dna提取实验步棸

（1）取新鲜或冰冻动物组织块0.5 g，尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入5ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块。

（2）转入2ml 离心管中（转2管或4管），每管转入1ml，用台式离心机以12000 rpm 离心5min,弃上清收集沉淀。

（3）加入300ul 10×TE缓冲液悬浮沉淀

（4）加入100μl 200mg/ml的溶菌酶，37℃水浴1h；

（4）加入50ul 10%SDS ,20μl 20mg/ml蛋白酶K在50℃恒温水浴锅中水浴3h ,间歇振荡数次。

（4）加入100μl 5mol/L NaCl，65℃水浴10min

（5）加等量（570ul）的氯仿：异戊醇(24:1)振荡混匀，离心12000 rpm，10min。

（6）.取上层溶液至另一管，加入等体积的酚：氯仿:异戊醇(25：24:1)，振荡混匀，离心12000 rpm，10min，取上层溶液至另一管，重复一次。

（7）加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀20min ，12000 rpm离心,10min。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。

（8）用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ，5min。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁残余液滴除掉，室温干燥。

（11）加200ul 灭菌水重新溶解沉淀物。

（12）Nanophotometer仪测定DNA浓度及OD值。

（13）-20℃保存备用。

1.3.2菌群16S rRNA基因V3高变区PCR扩增

（1）16S rRNA基因V3高变区通用引物：

V3F：5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’

V3R：5’- ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’

其中，CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G为GC 夹。

（2）反应体系（25 μl）：

gDNA 0.5μl

V3F 2.5μl

V3R 2.5μl

Taq buffer（Mg2+ free） 2.5μl

MgCl2 2.5μl

dNTPs 0.5μl

Taq酶0.5μl

ddH2O 13.5μl

Total 25μl

其中，所有样本gDNA在PCR扩增前均稀释到40ng/μl，即每个反应体系中加入的gDNA均为20ng。

（3）反应条件首先采用Touch-down程序：94℃，3 min预变性；94℃，1 min变性；65℃，1 min退火；72℃，1 min延伸，之后每两个循环退火温度就下降1℃，直到退火温度降到55℃，再以此为退火温度循环4次；72℃，5 min延伸；4℃，10min。随后通过对PCR产物进行Recon-condition PCR去除嵌合体以及异源双链的影响：94℃，3 min预变性；94℃，1 min变性；55℃，1 min退火；72 ℃，1 min延伸；共6个循环；72℃，10 min延伸；4℃，forever。

（4）扩增产物检验：将扩增产物上样于2%琼脂糖凝胶［9］Gel Red染色，于1×TAE 缓冲液中150V电泳30min，以2000bp DNA marker为Marker，使用凝胶成像系统Syngene 进行检验。

1.3.3 变性梯度凝胶电泳（DGGE）

以下操作均按照DGGE仪The DCode TM Universal Mutation Detection System说明书进行。

DGGE凝胶制备：

（1）用洗涤液仔细清洁矩形玻璃平板，横竖分别擦洗三遍，随后用去离子水将其彻底漂洗干净。操作时须带手套，并且只能握持玻璃平板的边缘，以防止玻璃平板的灌胶面受到污染。

（2）将较大的玻璃平板平放于工作台上，将相同厚度的两块垫片分别放置于玻璃平板左右两短边上，然后将较小的玻璃平板放置于垫片上，同时使两块玻璃平板的底部对齐，从而在两块玻璃之间形成灌胶夹层。

（3）将夹层钳放置于玻璃平板两短边上，调整位置使两块玻璃平板嵌入夹层钳的槽口，随即旋紧夹层钳的螺杆将玻璃平板夹紧。

（4）将上述装置放置于灌胶支架的对齐插槽中，使较小的玻璃板面向操作者。松掉夹层钳的螺杆，在两块玻璃平板之间插入比齐卡并进行适当调整，使垫片和玻璃平板及夹层钳平行。

（5）取出比齐卡并检查，如果各部件已经对齐且密封性良好则将夹层钳螺杆旋紧。否则重复步骤4-5。

（6）将灰色海绵放置于灌胶支架前插槽上，将步骤5中准备好的装置放置于海绵上，同时使较小的玻璃板面向操作者。然后将其固定。

（7）分别将两注射器标记为LO（低浓度溶液）和HI（高浓度溶液），并分别与15.5cm 的聚乙烯管相连，同时将其放置于梯度形成系统的正确位置，使之能与该系统的杠杆正确连接。

（8）在梯度形成系统上设置进样体积，本实验选用16×16cm（1mm厚）凝胶，故将进样体积设置为13.5ml。

（9）在已配制好的高浓度变性剂和低浓度变性剂的丙烯酰胺原液中加入10%的过硫酸铵和TEMED后混匀。用已接好聚乙烯管的HI注射器和LO注射器分别吸入高浓度变性剂溶液和低浓度变性剂溶液各15ml。本实验选用变性剂浓度梯度为35%-55%，其原液组成如下：

变性剂浓度35% 55%

40%丙烯酰胺4ml 4ml

50×TAE 0.5ml 0.5ml

去离子甲酰胺 2.8ml 5.2ml

尿素 2.94g 5.46g

ddH2O 定容到20ml 定容到20ml

（10）小心排除两注射器中的空气并将其与梯度形成系统的杠杆连接，同时将两注射器上的聚丙烯管与分别与三通管的两个通道相连，三通管剩下的一个通道通过9cm的聚丙烯管与灌胶夹层相连，采用顶部灌胶的方法制备变形梯度凝胶。

（11）缓慢均匀地转动梯度形成系统上的凸轮，使丙烯酰胺溶液逐渐充满灌胶夹层并形成变形梯度。

（12）灌胶完成后，小心插入梳子。室温放置1h，待凝胶聚合后小心地拔出梳子。用1×TAE缓冲液冲洗凝胶孔，以除去可能残留其中的未聚合的丙烯酰胺。

DGGE电泳：

（1）上样前将1×TAE缓冲液预热到60℃并在此温度下进行电泳。

（2）取5μl PCR产物与5μl 2×Gel Loading Dye混合，用10μl微量移液器加到凝胶上的加样孔里。

（3）220V，电泳10分钟。随后85V，电泳13小时。

（4）电泳结束后对凝胶进行染色，使用GS-800灰度扫描仪成像。通过Bionumerics 软件对DGGE分子指纹图谱进行相关分析。