与环保2013年第39卷第2期I ndust r i al Saf et y a nd Envi r onm e nt alPr o t ect i onFebr uary 2013高效石油降解菌的筛选、鉴定及其配比优化的研究*王旭辉晁群芳徐鑫李磊(新疆大学生命科学与技术学院乌鲁木齐830046)摘要从克拉玛依地区石油污染土壤中分离筛选出4株高效石油降解菌S 1、S 2、S5和s 8，经形态观察、生理生化反应和分子鉴定，确定4株菌分别为蜡样芽孢杆菌(Baci l l us cel ℃us )、恶臭假单胞菌(Ps eudom onaspLni ．da)、枯草芽孢杆菌(B aci ll us s ubf i l is )和地衣芽孢杆菌(B aci l lus l i eheni f oi m i s)。
为了提高对石油的降解效率，对4株菌的添加比例进行了响应面的优化。
结果表明，当石油含量为1．5g 时，菌种s1、S2、s5和s8接种量分别为0．21g,O ．22g ．0．41g 和0．22g 时的石油降解率达到最大值。
在该条件下石油降解率预测值为60．17％，验证值为60．10％。
关键词降解率筛选菌种鉴定响应面法石油污染St udyont he I s ol at i on and I den t i f i cat i on of Pet rol eum —-D egradi ngSt r ai nsandIt s R at i o O pt i m i za t i onW A N G Xuh ui C H A O Q anf 锄培X U X i nLIL e i(Col l egeof 啦Sci enceandTechnology ，Xinjio 曙Unim=豇y 蛳830046)A bs W actFou rst r ai ns (S1，S2，S5，S8)，w i t hgood abi li t y ofde g 丑di ng oil ，aIe i sol at ed f rom oi l —c ont ami nat i on s oil ofK ar a-m a yar eas ．Base do nm or phol ogi c obs er vat i on ，physi o l ogi c al a nd bi oc he mi ca l cha r act e r i st i cs ，m o l ecul ar i dent i f i cat i on ，t hey a_r ei dent i f i edasB aci l l us ce r eus ，B a ci l l u s l i ch eni f onni s ，B aci l l us s ub t i li s a ndPs eudom onas 叫dar espe ct i vel y ．I n or de r t o i m -pr ovet he ef l ％i ency of t he de gr ada t i o n ．t h e r ati o of f our s t l ai as i s opt i m i ze d by us i ng r e s pons e suI f i c e m et hodol ogy ．T he r esul ts how s t hat t he opt i m um con di t i o ns al easfol l ow s ：w hen t he oi lco nt enti s 1．5g a nd t he i nocul a t i on quant i t y of t he f o ur st r ai m(S1，眈，s5，S8)i s0．21g ，0．22g ，0．41g ，0．22g ，r espect i vel y ，t he r at e of oi l de gr a da t i onPA t hr e ac h t hem s ．x 抽um ．U ndert he se cond i t i ons ，t he pr e di ct i ve va l ue of oil de gr ada t i on i s 60．17％，m e a nw hi l e t he ver i f i cat i on va l ue is 60．10％．K eyW or dsde ge ner at i on r at ei sol at i onst rai m i dent i fi cat i onre s pons e sur f ac e met hod ol og y oi l —c ont am i nat i on0引言随着工业的发展，石油及其制品通过开采与运输过程的泄漏、污染水灌溉及大气飘尘的沉降等途径进入了环境，对土壤和水体造成严重的污染。
含油废水处理中石油降解菌的筛选及其降解条件优化
含油废水处理中石油降解菌的筛选及其降解条件优化郭倩瑜;张建民;李蓉蓉【摘要】为筛选出高效含油废水降油菌,更好地利用生化法治理含油废水,从咸阳市中国石油长庆石化公司污水处理站采取水样,经过菌种的驯化、分离纯化得到17株石油降解菌,其中细菌13株,其余为放线菌或霉菌.经过30℃、180±2r/min恒温摇床振荡培养7d后筛选出2株优势石油降解菌:GA-4菌为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、GA-6菌为不动杆菌属(Acinetobacter sp.).在油浓度为2g/L时降油效果最好,GA-4菌与GA-6菌的降油率分别为41.18％,34.82％.GA-4菌与GA-6菌的最优降解条件分别为:30℃,pH为8.0,接种量为5％;28℃,pH为7.5,接种量为5％.【期刊名称】《纺织高校基础科学学报》【年(卷),期】2016(029)002【总页数】6页(P269-274)【关键词】石油化工废水;降油菌;降油率;生化处理【作者】郭倩瑜;张建民;李蓉蓉【作者单位】西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048;西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048;西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048【正文语种】中文【中图分类】X172众所周知,石油是当今现代化工业生产中最重要的自然资源之一,且在未来几十年内依然是最主要的能源以及化工原料[1].近些年,石油的大量开采及其化工产品的生产应用,给人类带来了严重的环境污染和生态破坏.目前，石化废水的处理方法主要有物理法(吸附法、气浮法、膜滤法)、化学法(电絮凝、湿式氧化法、电解氧化法、臭氧催化氧化法)及生物法(好氧法、厌氧法)[2].而生物法具有降解效果好、人力物力投入小、无二次污染等优点，且处理费用明显低于物化法，目前普遍应用于石化废水处理[3].早在1978年,中国科学院对石油污染区域的降油微生物就进行了研究,并分离得到126株细菌和71株真菌,其中60%的细菌菌株和89%的真菌菌株具有脂酶活性[4].目前已发现约有100余属200多种微生物可以降解石油烃类,包括细菌、真菌、放线菌及藻类,其中细菌、真菌对石油的降解效果较好.由于降油细菌的数量庞大,在实际应用中主要以细菌类为主[5-7].如何提高菌株的降油率已成为生化法治理石油废水的研究热点.黄敏刚等[8]分别从新疆油田、大庆油田含油污水中分离得到2株高效石油降解菌,并对混合菌的降解效果及影响因素进行了探讨.梁生康等[9]分析了单菌株和混合菌株的降油率情况以及不同含油量对其降油率的影响，并通过模拟实验考察混合降油菌对胜利油田孤岛采油废水处理效果.史利荣等[10]对石油化工废水处理中活性污泥的微生物菌群及其降解效果进行了研究，结果表明不动杆菌属为活性污泥中的最优势菌属，芽孢杆菌属次之，且均具有较好的降解效果.本文从中国石油长庆石化公司污水处理站采集水样，对菌种进行驯化、分离纯化，筛选出优势菌种并对菌种鉴定到属.通过研究培养时间、含油量、pH、接种量及温度对降油率的影响，得出优势菌种的最优降解条件.咸阳市中国石油长庆石化公司污水处理站的处理能力为370m3/h,废水来源为工业废水和厂区内生活污水.根据《水和废水监测分析方法》(第四版)中水样的采集与保存方法采集水样，原油由该站提供，菌种取自该站曝气池及隔油池,用500mL的清洁无菌玻璃瓶采集活性污泥泥水混合液及污水水样[11].1.1 培养基(1) 无机盐培养基(原油为唯一碳源) 原油,K2HPO4 2.0g,KH2PO41.5g,NH4NO32.0g,无水Na2SO4 0.5g,微量元素液10mL,蒸馏水1 000mL,pH值7.0～7.4,121℃高压蒸汽灭菌20min备用;固体培养基再加入15～18g琼脂.其中，微量元素液组分为MgSO4·7H2O 2g,无水CaCl2 1g,FeSO4·7H2O 1g,ZnSO4·7H2O0.5g,CuSO4·5H2O 0.1g,蒸馏水1 000mL．(2) 富集、纯化培养基NaCl 5g,牛肉膏3g,蛋白胨10g,蒸馏水1 000mL, pH值7.0～7.4,121℃高压蒸汽灭菌20min备用;固体培养基再加入15～18g琼脂.1.2 菌种的驯化、分离纯化和鉴定取2mL泥水混合液/污水水样于100mL灭菌原油无机盐培养基(原油质量浓度为1g/L)中,30℃，180±2r/min摇床振荡培养8d后取2mL上述培养液于新鲜的原油培养基(原油质量浓度逐次增加为:2，3，4g/L)中再次培养8d,如此驯化4次.通过不断提高初始含油量来强化菌株的降解性能.取每次驯化后的菌悬液1mL在无基盐固体培养基上做稀释平板,30℃培养箱中培养3～5d后从上述培养皿中挑取生长良好的不同的单菌落,在纯化培养基上反复划线,直到得到单一菌种为止.最终分离得到2株优势石油降解细菌.通过查阅《常见细菌系统鉴定手册》[12]并利用16S rDNA基因序列法鉴定菌种，得到GA-4为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),GA-6为不动杆菌属(Acinetobacter sp.). 2.1 确定石油醚溶液标准曲线方程将原油配制成70mg/L的石油醚溶液,以溶剂石油醚为空白样进行光谱扫描,绘制扫描光谱曲线如图1.由图1可知原油溶液有两个吸收峰:224nm和242nm.由于在波长224nm处溶剂对吸光度有一定的干扰,吸光值无法趋于稳定,而在波长242nm处吸光值保持稳定,所以最适测定波长选为242nm.采用紫外分光光度法测定降油率[13],以石油醚为溶剂将原油配成质量浓度分别为0，10，20，30，40，50，60，70mg/L的溶液，以石油醚为空白对照，在波长242nm处测定各溶液的吸光度值分别为0，0.179,0.344,0.52,0.681,0.853,1.022,1.227.得出油含量-吸光度值曲线方程:y=0.017 3x-0.000 6,R2=0.999 4.2.2 制备菌悬液将纯化好的各菌种挑取一环分别接种到35mL灭菌富集培养基中,30℃，180±2r/min摇床振荡培养,根据菌种的生长曲线来确定菌剂的培养时间,一般选用对数期末期作为菌剂培养时间,此时细菌的菌体量趋于最大且代谢活力较强[14]. 将菌悬液离心分离后得到菌体,在无菌条件下用无机盐培养液将菌体调为同一吸光度值的种子菌液.2.3 菌种降油率的测定取种子菌液1.5mL加入到50mL原油无机盐培养基中,以不加菌的摇瓶做为空白对照,30℃，180±2r/min摇床振荡培养7d.之后加入石油醚对残余石油进行萃取，每次加入量为10mL,共萃取3次，随后将萃取液混合.采用高速离心法将萃取液在5 000r/min条件下将石油醚溶液和水分离,以去除萃取液中残余水分.用石油醚将各组萃取液调为同一容量体积,取1mL萃取液加入到50mL比色管中,加石油醚到刻度线并充分摇匀.以石油醚作为对照,在波长242nm下测定吸光度，对照标准曲线求出各菌株的石油降解率.计算公式为式中，η为降油率(%),c0为空白摇瓶中剩余石油含量(g/L),cx为各摇瓶中剩余石油含量(g/L).3.1 菌株的生长曲线在富集培养基中分别接种一环GA-4菌、GA-6菌,30℃、180±2r/min摇床振荡培养,每隔一段时间测定菌剂的OD600值(溶液在600nm波长处的吸光值),利用菌体的吸光度来反应细菌培养液的浓度,见图2.由图2可知GA-4菌、GA-6菌分别在45h,15h达到对数期末期,所以分别选取此时作为种子菌液的培养时间.3.2 培养时间和含油量对降油率的影响经过7d摇床振荡培养后，测定不同培养时间和不同含油量条件下的降油率.由图3可知,随着培养时间的延长菌体对原油的降油率也在不断增加,同时GA-4菌、GA-6菌的降油速度随时间延长而逐渐减慢.当初始含油量为2g/L时,GA-4菌、GA-6菌的降油效果最好,7d的降油率分别为41.18%,34.82%;而当初始含油量≥2g/L时，GA-4菌、GA-6菌的降油率则随着油浓度的增加而降低:说明当初始含油率浓度大于2g/L时，随初始含油率浓度的增加，菌体的降油率不断减小.可见高浓度的石油烃对微生物的代谢生长有抑制作用,而少量的石油污染物反而会刺激降油微生物的生长[15].3.3 降解液pH对降油率的影响微生物对石油废水处理的最适pH值通常为中性7.0左右,也有相关文献报道很多石油烃降解菌的最适pH值偏弱碱性,略大于7.0[16].调节无机盐培养基(含油量为2g/L)的pH值分别为6.0,7.0,8.0,9.0,摇床振荡培养7d后测定不同pH值下的降油率.由图4可知,GA-4菌、GA-6菌的最适pH值分别为8.0，7.5.此时的降油效果最好,降油率分别为44.3%，36.8%.当pH值过高或过低时,溶液中H+或OH-浓度过高,引起微生物原生质膜的电荷变化,从而降低了微生物酶的催化反应和对营养物质的吸收,最终抑制了菌体的生长繁殖,使降解率变低[17].3.4 菌体接种量对降油率的影响将体积浓度分别为1%,2%,3%,4%,5%,6%的GA-4菌与GA-6菌加入无机盐培养基(含油量为2g/L)中,摇床振荡培养后测定不同接种量条件下的降油率.由图5可知当接种量小于5%时,随着菌体接种量的增加降油率也在不断增加;当GA-4菌、GA-6菌的接种量大于5%时,菌体的降油率随着接种量的增加开始降低,所以GA-4菌、GA-6菌的最优接种量为5%.3.5 降解温度对降油率的影响一般情况下,微生物的合适降解温度在20℃～30℃之间,在此范围内对石油烃的降解效果随着温度的提高而增大.温度过高或过低均会降低降解效果.合适的环境温度可以促进微生物体内酶促反应的快速运行,同时,温度决定了石油的物理状态,从而影响到微生物与石油碳氧化合物分子之间的相互作用,进而影响了生物降解速率.将GA-4菌、GA-6菌加入无机盐培养基(含油量为2g/L)中.摇床振荡培养7d,温度条件为15℃,20℃,25℃,30℃,35℃,测定其降油率.从图6可知GA-4菌、GA-6菌的最适降解温度分别为30℃，28℃.当温度小于30℃时,降油率随温度的升高增大;当温度大于30℃时,降油率随温度的升高有所减小.可能是因为随着温度的升高,水中溶解氧浓度降低,从而抑制了菌体的新陈代谢,使降油率变低.3.6 降解前后对照以不加菌的原油无机盐培养基摇瓶为对照样.对比可以看出，GA-4菌、GA-6菌摇瓶中菌液由原来的无色透明液体变为乳黄色,说明摇瓶中的菌体浓度增大;摇瓶中的原油量减少,已无油颗粒存在,乳化效果很好,原油降解效果明显.(1) 通过菌种的初筛、复筛分离得到2株优势降油菌,经初步鉴定GA-4菌为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),GA-6菌为不动杆菌属(Acinetobacter sp.).(2) 对GA-4菌、GA-6菌进行降解条件优化,GA-4菌、GA-6菌的最优化降解条件分别为:30℃,pH为8.0,接种量为5%;28℃,pH为7.5,接种量为5%.(3) 与不加菌的摇瓶对照比较,GA-4菌、GA-6菌摇瓶中菌液由无色透明液体变为了乳黄色,摇瓶中的原油量明显减少,已无油颗粒存在,原油降解效果明显.【相关文献】[1] ZHANG Shujing.On problems in rare earth exports of China and counter measures[J].International Business and Management,2013,6(1):21-25.[2] 朱亦仁.环境污染治理技术[M].北京:中国环境科学出版社,1996: 76-90.ZHU Yiren.Environmental pollution treatment technology[M].Beijing:China Environmental 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石油高效降解菌的筛选及其降解特性
分 离培 养基 ： 油培养 基 １０ ０ｍＬ， 油 ０ ６ｇ 琼脂 ２ ． 降 ０ 原 ． ， ０ｇ
１ ３ 菌悬 液 的制备 ．
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第３ ８卷 第 ６期 ２０ ０ ６年 １ ２月
西 建 科 大 学 安 筑 技 学 报（然 学 ） 自 科 版
Ｊ ｘｉａ ｉ．ｏ ｃ ．８ ｃ ． Ｎａｕａ Ｓ ｉ ｃ ｄｔ ｎ ． ’ ｎ Ｕｎ ｖ ｆＡｒ ｈ Ｌ Ｔｅ ｈ （ ｔｒｌ ｃ ｎｅＥ ｉｏ ） ｅ ｉ
干燥器 内备 用． １ ２ 培养 基 ．
富集培 养基 （ 富集 培养 基一 般使 用 牛 肉膏 蛋 白胨培养 基 ）－ ： 肉膏 ５ｇ 蛋 白胨 １ ， Ｃ １ ｇ 蒸 ６牛 ］ ， ０ｇ Ｎａ ５ ， 馏 水 １０ ０ｍＬ，Ｈ７２ ． ， 配制 固体培 养基 需另 加入 ２ 脂． ０ ｐ ． —７４ 若 ０ｇ琼 降油培 养基［ ＮＨ４ ３２ｇ Ｏ４１ ５ｇ ＫＨ２ Ｏ ， Ｓ ： ＮＯ ，Ｋ ＨＰ ． ， Ｐ ４３ｇ Ｍｇ Ｏ４・７ Ｏ ０ １ｇ Ｈ２ ． ，无 水 Ｃ Ｃ２ ａ１
存 在试 料袋 中 ， 以备试 验使用 ． 试验所 用 油样 为长 庆油 田的 原油 ， 原油 用石 油醚 （ｏ ６ ￣ 将 ３ － ｏＣ沸程 ） 溶解 ，
石油降解菌群构建的研究
ＹＢ ３ ， 萘 降解 菌有 Ｃ ３ 、 ＹＣ ３ ， 石蜡 降解 菌有 Ｄ４ ， 表 面 活
性 剂产 生 菌 Ｄ ４ 。种 子 培 养 基 ： 牛 肉膏 ３ ｇ ， ａ ＮＯ 。１
ｇ， （ Ｎ Ｈ４ ） ２ Ｓ Ｏ４ １ ｇ ， Ｎａ ２ ＨＰ Ｏ４ １ ．２ ｇ， ＫＨ ２ ＰＯ４ １ ｇ ，
１ ． ２ 组 合 方 案
前 期 实 验 所 获 得 的 优 良菌 株 中 原 油 降 解 菌 有 Ａ５ 、 Ａ６ 、 ＹＡ５ 、 Ｙ Ａ６ ， 十 六 烷 降解 菌 有 Ｂ ３ 、 Ｙ Ｂ ３ ， 萘 降 解 菌有 Ｃ ３ 、 ＹＣ ３ ， 石蜡 降解 菌 有 Ｄ ４ ， 表 面 活 性剂 产 生 菌Ｄ ４ 。首 先将 不 同功 能 的菌 株 组 合 ， 组 合 方 案 见 表
降解 一种 或 多 种石 油 烃 类 。而 菌 群 构 建 可 以组 合 多 个单 种微 生 物降解 能力 形成 一 个完 善 的 降解 系 统 ， 集 合多 种酶 促 活性 ， 扩 大底 物 范 围 ， 因 此 利 用 菌 群 的 协 同作 用至 关重 要ｌ ２ ］ 。菌 群 生 物 强 化 的优 势 在 于 组 成 菌群 的优 势 菌种在 生 理功 能和 遗传 信 息 上 的互 补性 ， 总体 上更 高效 ， 更 稳定 、 配置 更 合理 、 功 能 更完 善 的 菌 群替代 活 性较 低 的单种 和土 著 菌群 ， 从 而 提 高 降解 活 性， 促 进 生物 降解 ＿ ３ ］ 。 目前对 菌 群 的研 究 还停 留在 初 步 阶段 ， 即将几 种 优 势 菌 简 单 地 混 合 ， 组 建 菌群 的 过
有 时甚 至 因 为 种 间 的 抑 制 作 用 而 产 生 负 面 效 应 ］ 。
高效石油降解菌株的筛选及菌群的构建
高效石油降解菌株的筛选及菌群的构建徐志霞;张颖;金显敏;梁晨;李丹;金映虹【摘要】从海南澄迈油井周围污染的土壤中采集样品，以原油为唯一碳源，经初筛、复筛得到13株具降解石油性能的微生物，其中J-2、J-4、J-12、J-13菌株在培养10 d后，其石油降解率分别可达到27.92％、37.36％、30.98％和14.10％.选择这4株菌进行2株菌、3株菌、4株菌的混合培养，构建了11个降解石油的微生物体系，研究发现J-2与J-4混合菌群降解效果最好，高达71.58％，明显优于其他的混合菌群体系和单菌株的降解效果.根据形态学观察和生理生化特征对这4种菌株进行鉴定，初步确定为粉红头孢霉属（Cephaesosp），青霉属（Penicillium），链霉菌属（Streptomyces）和黄单胞菌属（Xanthomonas）.%Four strains of high efficient oil degrading which could take used of petroleum as sole carbon source were isolat⁃ed from Hainan Chengmai, and marked as No. J-2, J-4, J-12 and J-13. After incubation for ten days, every strain’s degra⁃dation rate of petroleum was 27.92%,37.36%, 30.98%, and 14.10%respectively. In the further exploration of mixed cul⁃ture of two bacteria, three bacteria or four bacteria, 11 microbial systems of degradation petroleum had been built. The re⁃sults showedthat the degradation rate of system No. J-2 and J-4 could reach 71.58%, which had the most efficient degrad⁃ing than any other systems or single strains in this study. These strains were preliminary identified as Cephaesosp, Penicilli⁃um, Streptomyces and Xanthomonas by physiology and biochemistry research.【期刊名称】《海南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(000)004【总页数】4页(P421-424)【关键词】石油;高效降解;筛选;菌群构建【作者】徐志霞;张颖;金显敏;梁晨;李丹;金映虹【作者单位】海南师范大学生命科学学院，海南海口 571158;海南师范大学生命科学学院，海南海口 571158;海南师范大学生命科学学院，海南海口 571158;海南师范大学生命科学学院，海南海口 571158;海南师范大学生命科学学院，海南海口 571158;海南师范大学生命科学学院，海南海口 571158【正文语种】中文【中图分类】Q939.9石油是含有各种芳香烃、烷烃、环烷烃成分的一种复杂混合物，是古代海洋或湖泊的生物经过漫长的演化而形成的一种化石燃料［1-2］.目前，石油及其提炼品（汽油、煤油、柴油等）在人类生产和生活中扮演着极其重要的角色，因此被人们称为“工业血液”［3］.当今能够替代石油的新型能源由于成本高等原因尚未能广泛应用，因此人们对石油的需求量仍然居高不下［4］.然而石油在开采、运输、装卸、加工和使用过程中，对环境造成严重污染，产生致癌物，污染土壤、地下水源、海洋环境等，危害人类健康.传统的石油污染治理方法主要为物理和化学方法，但其治理效果不佳，耗资巨大，并残余大量有毒物质于自然环境中，因此微生物修复技术（Bioremediation）以其经济、安全、效率高、适用范围广和无明显的二次污染等显著优点［5］越来越引起人们的关注.大多数未污染土壤的复杂微生物群落都含有天然降解石油的微生物，这种固有的特性使大多数土壤具有很大的石油降解能力［6］.大量的研究表明，在生物圈中，可以降解石油污染物的微生物超过100余属，200多个种，分属于霉菌、酵母菌、细菌、放线菌等［7］，其降解菌种类十分丰富，具有菌种的多样性.但是石油组成成分复杂，很难实现只靠一种微生物即可对其污染物实现完全降解.本研究通过对石油污染土壤样品进行筛选，得到4株高效石油降解菌株，根据形态学观察和生理生化特征初步鉴定为粉红头孢霉属（Cephaesosp）、青霉属（Penicillium）、链霉菌属（Streptomyces）和黄单胞菌属（Xanthomonas），并以此为基础进行石油降解微生物菌群的构建及研究，进一步提高降解效率，达到更高效降解石油的目的.1.1 材料1.1.1 实验材料原油及土样均采自海南澄迈油井.1.1.2 培养基原油培养基：NH4NO31.0g，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O0.2g，CaCl20.02g，Na2EDTA·2H2O 0.02g，FeCl30.05g，蒸馏水1000 mL，pH7.4，分装时每50 mL培养基加1 mL原油.固体平板培养需另外加入2%琼脂. 1.2 方法1.2.1 石油降解菌的富集培养和分离纯化［8］将5 g（干重）石油污染土壤接入45 mL原油培养基中，30℃，180 r/min恒温摇床上富集培养7 d.取培养液在原油平板培养基上进行划线分离，同时取适量菌液进行稀释，在原油平板培养基上涂布分离，将培养皿置于30℃培养箱中进行培养，定期观察.另外，将富集培养液按10%的比例接入新鲜的原油培养基中，相同条件下进行第二次富集培养，同样操作进行3次，每次的富集培养液都经过划线和平板稀释分离.3次富集培养之后，观察平板上长势良好的优势菌株，选取形态特征一致的单菌落，并分别接种于相应的牛肉膏蛋白胨培养基、查氏培养基、高氏Ⅰ号培养基、马铃薯培养基中，进行多次划线分离，纯化得到单菌后斜面保存.1.2.2 高效石油降解菌的筛选将分离纯化得到的具有降解石油能力的13株菌株，分别接种至含50 mL原油培养基的三角瓶中，接种量为1 mL，以不接种的原油培养基作空白对照组，30℃，180 r/min振荡培养10d.培养结束后采用重量法测定每株菌的石油降解率［9］.降解率=（m3-m2）/m1×100%m3为对照组的残余油量，m2为降解后的残余油量，m1为最初的含油量.1.2.3 高效石油降解体系的构建通过筛选得到4株高效石油降解菌，分别接种至含50 mL原油培养基的三角瓶中，30℃，180 r/min振荡培养24 h，制备一定浓度的菌悬液，接种于装用原油培养基的三角瓶（装液量50 mL/250 mL）中，每株菌接种量均为1 mL，30℃，180 r/min振荡培养10d.培养结束后测定每个微生物降解体系的降解率，选出较佳的降解体系.1.2.4 高效石油降解菌的初步鉴定根据菌株的形态特征和生理生化特征，参照伯杰氏细菌鉴定手册［10］、常见细菌系统鉴定手册［11］、常见真菌鉴定手册［12］，对分离得到的石油降解菌进行初步鉴定.2.1 石油降解菌的富集培养和分离纯化从海南省澄迈采集的石油污染土样通过原油培养基的3次富集培养后，挑选生长良好的优势菌株，分离纯化得到具有较好石油降解能力的细菌8株，霉菌4株及放线菌1株，共计13株菌株.2.2 高效石油降解菌的筛选将富集分离纯化得到的13株菌株，并分别接种于原油培养基中培养，与未接菌的空白对照组进行对比，观察培养液的颜色、混浊程度及分层现象等变化.培养前，培养液上下层呈黑褐色和乳黄色.培养后，培养液出现三种情况：图1-A，培养液分为3层，由上往下依次为残余石油油膜、褐色絮状物和浅褐色溶液；图1-B，培养液颜色澄清透明，分散着明显的真菌丝状菌落，菌体中间呈深褐色；图1-C，培养液无明显变化.进一步对13株菌进行石油降解率的测定（见表1），其中J-2、J-4、J-12、J-13编号的菌株降解率较高，分别为27.92%、37.36%、30.98%、14.10%，挑选这4株菌株用以构建降解菌群.2.3 石油降解菌的菌群构建将筛选获得的具有高效降解石油性能的菌株J-2、J-4、J-12、J-13进行不同的组合，分别2株菌、3株菌和4株菌混合，等比例接种培养，构建不同的微生物降解菌群，并检测其石油降解率，通过与单菌株的降解率比对，研究不同降解体系的降解效果（见表2）.根据表2的降解率可初步判断，不同菌株构成的降解菌群相对于单菌株而言，降解率有的升高，有的降低，这可能是由于不同菌株之间的相互作用导致的.其中由菌株J-2和J-4的混合降解组降解效果较其他组高，在装液量50 mL、石油浓度为2%的培养基中，10 d后其石油降解率可达到71.58%，较单菌株中降解效果最好的J-4的降解率提高近一倍.2.4 高效石油降解菌的初步鉴定对J-2、J-4、J-12、J-13进行鉴定，其菌落形态特征见表3，菌体形态见图2，可初步判断J-2、J-4为真菌，J-12为放线菌，J-13为细菌.其中，J-13的染色结果表明该菌为革兰氏阴性细菌.对J-12和J-13进行了生理生化特征试验，其结果见表4.根据上述实验结果，参照参照伯杰氏细菌鉴定手册［10］、常见细菌系统鉴定手册［11］、常见真菌鉴定手册［12］，初步鉴定J-2为粉红头孢霉属（Cephaesosp），J-4为青霉属（Penicillium），J-12为链霉菌属（Strepto⁃myces），J-13为黄单胞菌属（Xanthomonas）.随着国内外经济的发展，随着原油的开采量不断上升，由此引起的土壤及海洋石油污染日益加剧. 20世纪80年代末，美国在短时间内利用生物修复技术成功清除了油轮石油泄漏的污染物，开启了生物修复技术的研究，也引发石油污染微生物降解的讨论［13］.在本研究中以海南澄迈油井附近被石油污染的土壤为样品，利用石油为唯一碳源的培养基富集纯化得到的13株菌，经过筛选获取降解效果较好的4株菌，分别为J-2、J-4、J-12、J-13，在装液量50 mL、石油浓度为2%的培养基中，10d后其石油降解率可达到27.92%、37.36%、30.98%、14.10%.由于石油成分复杂，依靠单一的微生物无法彻底完成石油的降解，需要通过具有不同降解功能的微生物共同作用，才可能实现石油污染物的完全降解［14］.本研究对筛选得到的4株菌进行2株菌、3株菌、4株菌混合培养，构建了11个降解石油的微生物体系，通过与单菌株降解率比较，发现J-2与J-4混合菌群降解效果最好，可将降解率提高至71.58%，明显优于其他的微生物体系的降解效果.根据形态学观察和生理生化特征对这4种菌株进行鉴定，初步确定为粉红头孢霉属（Cephaesosp），青霉属（Penicillium），链霉菌属（Streptomyces）和黄单胞菌属（Xanthomonas）.本研究组将进一步研究培养温度、pH、盐度、时间等对菌株降解能力的影响，通过改变不同菌株在微生物系统中的比例构成，使微生物降解系统达到更好的降解效果.【相关文献】［1］张光宇.SBR工艺污水处理厂抗石油污染物冲击强化处理技术研究［D］.山东：青岛理工大学，2010.［2］陆昕.产表面活性剂石油降解菌的选育及对陕北石油污染土壤生物修复的试验研究［D］.陕西：西北大学，2010.［3］林标声，陈雪英，江胜滔，等.土壤中高效石油降解菌的筛选及其降解特征的研究［J］.福建师范大学福清分校学报，2010，98（2）：11-16.［4］张磊.中国石油安全分析与对策研究［D］.天津：天津大学，2007.［5］邵宗泽，许晔，马迎飞，等.2株海洋石油降解细菌的降解能力［J］.环境科学，2004，25（5）：133-137.［6］阮志勇.石油降解菌株的筛选、鉴定及其石油降解特性的初步研究［D］.北京：中国农业科学院，2006.［7］贾燕，伊华.石油降解菌株的筛选、初步鉴定及其特性研究［J］.暨南大学学报，2007，28（3）：296-301.［8］李超敏，王加宁，邱维忠，等.高效石油降解菌的分离鉴定及降解能力的研究［J］.生物技术，2007，17（4）：80-82.［9］张鹏.石油降解菌的分离、鉴定及降解特性的研究［D］.山东：山东师范大学，2006.［10］R.E.布坎南，N.E.吉本斯.伯杰.细菌鉴定手册（第八版）［M］.北京：科学出版社，1984：1037-1161.［11］东秀珠，蔡妙莫.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京：科学出版社，2001：128-180. ［12］魏景超.真菌鉴定手册［M］.上海：上海科技出版社，1979：132-135；491-495.［13］刘晓春，阎光绪，郭绍辉，等.微生物降解土壤中石油污染物的研究进展［J］.污染防治技术，2007，20（6）：51-54.［14］李宝明，阮志勇，姜瑞波.石油降解菌的筛选、鉴定及菌群构建［J］.中国土壤与肥料，2007（3）：68-72.。
石油降解菌株的筛选及鉴定
Ｆｕｓ ｈｕｎ Ｌｉ ｎｉ ａｏ ｎｇ ３ １１ ００１， ． Ｒ． Ｃｈｉ ａ） Ｐ ｎ
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石油类污染物降解基因工程菌的构建及应用
基因工程菌的构建结构图
石油类污染物降解基因工程菌的构建的发展
人物 方法 优点 缺点
Chakrabayty
能够同时降解脂肪 在同一菌株中植入 烃、芳烃、萜和多 降解乙烷、辛烷和 环芳烃，且降解石 癸烷，降解二甲苯， 油的速度快、效率 降解萘和分解樟脑 高，在几个小时内 的4种假单胞菌的不 能降解完海上溢油 中2/3的烃类，而自 同质粒，由此得到 的工程菌 然菌种则需要用一 年多的时间 用染色体DNA转化 原生质球的方法， 构建了一株处理含 PTA废水的工程菌 LEY3 同时降解PTA、萘、 苯 甲酸、十六兢、 乙二醇和甲醇6种化 合物
研究工物技术工程治理环境污染的安全性怎样； 2. 如何将生物降解修复技术与物理化学处理方法组 成统一的技术体系； 3. 如何确定生物修复技术彻底降解污染物所需要的运 行周期 ； 4. 怎样保证微生物与污染物有良好的接触，使污染 物能被微生物迅速降解 ； 5. 是否可以建立有关生物修复技术应用的、统一的评 价程序和标准。
但受融合子的耐酸 性能改进 不大的 影响，与JD亲本菌 比较接近，只能在 pH为6－10的环境 中产生多糖。
李焕杰等
在实际的柴油脱硫 通过构建血红蛋白 试验中，工程菌的 基因表达质粒并电 生长速率较高且最 脱硫率为69.19%， 击导入德氏假单胞 大脱硫活性提高了 而原 始菌为 菌中，得到基因工 214倍 57.12%，两者相差 程菌 不明显。
但质粒容易丢 失或 转移， 遗传稳定性 差
李尔炀
但供体基因进入细 胞后随机整合到受 体染色体上，导致 各供体基因所获启 动子活性不同，由 此造成各基因之间 表达强度不同
人物
方法
优点
缺点
宋绍富等
融合子进行多次传 代 培养优选， 最 采用原生质体融合 终获得了9株遗传 技术 性状稳定和代谢多 糖性能优异的融合 菌。
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几株石油烃降解菌的研究易力;押辉远;李迪;张祥胜【摘要】对从胜利油田的石油污染土壤中分离出的5株细菌进行降油能力的初步评价发现,石油烃降解率分别为48.7％、43.2％、38.2％、51.4％和39.4％；对这5株菌通过形态特征和生理生化特征进行分类学鉴定发现,5种菌分别属于假单胞菌属、红球菌属、芽孢杆菌、放线菌属和微球菌属.最后研究了这5株菌在不同盐度和pH条件下的生长状况,为石油烃降解菌的应用提供了依据.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2011(038)006【总页数】3页(P165-167)【关键词】石油污染土壤;生物修复;石油烃降解菌【作者】易力;押辉远;李迪;张祥胜【作者单位】洛阳师范学院生命科学系,河南洛阳471022;洛阳师范学院生命科学系,河南洛阳471022;洛阳师范学院生命科学系,河南洛阳471022;山东大学微生物技术国家重点实验室,山东济南250100【正文语种】中文【中图分类】X131.3随着石油工业的发展，石油在开采、运输和使用过程中的泄漏以及含油废弃物排放引起的土壤污染问题日益严重，石油污染土壤的修复技术研究日益受到人们的重视。
在诸多石油污染土壤的治理方法中，生物修复由于具有经济、有效以及对环境破坏性小等优点而被认为具有广阔的应用前景[1]。
石油污染土壤的生物修复，是指利用微生物及其他生物将存在于土壤、地下水和海洋中的有毒有害的石油污染物现场降解成CO2和H2O或转化为无害物质的工程技术系统[2]。
分离筛选对石油具有较强降解能力的菌株，是研究细菌降解石油的机理及对污染水域或土壤进行生物修复的基础。
本研究对从胜利油田的石油污染土壤和油泥沙中分离和筛选出的降解石油烃的微生物进行降解石油烃评价，对筛选出的高效石油烃降解菌株进行鉴定，根据形态特征和生理生化特征进行分类学鉴定，并研究其最适生长条件，以期为生物修复石油污染土壤提供菌种资源，并为降解石油烃微生物的生长提供最佳条件。
1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 试验仪器 QYC-2102大容量双层全温摇床（上海新苗医疗器械制造有限公司）、奥特光学BK5000生物显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司）、SW-CJ-2F 型双人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司）、FA2104A电子天平（上海精天电子仪器有限公司）、LD2X-40KB立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、SPX-250BS-Ⅱ生化培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）、PHS-25（数显）pH计（上海精密科学仪器有限公司）、UV-1100S紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）。
1.1.2 菌株 5株分解石油的微生物分离自山东胜利油田石油污染土壤，编号为A、B、C、E、G。
菌株由长江大学生命科学学院提供。
1.1.3 试剂草酸铵结晶紫染液；路哥尔氏碘液；95%乙醇；0.5%沙黄染液。
1.1.4 培养基（1）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 15 g，琼脂 15～20 g，蒸馏水 1 L，pH 7.2～7.4。
（2）LB 培养基：胰蛋白胨 10 g，酵母膏 10 g，NaCl 15 g，蒸馏水 1 L，pH 7.2。
（3）无机盐培养基：大量元素液：MgSO4·7H2O 0.40 g，CaCl2·2H2O 0.02 g，KH2PO41.00 g，K2HPO41.00 g，NH4NO31.00 g，FeCl30.05 g，酵母膏 1.00 g，微量元素液2 mL，蒸馏水 1 L，pH 7.2；微量元素液：MnSO460 mg，ZnSO4·7H2O 200 mg，蒸馏水 1 L。
（4）降油培养基：无机盐培养基+5%原油，pH值7.2。
（5）淀粉水解培养基（淀粉水解用）；葡萄糖蛋白胨培养基（VP和MR试验用）；西蒙斯氏柠檬酸盐培养液（柠檬酸盐利用实验用）；生化反应管（吲哚试验、尿素分解、明胶液化、七叶灵水解、硫化氢分解、葡萄糖利用、乳糖利用、蔗糖利用）。
1.2 试验方法1.2.1 石油降解率的测定在150 mL液体无机盐培养基中接种石油降解菌，接种量为培养液体积的0.5%。
并加入 5%原油，经摇床培养（28℃，120 r/min）后，加入 20 mL石油醚于30℃～60℃萃取，并将培养液置于5 000 r/min下离心10 min，转至分液漏斗，振荡100次，静置，待分层后分离，收集上层液，用石油醚洗涤2～3次，合并上层液，在烤箱中65℃蒸干，冷却后称重[3]。
除油率的计算采用下列公式：除油率=（m3－m2）/m1×100%式中，m1为最初的含油量，m2为降解后的残余油量，m3为对照组的残余油量。
1.2.2 菌株形态特征根据各株细菌的降油能力大小，筛选出降油能力高的菌株进行研究。
选择合适的稀释度将菌液涂布在固体牛肉膏蛋白胨培养基上，28℃条件下培养24 h，观察菌落大小和菌落形态，挑取单菌落进行革兰氏染色[4]。
1.2.3 菌株的生理生化鉴定采用穿刺接种法观察细菌运动性。
参考崔丽虹等[5]所列的生理生化鉴定项目，根据《常见细菌系统鉴定手册》[6]和《微生物学实验教程》[4]中的试验方法进行测定。
1.2.4 耐盐测试牛肉膏蛋白胨液体培养基培养细菌，调节培养液中NaCl的质量分数为1%、2%、5%、8%、10%，28℃条件下培养24 h。
将菌液稀释5倍后测量菌液在540 nm时的OD值。
1.2.5 耐酸碱测试牛肉膏蛋白胨液体培养基培养细菌，调节培养液 pH 值为 4.0、6.5、7.5、9.0、10.0，28℃条件下培养24 h。
将菌液稀释5倍后测量菌液在540 nm时的OD值。
2 结果与分析2.1 各菌株降油能力比较试验结果表明，供试菌株石油烃降解率均大于35%，菌株 A、B、C、E、G 的降解率分别为 48.7%、43.2%、38.3%、51.4%、39.4%。
采用重量法测定菌株的降油率，在石油的萃取和样品称量过程中不可避免地会产生误差。
但本试验的目的在于筛选出高效降解石油烃的菌株，因此该试验结果有一定的参考价值，对石油烃降解率高的菌株筛选有意义。
2.2 各菌株形态特征和生理生化特征比较各菌株形态特征和生理生化特征鉴定结果见表1。
通过一系列生理生化测试结果对菌株进行对比鉴定，确定菌株A为假单胞菌属，菌株B为红球菌属，菌株C为芽孢杆菌属，菌株E为放线菌属，菌株G为微球菌属。
2.3 盐度对各菌株生长的影响外界环境渗透压的不同会导致微生物原生质膜上的离子种类和数量出现变化，从而影响其生长和繁殖，此外也有可能是过多的Na+抑制了微生物脱氢酶和氧化酶的分泌，影响石油烃的降解率。
因此，本试验设定不同的盐度值，考查其对不同菌株的影响，结果见表2。
由表2可知，菌株A可以在高浓度盐下生长；菌株B和菌株C在低盐浓度下生长良好，但不能适应高盐环境；菌株E适应范围较广，但随着盐浓度增加，生长呈下降趋势；菌株G在低盐浓度下生长状况良好，但不适应高盐环境。
表1 各菌株形态特征和生理生化特征比较注：“+”表示产酸或产气“-”表示不产酸或不产气。
菌株指标菌落形态菌落颜色菌体形态革兰氏染色运动性接触酶试验氧化酶试验吲哚试验尿素酶试验M.R试验V.P试验淀粉水解试验明胶液化试验七叶灵水解试验硫化氢分解试验柠檬酸盐利用试验葡萄糖发酵试验乳糖发酵试验蔗糖发酵试验A B C E G圆形浅黄杆状G-圆形浅黄短杆G+圆形白色短杆G+圆形浅黄短杆G+圆形浅黄球状G++++-+++-++-+++-++--+--+------+++---+--+--++-+-+---+--+-+---+-++-++--+---+--表2 各菌株在不同盐度下培养的光密度值（30℃）菌株不同NaCl浓度的光密度值ABCEG 1%0.063 0.168 0.167 0.114 0.263 2%0.106 0.107 0.148 0.1200.175 5%0.046 0.039 0.105 0.082 0.054 8%0.158 0.015 0.035 0.068 0.082 10%0.140 0.010 0.027 0.031 0.0082.4 酸碱度对各菌株生长的影响环境pH值变化对微生物的生命活动影响很大，主要表现为引起细胞膜电荷的变化，从而影响微生物对营养物质的吸收；影响代谢中酶的活性，从而改变生长环境中营养物质的可给性及有害物质的毒性。
因此，本试验设定不同的酸碱度，考查其对不同菌株的影响。
结果（表3）表明，菌株A对酸碱性的适应范围较广，且可以在高pH值下生长；菌株B在低pH下难以生长，但在pH高于6.5的培养液中生长较好；菌株C、和菌株E的酸碱性适应范围广；菌株G在中性条件下生长状况良好，但不适应极端pH环境。
表3 各菌株在不同pH值下培养的光密度值（30℃）不同pH的光密度值菌株ABCEG 4.0 0.145 0.014 0.083 0.087 0.018 6.5 0.154 0.108 0.182 0.128 0.500 7.5 0.117 0.119 0.183 0.123 0.127 9.0 0.080 0.163 0.134 0.147 0.114 10.00.269 0.136 0.221 0.078 0.1623 结论与讨论3.1 据统计，迄今为止发现能降解石油的微生物有200种以上[7]。
有关石油及其产品的微生物降解方面的研究常有报道，土壤中最主要的降解细菌有假单胞菌属（Pseudomonas）、无色杆菌属（Achramobacter）、不动杆菌属（Acinetobacter）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、节杆菌属（Archrobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、黄杆菌属（Flavobacterium）、棒杆菌属（Coryneforms）、微杆菌属（Microbacterium）、微球菌属（Micrococcus）、放线菌属（Actinomycetes）、诺卡氏菌属（Nocardia）、分枝杆菌属（Mycobacterium）等[8]。
在大多数土壤环境中，上述细菌是主要的石油降解菌，其中最常见的是假单胞菌，其对短链及长链烷烃、芳烃均能降解，而且能使烷烃彻底降解。
这些微生物广泛分布于土壤和水体中，尤其是受石油污染的环境中。
在本试验中，5株高效石油烃降油率的菌株分别为假单胞菌属、红球菌属、芽孢杆菌属、放线菌属和微球菌属。
3.2 很多研究的筛选方法通常都是在土著微生物中进行，并采用现场石油污染的土壤进行降解率检测，存在驯化及筛选时间长、定量不够精确等问题。
本试验从已知的可降解的菌落中筛选菌种，并采用定量模拟石油污染土壤进行降解率检测，时间短、准确性高，且可筛选出高效菌种。