种牛冻精保存和使用

精液冷冻保存是将精液进行特殊处理，保存在超低温下，以达到长期保存的目的。通常采用液氮（—１９６℃）和干冰（—７９℃）保存。其最大优点是可长期保存，使用不受时间、地域以及种用雄性动物寿命的限制。可充分提高公牛的利用率。现将冷冻精液保存起来和怎样进行解冻及给母牛输精的有关技术操作介绍如下，供参考。

一、稀释液的配方：

１２％的蔗糖液７５毫升、甘油５毫升、卵黄液２０毫升。

二、稀释方法：

将经过检查合格的精液（活力０•６以上、精子密度中等）按１：２—５倍稀释液进行稀释，其稀释原则应保证每个颗粒精液中所含精子数不少于３０００—４０００万个，解冻后呈直线前进运行的精子不少于１５００万个。

三、冷冻：

在装有液氮的容器上置一铜纱网，距液氮面２厘米左右，使温度维持在—８０℃至—１００℃。将平衡后的精液用滴管按一定量（０•１毫升）滴于铜纱网、滴完最后一滴停３—５分钟后，当精液颗粒颜色变白时，立即浸入液氮，并将全部颗粒取下，收集于贮精瓶或纱网布袋内，并做好标记，然后立即移入液氮罐中贮存。

四、解冻：

将预先配制好的２•９％柠檬酸的溶液１毫升，放入干净的小试管中，再置于４０℃左右的温水杯中，迅速取颗粒冷冻精液１粒放入试管。轻轻摇动至化冻时，从水杯中取出试管，接着检查精液活力，不低于０•３即为合格品。

五、重视保精、快速解冻与镜检

１、根据液氮罐的性能要求，定期添加液氮罐内盛装冻精的提筒不能露在液氮面外。２、取精时，尽可能用长镊子，切勿将提筒或纱布袋提到临界线以上处（罐顶１０厘米左右）。

３、从液氮中取出细管冻精时，要轻轻甩１—２下，将塑料细管的棉塞端放入３５—４０℃的温水中，把封口端留在水外１—１•３厘米外，待管内精液融化一半时，立即取出备用。

４、解冻后的精液镜检时，精子的活力不低于０•３方可用于输精，才能确保正常受精。

５、解冻后的精液应立即输配，不宜停放时间过长，应做到现解冻、现输精。

六、适时输精

母牛正常排卵是在发情结束后６—１２小时，精子在母牛生殖道的存活时间为１２—２０小时，且还需要４—６小时的获能过程，才能与卵子结合受精。精子１５分钟就会到达输卵管受精部位，因此，让精子早于卵子到达输卵管受精部位是提高受胎率的先决条件。

１、适宜的输精时间：是在母牛的发情后期。此时母牛表现：精神平稳，外阴部肿胀消失，阴道不再流出透明液体。直肠检查卵泡胀大，表面紧张，有一触即破之感。此时为最佳输精时机。

２、适宜的输精部位：是在子宫颈内口１厘米处即子宫体基部，过浅易导致精液外流，过深易损伤子宫内粘膜。

３、适宜的输精方法：直肠把握子宫颈输精法。将母牛保定，左手插入母牛直肠轻轻握住子宫颈后端，右手将输精器自阴门向斜上方缓慢插入５—１０厘米（以避开尿道口）再改为平插送到子宫颈口，缓慢越过子宫颈管中的皱壁，到达子宫颈基部，徐徐注入精液后，缓缓抽出输精器。

４、适宜的输精次数：以１—２次为宜。可在发情母牛发情高潮后，黄牛在发情高潮后

６—１２小时，水牛在发情高潮后１８—２０小时进行第一次输精，前后间隔８—１２小时再进行第二次输精。

B1 抽样

B1.1样品的收集

抽样：从受检单位精液库中抽取样品。

送样：将样品送至检验机构。

B1.2抽样方法

B1.2.1正常检查一次抽样方案

各品种投产公牛按牛号顺序排列，由抽样人员现场随机确定取样牛号。

B1.2.1.1各品种公牛抽样头数，按照GB2828－87中2.1.29条有关标准的规定。

B1.2.2全部取样

对已投产的公牛每头取样。

B1.2.3样品的抽取

凡确定取样的公牛，从其精液贮藏罐中随机抽取一个包装量的精液（不得少于Zo份）。B1.2.4样品的保存

B1.2.4.1存放冷冻精液的低温容器质量应符合GB5458规定，使用前经过清洗后加入新鲜液氮。

B1.2.4.2取放样品时空中暴露时间不得超过5秒。

B1.2.4.3由专人保管样品，不能脱离液氮，抽样报告单随样品行。

B1.2.4.4样品包装、标记应保持原样。

B2 剂量检查

主要器材天平（精度木低于干分之一）、小烧杯、剪刀。

B2.1细管

取三支细管冻精，解冻后剪去超声波封口端，把精液挤入小烧杯内（小烧杯的重量应事先称取或事先去掉烧杯重），用天平准确称取精液的重量（W），精液的比重（D=1.04）。每支细管冻精的剂量=W／3D。

B2.2颗粒

取三粒颗粒冻精，直接放入小烧杯内用天平准确称取精液的重量（W），每颗颗粒冻精的剂量=W／3D。

B3 精子活力的检查

主要仪器和器材显微镜或显微电视装置、恒温水浴箱、5.0mL试管、载玻片或精液性状板、盖玻片（18×1 8）、显微镜保温箱或恒温装置、滴管、2.9％柠檬酸钠溶液。

B3.1解冻

细管直接置于37℃水浴中解冻；颗粒冻精置预先预热至38℃的内有1.0mL柠檬酸钠解冻液的试管中，水浴解冻，适当摇动，使冻精融化。

B3.2检查

取解冻后精液50μL（微升）置于载玻片上加盖被片立即在200-400倍显微镜下观察活力，环境温度或载物台温度保持38℃；也可通过电视显微装置在荧光屏上观察活力。每样品观察3个视野，注意不同液层内的精子运动状态，进行全面评定。

B4 每一剂量呈直线前进运动的精子数

主要器材血球计数板、血色素管、lmL吸管、小试管、计数器、显微镜或电视显微装置、滴管、3.0％氯化钠溶液。

B4.1检查方法

颗粒冻精用血色素管准确吸取10微升干解冻的精液，注入盛有0.99mL的3.0％氯化钠溶液的试管内，混匀，使之成为100倍稀释的稀释精液；细管精液用血色素管准确吸取20微升干解冻精液，注入盛有0.98mL的3.0％氯化钠溶液的试管内，混匀，使之成为50倍稀释的稀释精液。将备好的血球计数板用血盖片将计数室盖好，用小吸管吸取一滴稀释精液于血盖片边缘，使精液自行流入计数室，均匀充满不能有气泡或厚度过大，然后在显微镜下或电视荧光屏上观察计数。

B4.2计算公式

a．每剂量中精子数=5个中方格中的精子数（即计数室个中方格的总精子数）×10（l立方毫米内的精子数）×1000（每毫升精液的精子数）×100（颗粒稀释倍数）或 50（细管稀释倍数）×剂量值。

上式可简化为

每剂量中精子数=5个中方格精子数×500万（颗粒）或 250万（细管）×剂量值

b．每样品观察上下两个计数室，取平均值，如二个计数室计数结果误差超过5％，则应重检。

c．每剂量中呈直线前进运动精子数=每剂量中精子数×活力（％）

B5 精子存活率的检查

主要器材显微镜、恒温箱、吸管、载玻片、盖玻片。

B5.1解冻方法按照B2.1，精子活力的检查按照B2.2。

B5.2存活率的评定

冻精解冻后置37℃恒温箱中，保存4h检查活力。

2、细管冻精的解冻技术和解冻方法