焦磷酸测序步骤中文版
焦磷酸测序技术的流程
焦磷酸测序技术的流程英文回答：Sequencing technologies have revolutionized the fieldof genomics, allowing us to unravel the genetic code of organisms. One of the widely used sequencing techniques is the Sanger sequencing method, also known as the chain termination method or dideoxy sequencing. This technique relies on the incorporation of chain-terminating dideoxynucleotides (ddNTPs) during DNA synthesis.The process of Sanger sequencing involves several steps. First, the DNA sample of interest is isolated and purified. This can be done from various sources, such as blood, tissue, or cultured cells. Once the DNA is extracted, it is fragmented into smaller pieces to facilitate the sequencing process.Next, the DNA fragments are amplified using the polymerase chain reaction (PCR). PCR is a technique thatallows for the amplification of specific DNA sequences. It involves multiple cycles of DNA denaturation, primer annealing, and DNA synthesis. During PCR, primers specific to the target DNA sequence are used to initiate DNA synthesis.After PCR amplification, the sequencing reaction is set up. This involves mixing the amplified DNA fragments with a primer, DNA polymerase, and a mixture of normal deoxynucleotides (dNTPs) and small amounts of chain-terminating ddNTPs. The ddNTPs lack the 3'-OH group necessary for DNA chain elongation, resulting in the termination of DNA synthesis at specific positions.The sequencing reaction mixture is then subjected to capillary electrophoresis. In this step, the DNA fragments are separated based on their size and charge as they migrate through a gel-filled capillary under the influence of an electric field. The fragments are detected by a fluorescent dye attached to the ddNTPs, which emits a signal when excited by a laser.The data obtained from the capillary electrophoresisare processed and analyzed using specialized software. The software assigns a nucleotide base to each peak in the electropherogram, which represents the sequence of the DNA fragment. The sequence is determined by analyzing the order of the peaks corresponding to the different nucleotides.Once the sequence is obtained, it can be compared to known reference sequences or analyzed further for various purposes, such as identifying genetic variations orstudying gene expression patterns.中文回答：焦磷酸测序技术（Sanger测序）已经彻底改变了基因组学领域，使我们能够解读生物体的遗传密码。
焦磷酸测序
焦磷酸测序
峰形图
➢ 峰高与结合模板的dNTP数量成正比 ➢ 原始数据会被软件自动转化为序列信息
2.复性：温度下降到50 ℃左右，两种引物通 过碱基互补配对与两条单链DNA结合
3.延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四 种脱氧核苷酸(A，T，C，G)在DNA聚合酶 的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的 DNA链。
4. 循环特点：
① 上一次循环的产物为下一 循环的模板 ② 结果单链中有最初母链的 只两条（无引物存于两个子代 DNA分子中 ） ，其它子代 DNA分子都为双引物分子 ③ 处于两引物之间的DNA序 列呈指数增长1×2N
基因测序
➢ 对DNA分子的核苷酸排列顺序的测 定，也就是测定组成DNA分子的A.T、 G、C的排列顺序。
➢ A-T-T-C-A-C-G-G-T-A-C
焦磷酸测序步骤
一 PCR 二 焦磷酸测序
PCR
➢ 聚合酶链式反应 ➢ 亦称之为DNA扩增, 是 DNA复制的体外模拟
普通PCR 实时荧光定量PCR
PCR反应的基本步骤
✓ 高温变性 ✓ 低温退火 ✓ 适温延伸
具有特异性强、灵敏度高、操 作简便、省时等特点
一、PCR反应的条件
1、一定的缓冲溶液； 2、DNA模板； 3、分别与两条模板链相结合的两种引物； 4、四种脱氧核苷酸：4种dNTP混合物； 5、耐热的DNA聚合酶； 6.控制温度（PCR重要条件）。
二、DNA变性和复性
• 在80-100℃的温度范围内, DNA的 双螺旋结构将解体, 双链分开, 这个过 程称为变性；当温度缓慢降低后, 两条 彼此分离的DNA链又会重新结合成双 链, 这个过程称为复性。
三、复制方向（5’~3’）
1、DNA分子的3’端与5’端：-OH端 为3’; 磷酸基团的末端为5’ 。 2.DNA分子由两条反向平行的脱氧核苷 酸链根据碱基互补配对原则形成氢键连 接而成。
焦磷酸测序实验步骤
焦磷酸测序实验步骤Control oligo稀释配置，需要二次稀释到0.04um：第一次稀释：体积浓度Control oligo 5ul 20um1×Dilution buffer 45ul第一次所得溶液50ul 2um第二次稀释：第一次所得溶液3ul 2um1×Dilution buffer 147ul第二次所得溶液 150ul 0.04um1.微珠固定PCR产物将生物素标记的PCR 产物固定到链霉亲和素包被的琼脂糖微珠（Streptavidin Sepharose High Performance，GE Healthcare）上。
1.1 轻摇包被链霉亲和素的琼脂糖微珠，直至获得均质溶液。
1.2 在一个试管中混合链霉亲和素包被的琼脂糖微珠总量（2 μl / 样品）（新的琼脂糖微珠浓度比原来的提高了一倍，只需加1ul）与结合缓冲液（40 μl / 样品）。
添加高纯度水至80 μl / 孔的总体积—包括第1.4 步中添加的PCR产物，纯水量取决于所用PCR 产物的量。
例如：如果使用15 μl PCR 产物、2 μl 微珠和40 μl 结合缓冲液，则必须添加23 μl 高纯度水。
1.3 将第1.2 步中制备的溶液添加至24 孔PCR 孔板或联排管中。
1.4 根据孔板设置，添加5–20 μl 优化好的生物素标记的PCR 产物至PCR 孔板（或联排管）的每个孔槽。
（注意：每个孔槽的总体积应当是80 μl。
）1.5 使用孔板条盖密封PCR 孔板（或联排管）。
确保孔槽之间没有泄漏。
1.6 使用振荡混合器（1400 rpm）不断振荡PCR 孔板（或联排管）至少5–10 分钟。
（注意：微珠沉淀快速，因此停止震荡后必须在一分钟内立即使用，即立刻捕获琼脂糖微珠。
）2. 真空工作站准备工作2.1 准备以下试剂：（1）大约50ml乙醇（70%）；（2）大约40ml变性溶液；（3）大约50ml 1×洗涤缓冲液；（4）大约50ml超纯水；（5）大约70ml超纯水。
焦磷酸测序原理
焦磷酸测序原理焦磷酸测序是一种常用的测序技术，通过测序仪器对DNA序列进行快速而准确的测定。
它是一种基于合成DNA链延伸的原理，可以在短时间内测定DNA序列。
焦磷酸测序的原理是利用DNA合成过程中的焦磷酸（dideoxynucleotide）来终止链延伸的反应。
焦磷酸是一种具有缺少3'-羟基的核苷酸，它会被DNA多聚酶插入到正在合成的DNA链中，但一旦焦磷酸被插入，DNA链延伸就会停止。
这样，每次加入一个不同的焦磷酸，就可以得到具有不同长度的DNA片段。
焦磷酸测序的步骤如下：1. DNA模板制备：首先，需要从待测DNA样本中提取出目标DNA片段。
这可以通过PCR（聚合酶链反应）或其他方法来进行。
然后，将目标DNA片段加入到一个含有多聚酶和引物的反应混合物中。
2. DNA合成：在反应混合物中，加入四种不同的焦磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP），以及四种普通的核苷酸（dATP、dCTP、dGTP和dTTP）。
这样，当DNA链延伸到某个位置时，如果接下来要插入的是焦磷酸，链延伸就会终止。
3. 前序列扩增：在DNA合成过程中，每次加入的焦磷酸是不同的，因此会得到不同长度的DNA片段。
然后，将反应混合物分离成不同长度的DNA片段。
4. DNA片段分离：将反应混合物中的DNA片段进行电泳分离，根据片段大小的不同，可以得到一个DNA片段长度的分布图。
5. 数据分析：通过测序仪器对DNA片段进行测定，得到每个片段的长度信息。
根据这些信息，可以推导出DNA序列。
焦磷酸测序的优点是速度快、准确性高、适用于多种类型的样品。
它被广泛应用于基因组学、遗传学、生物医学研究等领域。
然而，焦磷酸测序也存在一些限制，例如不能测定长片段的DNA，且在测序过程中容易产生误差。
焦磷酸测序是一种基于合成DNA链延伸的原理，通过插入焦磷酸来终止链延伸的反应，从而快速而准确地测定DNA序列。
它在基因组学和生物医学研究中具有重要的应用价值，为我们深入了解DNA序列提供了有效的工具。
焦磷酸测序名词解释
焦磷酸测序名词解释焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA 序列。
焦磷酸测序的原理是通过对 DNA 序列进行扩增，并对扩增产物进行测序，最终得到 DNA 序列信息。
焦磷酸测序主要应用于基因组学、遗传学、转录组学等领域，可以用于基因表达谱分析、基因突变检测、基因调控机制研究等。
相比其他基因测序技术，焦磷酸测序具有很多优势，如测序成本低、速度快、精度高等。
但是，焦磷酸测序也存在一些缺陷，如测序长度有限、难以测序复杂基因结构等。
尽管焦磷酸测序技术已经发展了多年，但它仍在不断演进和改进。
未来，焦磷酸测序技术将继续发展，并在更多领域得到应用。
1. 什么是焦磷酸测序焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA 序列。
焦磷酸测序的工作原理是通过扩增 DNA 序列，并对扩增产物进行测序，最终得到DNA 序列信息。
具体来说，焦磷酸测序技术利用了聚苯乙烯四氢呋喃（ATP）合成酶的特性，可以通过检测 ATP 合成过程中的光谱变化来确定 DNA 序列。
焦磷酸测序技术最初由来自瑞典斯德哥尔摩大学的科学家们开发，并于 1998 年由瑞典Pyrosequencing AB 公司商业化。
自此，焦磷酸测序技术就成为了一种广泛应用于基因组学、遗传学、转录组学等领域的技术手段。
2. 焦磷酸测序的原理焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA序列。
焦磷酸测序的工作原理是通过扩增 DNA 序列，并对扩增产物进行测序，最终得到DNA 序列信息。
焦磷酸测序的工作流程如下：1. 先将 DNA 样本进行扩增，得到扩增产物。
2. 然后将扩增产物与一种叫做反转录酶的蛋白质混合，使其能够将 DNA 序列转录成RNA 序列。
3. 将转录后的 RNA 序列与一种叫做聚苯乙烯四氢呋喃（ATP）合成酶的蛋白质混合，使其能够将 RNA 序列通过合成 ATP 来反应出 DNA 序列信息。
焦磷酸测序技术流程
焦磷酸测序技术流程英文回答：Phosphorylation sequencing, also known as pyrophosphate sequencing or pyrosequencing, is a DNA sequencing technique that utilizes the detection of pyrophosphate release during DNA synthesis. It is a highly sensitive and accurate method for sequencing DNA and has been widely used in various research fields, including genomics, transcriptomics, and epigenomics.The process of phosphorylation sequencing involves several steps. First, the DNA sample is fragmented into smaller pieces, typically ranging from 100 to 500 base pairs. These fragments are then mixed with specific primers that bind to the DNA template. The primers are designed to initiate DNA synthesis.Next, the DNA fragments are subjected to a series of enzymatic reactions. DNA polymerase, along with otherenzymes and reagents, is added to the reaction mixture. As DNA synthesis occurs, pyrophosphate molecules are released. These pyrophosphate molecules are then converted into ATP (adenosine triphosphate) by the enzyme ATP sulfurylase.The ATP produced in the reaction is further utilized by luciferase, an enzyme that catalyzes the conversion of ATP to light. The light emitted is proportional to the amount of ATP generated, which in turn reflects the number of pyrophosphate molecules released during DNA synthesis. This light signal is detected by a detector and recorded as a peak in the sequencing trace.Based on the peaks observed in the sequencing trace, the sequence of the DNA template can be determined. The intensity and timing of the peaks provide information about the order of nucleotides in the DNA sequence. By analyzing the sequencing trace, the sequence of the DNA template can be reconstructed.Phosphorylation sequencing offers several advantages over other sequencing methods. It is a relatively fast andcost-effective technique, making it suitable for high-throughput sequencing projects. Additionally, it does not require the use of labeled nucleotides, as the pyrophosphate release itself serves as the detection signal. This eliminates the need for complex labeling and detection procedures.中文回答：焦磷酸测序技术，也称为焦磷酸测序或火花测序，是一种利用DNA合成过程中焦磷酸释放的检测来进行DNA测序的技术。
简述焦磷酸测序技术的流程
简述焦磷酸测序技术的流程英文回答：The process of pyrophosphate sequencing, also known as pyrosequencing or 454 sequencing, involves several steps.It is a high-throughput DNA sequencing method that utilizes the detection of pyrophosphate released during DNA synthesis. Here is a brief overview of the pyrophosphate sequencing workflow:1. DNA Sample Preparation: The first step is to extract the DNA from the sample of interest. This can be done using various methods depending on the source of DNA. For example, if the DNA is from a blood sample, it can be extractedusing a commercial DNA extraction kit.2. DNA Fragmentation: The extracted DNA is then fragmented into smaller pieces. This can be achievedthrough mechanical shearing, enzymatic digestion, or sonication. The purpose of fragmentation is to obtainshorter DNA fragments that can be sequenced more easily.3. Adapter Ligation: Short DNA sequences called adapters are ligated to the fragmented DNA. Adapters contain specific sequences that allow for attachment to the sequencing platform and facilitate the amplification of DNA fragments.4. Emulsion PCR: The adapter-ligated DNA fragments are then amplified using emulsion polymerase chain reaction (PCR). This process involves the encapsulation ofindividual DNA fragments in water-in-oil emulsion droplets, each containing a single DNA fragment and the necessary reagents for PCR amplification.5. DNA Sequencing: The emulsion PCR droplets containing the amplified DNA fragments are then transferred to a sequencing plate or flow cell. The DNA fragments are immobilized on a solid support and subjected to DNA synthesis. During DNA synthesis, the addition of each nucleotide triggers the release of pyrophosphate if it is incorporated into the growing DNA chain.6. Pyrophosphate Detection: The released pyrophosphate molecules are converted into visible light signals through a series of enzymatic reactions. These light signals are captured by a detector and recorded as a sequence of peaks, representing the order of nucleotides incorporated during DNA synthesis.7. Data Analysis: The recorded sequence of peaks is then analyzed using bioinformatics tools and software. The sequence data is aligned to a reference genome or assembled de novo to generate a consensus sequence.8. Result Interpretation: The final step involves interpreting the sequence data to identify genetic variations, mutations, or other relevant information. This can be done by comparing the obtained sequence with known reference sequences or by searching for specific genetic markers.中文回答：焦磷酸测序技术的流程包括以下几个步骤。
焦磷酸测序技术流程
焦磷酸测序技术流程Next-generation sequencing (NGS) has revolutionized the field of genomics, enabling researchers to sequence DNA at an unprecedented scale and speed. Among the various NGS techniques, pyrosequencing, also known as 454 sequencing or the 454 pyrosequencing method, has emerged as a powerful tool for DNA sequencing. In this article, we will delveinto the workflow of pyrosequencing, highlighting its key steps and providing a comprehensive understanding of this technique.Pyrosequencing begins with the preparation of a DNA library, which involves fragmenting the DNA into smaller pieces and attaching specific adapters to the ends of the fragments. These adapters serve as priming sites for subsequent amplification and sequencing reactions. Once the library is prepared, it is loaded onto a picotiter plate, which contains millions of tiny wells, each capable of accommodating a single DNA fragment.The next step in the pyrosequencing workflow is the emulsion PCR (polymerase chain reaction). Emulsion PCR is a method that allows for the amplification of individual DNA fragments within the wells of the picotiter plate. The DNA fragments, along with specific primers and PCR reagents, are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets. These droplets serve as microreactors, each containing a single DNA fragment and all the necessary components for PCR amplification. By subjecting the emulsion to thermal cycling, multiple rounds of PCR amplification occur, resulting in the generation of clonal DNA clusters.Following emulsion PCR, the picotiter plate is loaded onto a sequencing instrument, such as the Roche 454 Genome Sequencer. The sequencing instrument utilizes a series of enzymatic reactions to generate light signals that correspond to the order of nucleotides in the DNA template. The sequencing process begins by introducing a single type of nucleotide (A, T, C, or G) into the reaction mixture. If the introduced nucleotide is complementary to the next nucleotide in the DNA template, a pyrophosphate molecule is released, which in turn generates a light signal. The lightsignal is detected by a CCD camera, and the nucleotide incorporation event is recorded as a peak in a pyrogram.After the detection of the nucleotide incorporation event, the enzyme responsible for generating the light signal is inactivated, and the signal is recorded. The released pyrophosphate is then enzymatically converted into ATP, which is subsequently degraded by a luciferase enzyme. The degradation of ATP generates a light signal that is proportional to the number of incorporated nucleotides. This process is repeated for each of the four nucleotides, allowing for the sequential determination of the DNA sequence.Once the sequencing run is complete, the raw data generated by the instrument is processed and analyzed using bioinformatics tools. This involves base calling, which converts the light signals into nucleotide sequences, and quality control, which assesses the reliability of the generated sequences. The resulting sequences can then be aligned to a reference genome or assembled de novo to reconstruct the original DNA sequence.In summary, pyrosequencing is a powerful and versatile DNA sequencing technique that allows for the rapid and accurate determination of DNA sequences. Its workflow encompasses steps such as DNA library preparation, emulsion PCR, nucleotide incorporation detection, and data analysis. With its high throughput and ability to generate long reads, pyrosequencing has found applications in various fields, including genomics, transcriptomics, and metagenomics, contributing to our understanding of the genetic basis of life.。
焦磷酸测序技术的原理
Pyrosequencing技术的原理Pyrosequencmg是一项全新的DNA测序技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。
其基木原理如下：第1步：1个特异性的测序引物和取链DNA模板结合，然后加入酹混合物（包括DXA Polymerase> ATP Sulfurylasex Luciferase 和Apyrase）和底物混合物（包括APS 111 Luciferin）。
第2步：向反应休系中加入】种dXTP,如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对.则会在D冶聚合酶的作用下，添加到测序引物的3 '末端.同时释放出一个分子的焦磷酸（PPD。
第2步图示（图片來自互联网）第3步：在ATP硫酸化酹的作用下.生成的PPi可以和APS结合形成ATP;在荧光素曲的催化下.生成的ATP 又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。
通过CCD光学系统即可获得一个特界的检测峰，峰值的商低则和相匹配的碱基数成正比。
SulfurylO^^n-ucle^tide incorporation light-as 令pe-ak in the pyrogr^im第3步图示（图片來自互联网）第4步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少虽ATP在Apyrase的作用下发生降解。
dNTp_Apyr«c_^dNDp *dNMP • phosphate員TP 金即"*■ ADP 十AMP 十phosphate第・1步图示（图片來自互联网）第5步：加入另一种dNTP,使第2-4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DXA序列信息。
Pyrosequecmg技术操作简也结果准确可靠，可应用于SXP位点检测、等位基伙I频率测定、细菌和病毒分型等领域。
一如果您认为木词条还有待完善.请编辑词条上一篇SXP（W核昔酸多态性）下一篇阅读质粒图谱具体事例【摘要】建立了一种将序列标记反转录聚合酶链反应（PCR）与焦磷酸测序技术结合的相对基因表达量测左法（简称“SRPP”）。
甲基化检测之金标准焦磷酸测序技术
甲基化检测之⾦标准焦磷酸测序技术中科普瑞作为中国⼗万⼈甲基化组计划的执⾏⽅，对甲基化检测的相关技术进⾏了优化升级，建⽴了专业的甲基化检测⼀站式服务平台。
今天⼩编为⼤家介绍甲基化检测的⾦标准—焦磷酸测序技术，后⾯陆续介绍其他甲基化检测技术，敬请期待哦！焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）作为⼀种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进⾏定性及定量检测，已成为甲基化检测的⾦标准。
焦磷酸测序技术原理焦磷酸测序技术是由4种酶（DNA 聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶）催化的同⼀反应体系中的酶级联化学发光反应。
具体过程如下：步骤1：扩增DNA⽚段并对焦磷酸模板链进⾏⽣物素化。
通过变性，分离⽣物素化的单链PCR 扩增⼦并使其与⼀条测序引物进⾏杂交。
步骤2：将杂交引物和单链模板与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和腺苷三磷酸双磷酸酶，以及底物腺苷-5'-磷酸硫酸酐（APS）和荧光素共孵育。
步骤3：第⼀个脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）被引⼊反应。
DNA聚合酶催化dNTP，使其在互补模板链的情况下对测序引物进⾏延伸。
每个核苷酸的添加都对应着等摩尔数焦磷酸（PPi）的释放。
步骤4：ATP硫酸化酶在腺苷-5'-磷酸硫酸酐（APS）存在的情况下将PPi转化为ATP。
⽣成的ATP为荧光素酶介导的荧光素氧化反应提供能量，并⽣成与ATP的数量成⽐例的可见光。
电荷耦合器（CCD）摄像头检测到荧光素酶催化反应所⽣成的光，并将其作为原始输出数据中的⼀个峰值（热解图Pyrogram）。
每个峰值（光信号）的⾼度与核苷酸结合的数⽬呈⽐例关系。
步骤5：腺苷三磷酸双磷酸酶是核苷酸的降解酶，持续地对未结合的核苷酸和ATP进⾏分解。
当分解完成时，便会引⼊另⼀个核苷酸。
步骤6：dNTP的添加反应在持续进⾏着。
应注意脱氧腺苷三磷酸α-硫代三磷酸（dATPαS）能够作者为天然脱氧腺苷三磷酸（dATP）的替代物，被DNA聚合酶有效利⽤，却并不会被荧光素酶所识别。
焦磷酸测序操作流程
焦磷酸测序操作流程一、准备工作。
焦磷酸测序听起来就很厉害的样子呢，但其实只要我们做好准备工作，就没有那么难啦。
我们得先把实验室的环境准备好哦。
要确保实验室干净整洁，各种仪器摆放整齐，这样我们在操作的时候心情也会好很多呢。
然后就是仪器的检查啦。
就像我们出门前要检查钥匙有没有带一样，要看看测序仪是不是能正常工作。
检查它的电源连接是否稳固，各个部件有没有松动或者损坏的迹象。
要是仪器出问题了，那可就像做饭的时候炉灶坏了一样，啥都干不成啦。
试剂也是很重要的一部分哦。
焦磷酸测序需要用到很多种试剂呢，我们要把它们都找齐。
这些试剂就像做菜的调料一样，少了哪一种都不行。
要检查试剂的保质期，要是用了过期的试剂，那结果可就没准儿啦。
就像过期的牛奶喝了会拉肚子一样，过期的试剂肯定会让测序结果出岔子的。
二、样本准备。
样本可是我们测序的主角呢。
我们要小心翼翼地对待它们。
首先要采集到合适的样本，这个过程就像寻宝一样，要找对地方，用对方法。
如果是生物样本的话，要确保采集的样本具有代表性。
比如说从组织中采集样本，可不能只采到病变边缘或者完全正常的地方，得采到能反映真实情况的部分。
采集好样本之后，就要对样本进行处理啦。
这个处理过程就像是给样本做个“美容”，让它能更好地适应测序的过程。
可能需要提取DNA或者RNA之类的，这个过程要按照标准的操作规程来做。
要是手法太粗糙，就像给头发做造型的时候用力过猛，把头发扯断了一样，样本也可能被破坏掉呢。
处理好的样本要进行定量和质检。
这一步就像是给样本量身高称体重一样，看看它符不符合测序的要求。
如果样本的量太少或者质量不好，就像一个身体虚弱的运动员参加比赛，很难有好的表现的，测序结果可能就不准确啦。
三、测序反应。
把混合好的东西放到测序仪里面，就像把宝贝放进保险箱一样。
然后启动测序仪，这个时候就只能耐心等待啦。
测序仪在工作的时候，就像一个勤劳的小蜜蜂，在那里忙忙碌碌地进行着各种复杂的操作。
我们可不能去打扰它哦，不然它可能就会出错啦。
焦磷酸测序(Pyrosequencing)实验技术及方法
焦磷酸测序（Pyrosequencing）实验技术及方法先进的基于焦磷酸测序（Pyrosequencing）的PSQ96 MA技术平台，能提供基于序列测定的SNP检测、等位基因频率分析和甲基化检测服务。
另外，还提供短片段的测序服务（50-100 bp），适用于细菌和病毒分型等研究领域。
基于Pyrosequencing的SNP分析具有快速、高通量的特点，完成96个样品的SNP分析仅需10分钟。
整个实验过程（包括PCR扩增、单链分离、P yrosequencing测序和数据分析）也只需3-4 小时。
PSQ96 MA配备有功能强大的SNP分析软件，可支持SNP位点的复合检测（在一个反应体系中最多可同时检测3个不同位置的SNP位点）。
对于混合样品，则可准确测定特定SNP位点的基因型频率。
一．常规SNP检测样品要求用户须提供足够量的基因组DNA样品，一般需200ng/样品/位点。
二．基于Pyrosequencing技术的甲基化检测服务1．甲基化研究意义DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,可能存在于所有高等生物中。
DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。
,真核生物中甲基化的主要形式是在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下，使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶。
这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它参入了基因的表达调控。
DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及肿瘤发生过程中起着极其重要的作用。
2．基本流程：通过亚硫酸氢盐处理基因组DNA，使其中未甲基化的C转变成T后，运用特异性引物扩增目的区段，然后用Pyrosequencing技术测定目标位点中 C/T的比率，以此判断目标位点的甲基化程度。
焦磷酸测序步骤中文版
焦磷酸测序步骤一、实验操作（一）甲基化检测亚硫酸氢盐转化1． bisulfite Mix+800μL Rnase free water，窝旋5min/60℃加热窝旋混匀（配置好的bisulfite Mix勿放置冰上）2. 配置buffer反应液，室温混匀：DNA Solution （1μg）+RNAfree water 共20μl+bisulfite Mix 85μl+DNA protect buffer 5μl，（配置好的体系为140μl，不方便上PCR仪，最好分为两管70μl）3. 上PCR仪，95℃5min→60℃25min→95℃5min→60℃85min→95℃5min→60℃175min→20℃20min，热循环结束，将PCR product转入Spin-column，加入560 Buffer BL。
（当DNA微量时，需要加入carrier RNA，其加强DNA与column膜的结合；当DNA 量>100ng，则不需要加入carrier RNA）混匀，12，000rpm，1min，废弃液。
4. 清洗Bisulfite DNA convertion1）加入500μl buffer BW，12,000rpm，1min，废弃液。
2）加入500μl buffer BD，室温放置15min（加入buffer BD快速盖盖子，避免出现白色沉淀）3）加入500μl buffer BW，12,000rpm，1min，废弃液。
4）加入500μl buffer BW，12,000rpm，1min，废弃液。
5） 12,000rpm，1min，废弃液。
6） 56℃5min（蒸发残余液体）7） 20μl Buffer EB溶解，12,000rpm，1min（-20℃，可保存3年）PCR扩增目的片段回收的PCR product 1：5稀释→取2μl→PCR→准备焦磷酸测序焦磷酸测序1．在PCR板中，准备微珠预混液配制（每管）1）Beads：3μl，Binding Buffer，40μl，模版：20μl，dd Water：补足80μl。
焦磷酸测序技术原理及应用
焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是由Nyren等人于1987年发展起来的一种新型的酶联级联测序技术，焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美，而速度却大大的提高。
焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行DNA甲基化、SNP等单个/连续多个核苷酸变异进行实时定量检测提供了非常理想的技术操作平台。
一.焦磷酸测序技术原理焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。
焦磷酸测序技术的原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)．荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。
焦磷酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。
反应底物为5’-磷酰硫酸(adenosine-5’-phosphosulfat，APS)、荧光素(1uciferin)。
1.每次加入一个dNTP,在聚合酶作用下产生一个焦磷酸（PPi）；2.硫酸化酶转化PPi为ATP，ATP使荧光素酶发出荧光(产生的光强度与结合的核苷数量成正比).3.多余的dNTP被降解，开始新一个循环.4.测序结果2.技术平台：QIAGEN公司PyroMark Q24，PyroMark Q48Autoprep，PyroMark Q96ID焦磷酸测序仪.3.焦磷酸测序实验流程4.焦磷酸测序技术应用1)DNA甲基化检测2)全基因组甲基化水平检测：LUMA法4.SNP定量检测/等位基因差异表达检测。
甲基化 焦磷酸测序
甲基化焦磷酸测序1. 介绍甲基化焦磷酸测序（Methylated CpG island recovery assay，MIRA）是一种用于检测DNA甲基化的高通量测序技术。
DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰形式，它在基因组稳定性、细胞分化和发育等生物学过程中起着重要作用。
通过甲基化焦磷酸测序技术，我们可以更加全面地了解DNA甲基化的模式和变化，进而深入研究其在生物学过程中的功能和机制。
2. 原理甲基化焦磷酸测序技术主要分为以下几个步骤：2.1 DNA提取与消除非甲基化DNA首先，从待检测样品中提取总体DNA。
然后，通过特定的方法（如亚硫酸处理）将非甲基化的胞嘧啶（Cytosine）转变为尿嘧啶（Uracil），从而实现对非甲基化DNA的消除。
2.2 CpG岛富集与捕获接下来，利用特定的富集方法（如亚硫酸钠处理）对DNA中的CpG岛进行富集。
CpG岛是一种特定的DNA序列区域，其中含有高密度的CpG二核苷酸。
这些区域通常与基因启动子、转录因子结合位点等功能元件相关联。
2.3 DNA片段化将富集后的CpG岛DNA进行片段化，通常采用限制性内切酶或超声波破碎等方法。
片段化后的DNA可更好地适应高通量测序平台。
2.4 DNA甲基化检测与测序接下来，对片段化的DNA进行甲基化检测和测序。
目前常用的方法是利用亚硫酸处理后产生的尿嘧啶与胞嘧啶之间的差异，通过测序技术准确地检测出甲基化位点。
3. 应用领域甲基化焦磷酸测序技术在许多研究领域中得到了广泛应用：3.1 癌症研究癌症是一种由于基因组异常导致细胞失控增殖而形成的疾病。
DNA甲基化在癌症发生和发展中起着重要作用。
甲基化焦磷酸测序技术可以帮助我们深入了解癌症细胞中的甲基化模式，发现与肿瘤相关的甲基化标记物，并为癌症诊断、治疗和预后评估提供依据。
3.2 发育生物学DNA甲基化在胚胎发育和细胞分化中起着重要作用。
通过甲基化焦磷酸测序技术，我们可以了解不同发育阶段和组织类型中的DNA甲基化模式变化，揭示甲基化在发育过程中的调控机制。
Q24焦磷酸测序操作流程
Q24焦磷酸测序操作流程1、开机前检查：(1) 检查过滤探针：确保过滤探针不发生堵塞，否则更换。
(2) 检查废液桶：必要时清除废液。
(3) 检查卡夹（Cartridge）：确保Cartridge已经在上次使用过后检查过未发生堵塞，并且已经晾干，否则更换。
(4) 检查真空系统：确保真空系统的压力正常。
2、开机程序：打开机器电源→等待约1分钟进入主界面→插入带有程序的U盘3、标本检测程序将PCR产物加入到预先准备好的2ul Beads及40ul Binding Buffer混合液中→放置在平板振荡仪上1400rpm混合5-10分钟→准备测序引物与Annealing Buffer混合液25ul →根据实验设计分配到对应的24孔板孔位上→准备work station上的各种缓冲液→将PCR 产物混合液转移到work station上→在work station上进行DNA链的分离→将24孔板放置在80度上温浴2min后在室温放置5分钟→根据pre run information加入相应体积的酶、底物和dNTP至试剂仓（Cartridge）中→将试剂仓放进Q24设备中→将24孔板放进Q24设备中→从屏幕上选择需要运行的程度→再次确认后设备开始运行→结束后数据自动保存在U盘上→将U盘上数据拷贝回电脑上进行分析4、关机程序4.1 关闭真空工作站打开真空开关，将真空抽滤工具放置在高纯水中清洗约10秒→将真空抽滤工具以垂直90度竖值约10秒→关闭真空抽滤工具的开关→放置在Park位置上→关闭真空泵电源→清洗work station上的各缓冲液槽后晾干4.2 关闭PyroMark Q24选择屏幕上的Shutdown选项→确认后等待屏幕上显示“It is now safe to turn off the instrument”→关闭仪器电源→丢弃测序24孔板，取出仪器内的试剂仓→用高纯水清洗试剂仓，确认无堵塞后室温晾干或37度烘干。
Q24焦磷酸测序操作流程
1、开机前检查：(1) 检查过滤探针：确保过滤探针不发生堵塞，否则更换。
(2) 检查废液桶：必要时清除废液。
(3) 检查卡夹（Cartridge）：确保Cartridge已经在上次使用过后检查过未发生堵塞，并且已经晾干，否则更换。
(4) 检查真空系统：确保真空系统的压力正常。
2、开机程序：打开机器电源→等待约1分钟进入主界面→插入带有程序的U盘3、标本检测程序将PCR产物加入到预先准备好的 2ul Beads及 40ul Binding Buffer混合液中→放置在平板振荡仪上1400rpm混合5-10分钟→准备测序引物与Annealing Buffer混合液25ul →根据实验设计分配到对应的24孔板孔位上→准备work station上的各种缓冲液→将PCR产物混合液转移到work station上→在work station上进行DNA链的分离→将24孔板放置在80度上温浴2min后在室温放置5分钟→根据pre run information加入相应体积的酶、底物和dNTP至试剂仓（Cartridge）中→将试剂仓放进Q24设备中→将24孔板放进Q24设备中→从屏幕上选择需要运行的程度→再次确认后设备开始运行→结束后数据自动保存在U盘上→将U盘上数据拷贝回电脑上进行分析4、关机程序4.1 关闭真空工作站打开真空开关，将真空抽滤工具放置在高纯水中清洗约10秒→将真空抽滤工具以垂直90度竖值约10秒→关闭真空抽滤工具的开关→放置在Park位置上→关闭真空泵电源→清洗work station上的各缓冲液槽后晾干4.2 关闭PyroMark Q24选择屏幕上的Shutdown选项→确认后等待屏幕上显示“It is now safe to turn off the instrument”→关闭仪器电源→丢弃测序24孔板，取出仪器内的试剂仓→用高纯水清洗试剂仓，确认无堵塞后室温晾干或37度烘干。
焦磷酸测序
Pyrosequencing是对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量的、精确和重复性好的分析的技术。
第一步——测序引物和PCR扩增的、单链的DNA模板杂交，与酶—DNA聚合酶（DNA polymerase）、ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase）、荧光素酶（luciferase）、三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）—和底物—adenosine 5´ phosphosulfate (APS)、荧光素（luciferin）孵育。
第二步——四种dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模扳配对（A—T，C—G），此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。
注意：反应时deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATPS)是dATP的替代物，因为DNA聚合酶对dATPS的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATPS不是荧光素酶的底物。
第三步——ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素（oxyluciferin）的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。
ATP sulfurylasePPi+APS —————————> ATPLuciferase，ATPLuciferin —————————> oxyluciferin光信号由CCD摄像机检测并由软件pyrogram™反应为峰。
每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。
第四步——ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。
第五步——然后加入下一种dNTP。
在以上步骤循环进行中，互补DNA链合成，序列从pyrogram™的信号峰中决定。
利用PSQ96系统进行测序分析可期望得到20-30个碱基的读序长度，但是和任何测序技术一样，最大读序长度取决于模板的二级结构、碱基组成、PCR产物质量和其他参数。
e7-3焦磷酸测序与深度测序
e7-3 焦磷酸测序与深度测序1. 焦磷酸测序的原理焦磷酸测序需要在同一反应体系中发生由4种特异性酶催化的级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其参入到引物链的3′-端，并释放出等量的焦磷酸基团（PPi）。
PPi可转化为可见光信号，并最终转化为一个峰值。
每个峰值的高度与反应中参入的核苷酸数目成正比。
第一轮反应结束后，再加入下一种dNTP，继续下一轮DNA链的合成。
整个测序反应分为四步[图e7-3(1)]：图e7-3(1) 焦磷酸测序的原理（1）将单链DNA模板与其特异性的测序引物结合，然后加入四种酶的混合物，包括：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶（A TP sulfurylase，APS）、荧光素酶（luciferase）和双磷酸酶（apyrase）。
反应底物有腺苷-5′-磷酸硫酸（adenosine-5′-phosphosulfate，APS)和荧光素（luciferin）。
（2）向反应体系中加入1种dNTP，如果它正好能和DNA模板的下一个碱基配对，就会在DNA 聚合酶的作用下，被添加到测序引物的3′-端，同时释放出1分子的PPi。
dA TP 由腺苷-α硫-三磷酸（deoxyadenosine alfa-thio triphosphate，dATPαS）替代，原因是DNA聚合酶对dATPαS的催化效率比对dA TP的催化效率高，且dATPαS不是荧光素酶的底物。
（3）在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合，形成氧化荧光素，同时产生可见光。
通过电荷耦合器（charge coupled device，CCD）光学系统，即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低和相匹配的碱基数成正比。
（4）反应体系中剩余的dNTP和残留的少量A TP在双磷酸酶的作用下发生降解。
（5）加入另一种dNTP，按第2、3、4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。
焦磷酸测序技术的流程
焦磷酸测序技术的流程Next-generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the field of genomics, offering unprecedented insights into genetic variation and molecular mechanisms underlying complex biological processes. With its high-throughput capabilities, NGS has enabled researchers to sequence entire genomes faster and more cost-effectively than traditional Sanger sequencing methods. One of the key NGS techniques, known as pyrophosphate sequencing or pyrosequencing, has played a crucial role in advancing our understanding of the genetic basis of diseases and evolutionary biology.下一代测序（NGS）技术已经彻底改变了基因组学领域，为我们提供了前所未有的洞察力，揭示了复杂生物过程背后的遗传变异和分子机制。
凭借其高通量性能，NGS技术使研究人员能够比传统的桑格测序方法更快速、更经济地测序整个基因组。
其中一种关键的NGS技术，称为焦磷酸测序或火焰测序，对推动我们对疾病的遗传基础和进化生物学的理解发挥了关键作用。
Pyrophosphate sequencing relies on the detection of pyrophosphate released during DNA synthesis as each nucleotide is incorporatedinto the growing DNA strand. This enzymatic method allows for real-time monitoring of DNA synthesis, offering advantages in terms of speed, cost, and accuracy compared to other NGS methods. By using a series of enzymatic reactions, pyrosequencing enables the sequential addition of individual nucleotides, with the release of pyrophosphate generating a detectable signal that can be quantified to determine the DNA sequence.焦磷酸测序依赖于在DNA合成过程中释放的焦磷酸的检测，每个核苷酸被合并到不断增长的DNA链中。
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焦磷酸测序步骤
一、实验操作
（一）甲基化检测
亚硫酸氢盐转化
1． bisulfite Mix+800μL Rnase free water，窝旋5min/60℃加热窝旋混匀（配置好的bisulfite Mix勿放置冰上）
2. 配置buffer反应液，室温混匀：DNA Solution （1μg）+RNAfree water 共20μl+
bisulfite Mix 85μl+DNA protect buffer 5μl，（配置好的体系为140μl，不方便上PCR仪，最好分为两管70μl）
3. 上PCR仪，95℃5min→60℃25min→95℃5min→60℃85min→95℃5min→60℃175min
→20℃20min，热循环结束，将PCR product转入Spin-column，加入560 Buffer BL。
（当DNA微量时，需要加入carrier RNA，其加强DNA与column膜的结合；当DNA 量>100ng，则不需要加入carrier RNA）混匀，12，000rpm，1min，废弃液。
4. 清洗Bisulfite DNA convertion
1）加入500μl buffer BW，12,000rpm，1min，废弃液。
2）加入500μl buffer BD，室温放置15min（加入buffer BD快速盖盖子，避免出现白色沉淀）
3）加入500μl buffer BW，12,000rpm，1min，废弃液。
4）加入500μl buffer BW，12,000rpm，1min，废弃液。
5） 12,000rpm，1min，废弃液。
6） 56℃5min（蒸发残余液体）
7） 20μl Buffer EB溶解，12,000rpm，1min（-20℃，可保存3年）
PCR扩增目的片段
回收的PCR product 1：5稀释→取2μl→PCR→准备焦磷酸测序
焦磷酸测序
1．在PCR板中，准备微珠预混液配制（每管）
1）Beads：3μl，Binding Buffer，40μl，模版：20μl，dd Water：补足80μl。
2）震荡20min（如果准备工作没做好，可延长震荡时间）
2.焦磷酸测序样品准备
1）清洗探头2-3次，最后一次将探头竖直举起，抽出残余水分，将70%乙醇、变性液、洗液倒入相应的位置
位置不同）
2
3）在酶标版中，准备预混液（每管）：Aneal Buffer：40μl，Sprinmer（100pmol）：0.2μl 4）探头吸附微珠预混液：探头放置70%乙醇，看到液体从关中出来，探头竖直举起；探头放置变性液，看到液体从管中出来，探头竖直举起；探头放置洗液，看到液体从管中出来，探头竖直举起直至水抽干；将探头对准酶标版，关闭真空，停留3s后，探头置入酶标版，轻轻晃动探头；将酶标版80℃2min，室温直至手感不热，放入仪器；5）打开CpG software，可提前设置软件，RUN。