常见标本细菌涂片-1
细菌涂片和革兰染色法
细菌涂片和革兰染色法是常用的微生物学实验技术，用于观察和鉴定细菌。
细菌涂片是一种简单而常见的方法，用于制备细菌样品的薄层。
它通常包括以下步骤：
1.取少量细菌样品：从培养基或临床标本中取少量细菌，并使用吸管或接种环在玻璃
片上均匀涂抹。
2.干燥：将涂片放置在室温下使其自然干燥，以确保细菌固定在玻璃片上。
3.固定：通过加热或使用特定化学药剂（如甲醇）进行固定，以保持细菌在涂片上的
形态结构。
4.染色：涂片可以使用不同的染色方法进行染色，例如格拉姆染色、苏木精染色等，
以区分不同类型的细菌。
5.观察：准备好的细菌涂片可在显微镜下观察。
通过观察细菌的形态、大小、排列方
式等特征，可以初步判断细菌的类型和特性。
革兰染色法是最常用的细菌染色方法之一，用于区分细菌的革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）两类。
它包括以下步骤：
1.取少量细菌样品：从培养基或临床标本中取少量细菌，并涂抹在玻璃片上。
2.固定：对细菌进行固定，通常使用加热的方法使其附着在玻璃片上。
3.染色：首先将细菌涂片涂上紫色的革兰染色试剂（如紫晶染剂），然后用碘溶液形
成复合物。
接下来，使用酒精溶液洗去多余染料，并进行脱色。
最后，用蓝色的对
照染剂（如苏木精）进行染色。
4.观察：通过显微镜下观察细菌涂片。
革兰阳性细菌会呈现紫色或深紫色，而革兰阴
性细菌则呈现粉红色。
革兰染色法的结果可以提供有关细菌类型及其细胞壁结构的信息，这对于细菌分类和鉴定非常重要。
它是微生物学中常用的一种初步鉴定方法。
实验一细菌形态和结构观察，涂片制作及染色法.pdf
实验一 细菌形态和结构观察，涂片制作及染色法 课程名称：兽医微生物学 实验学时： 2学时一、目的要求1．了解、熟悉油镜的使用和使用原理。
2．掌握细菌抹片的制备及美蓝和革兰氏染色方法。
3．能够识别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的染色特征。
4．熟悉细菌的基本形态学特征和特殊构造。
二、知识背景细菌个体微小，无色透明，在一般显微镜下不易识别，必须用适当的染料使其着色后，才能看到其形态、排列和结构。
某些细菌因有特殊的染色性，更可借特殊的染色方法加以鉴别。
因此染色技术是细菌鉴定中的基本技术之一。
检查微生物标本，需要使用显微镜。
比较多用的是普通光学显微镜。
根据不同要求，可使用暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜。
前几种显微镜用可见光线或紫外光线作照明光源，它们都属于光学显微镜；电子显微镜则是用电子流代替照明光源，与光学显微镜不同。
［普通光学显微镜的构造和使用］普通光学显微镜（或称生物显微镜）的构造，使用与保护方法，已在《组织学与胚胎学》教材中讲过，这里概述油镜的原理和使用要点：检查细菌标本，多用油镜进行，油镜是一种高倍放大（95-100倍）的物镜，一般都标有放大倍数（如95×；100×等）和特别标记，以便识别。
国产镜多用“油”字表示，国外产品则常用“Oil 或“HI”作记号。
油镜上还常漆有黑环或红环，而且油镜镜身比高倍镜和低倍镜长，镜片最小，这也是识别的另一个标志。
油镜头的晶片细小，进入镜中的光量也较少，其视野比用高倍镜时为暗。
当油镜头和载玻片之间为空气层所隔时，因为空气的折光指数与玻璃的不同，故有一部分光线被折射而不能进入镜头之内，使视野更暗；若在镜头与载玻片之间放上与玻璃的折光指数相似的油类，如香柏油等，使光线不致于因折射而大为损失，则可使视野充分照明，并能使操作者清楚地进行观察和检查（图l ）。
实验室中几种常用物质的折光指数 品名 玻璃 檀香油香柏油 加拿大树胶二甲苯 液体石蜡松节油甘油 水 折光指数 1.52-1.59 1.52 1.51 1.52 1.49 1.48 1.47 1.47 1.33进行油镜检查时，应先对好光线，但不可直对阳光，采取最强亮度（升高集光器，开大光圈，调好反光镜等）。
常见微生物标本的采集
常见微生物标本的采集、处理与检测标本采集的基本原则：尽早采集、根据可疑的病原体，选择不同采集时机和标本种类、在抗生素应用前采集、遵守无菌操作、正确保存和运送。
容器应密封不易碎，标本不得污染容器的口和外壁。
1.血液标本正常人的血液是无菌的。
当细菌侵入时可引起严重的菌血症或败血症。
一般情况下在患者发热初期或发热高峰时采集；持续性菌血症可随时采集；间歇性菌血症，应预测其体温上升期进行采血。
一般在使用抗生素前采集2~3次；多部位采集，如两侧肘静脉或动、静脉同时采取；对于已使用抗生素而无法停止的患者，也应在下次用药前采取。
在感染局部的附近血管中采血，可提高阳性率。
采血量成人一般5~10ml，婴幼儿1~2ml。
采集的血液标本注入培养瓶中先进行增菌培养，培养基和血液标本量的比例应>10：1，将血液中的各类杀（抑）菌物质充分稀释。
需氧菌常用培养基有胰酪蛋白大豆胨肉汤和葡萄糖酚红肉汤等，常加入对氨基苯甲酸（PABA）50μg/ml中和磺胺类，青霉素酶2单位/ml破坏青霉素类，硫酸镁中和链霉素、四环素、土霉素、金霉素、新霉素及多粘菌素等抗生素。
加入0.03~0.05%的聚茴香磺酸钠（sodium polyanethol sulfonate, SPS）可抑制血清中的抗菌物质，并对氨基糖苷类和多肽类抗生素有灭活效果。
并加入Ⅹ、Ⅴ因子等生长因子。
培养瓶每天观察一次。
如发现①培养瓶内液体浑浊；②血球层上面出现颗粒状的生长物，并且有自下而上的溶血；③有明显的凝块；④液体表面有菌膜，培养液清晰或浑浊等，表明有细菌生长。
直接进行涂片染色初步报告。
同时分别接种血平板、巧克力（色）平板，普通培养和5%CO2 35℃培养。
也可直接进行体外药敏试验。
无细菌生长迹象的培养瓶孵育至第7d，接种血平板、巧克力（色）平板，分别进行普通培养和5%CO2环境35℃孵育24h。
为了提高检出的速度，在培养的第2~3d时应移种一次。
有厌氧菌感染时，同时注入需氧瓶和厌氧瓶，厌氧培养基通常用硫乙醇酸盐培养基、牛心脑浸液肉汤等；培养液中有刃天青，无氧时无色，有氧时呈红色。
细菌标本片的制备及染色方法
能利用不同的材料进行细菌标本片的制备 掌握常规的染色方法，并认识细菌的不同染色特性
仪器材料
酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、美 蓝染色液、革兰氏染色液、瑞氏染色液、染色缸、 染色架、洗瓶、显微镜、香柏油、乙醇乙醚、擦镜 纸、细菌培养物（大肠杆菌、葡萄球菌等）、细菌 病料、无菌镊子和剪刀、特种铅笔等
1．碱性美蓝染色液
甲液：美蓝0.3g、95%酒精30mL； 乙液：0.01%苛性钾溶液100mL 先配甲液，将美蓝放入研钵中，徐徐加入酒精 研磨均匀后，把甲、乙两液混合，过夜后用滤 纸过滤即成。新鲜配制的美蓝液染色不好，陈 旧的染色好。
2．革兰氏染色液
（1）草酸铵结晶紫溶液 甲液：结晶紫2g、95%酒精20ml； 乙液：草酸铵0.8g、蒸馏水80ml 将结晶紫放入研钵中，加酒精研磨均匀制成甲液，然后将完全溶 解的乙液与甲液混合即成。
2．革兰氏染色法
（1）在固定好的抹片上，滴加草酸 铵结晶紫染色液，作用1～ 3min，水洗。
（2）加革兰氏碘液，作用1～2min， 水洗。
（3）加95％酒精脱色约30s至1min， 水洗。
（4）加稀释石炭酸复红，复染30s左 右，水洗，吸干后镜检。
结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰 氏阴性菌呈红色。
（2）组织抹片的制作
待检尸体经无菌手术切开胸腹腔后，用经火焰灭菌的 镊子夹起组织，用灭菌剪刀剪下小块组织，将组织切 面在载玻片上等距离轻压几下，使其留有组织切面的 压迹。
（二）常用的细菌染色方法
1．美蓝染色法 2．革兰氏染色法 3．瑞氏染色法
1．美蓝染色法
在已固定好的抹片 上，滴加适量美蓝染色 液覆盖涂面，染色2～ 3 min， 水 洗 ， 吸 水 纸 轻压吸干或晾干和镜检， 结果菌体呈蓝色。
11.1.3细菌学检验的结果报告
临床标本各种各样 检验项目不尽相同 细菌种类数不胜数 检验结果究竟该如何报告？
一、涂片结果的报告
1、一般细菌涂片： 革兰染色，显微镜下观察
据细菌染色性和形态报告： “找到革兰阳性球菌（杆菌）” “找到革兰阴性球菌（杆菌）”
未发现细菌报告： “未找到细菌”
一、涂片结果的报告
二、细菌培养的结果报告
1、一般细菌培养的结果报告： 阳性报告： 报告具体鉴定菌名及药敏。
二、细菌培养的结果报告
2、真菌培养的结果报告： 阴性报告：“经7天培养无真菌生长”。 阳性报告：报告具体的真菌种类以及药敏情况
二、细菌培养的结果报告
3、沙门、志贺菌培养的结果报告： 阴性报告：“未检出沙门菌属和志贺菌属” 阳性报告：沙门、志贺菌种及药敏情况
痰、咽拭子、口腔拭子：“正常菌群生长” 无菌体液：“经需氧（厌氧）培养5天无细菌
生长” 导管、导管尖端：“培养4天无细菌生长”
二、细菌培养的结果报告
1、一般细菌培养的结果报告： 阴性报告： 妇科、产科分泌物：“正常细菌群” 其他 科室分泌物以及脓液、尿液、引流液
等：经2天培养无细菌生长”
4、淋球菌涂片： 发现革兰阴性双球菌，呈肾型，存
在于细胞内或细胞外： “找到革兰阴性双球菌，（疑似淋 球菌）” 未发现：“未找到革兰阴性双球菌”
一、涂片结果的报告
5、结核分枝杆菌涂片： 抗酸染色，查见红色杆菌：
“找到抗酸杆菌” 未找到红色杆菌：
“未找到抗酸杆菌”
二、细菌培养的结果报告
1、一般细菌培养的结果报告： 阴性报告：
2、真菌涂片： 发现革兰阳性卵圆形芽生孢子或假菌丝：
“找到真菌孢子及菌丝” 未发现革兰阳性卵圆形芽生孢子或假菌
细菌涂片法步骤
细菌涂片法步骤
涂片法是装片法制作玻片标本的一种方法。
制作方法是，细菌可以用细菌液直接涂布在载玻片上，盖上盖片直接观察或干燥后染色观察，染色观察通常需要洗去染色液后观察。
为了观察细菌的典型形态,应取处于对数生长期的细菌进行涂片。
实验准备材料：酒精灯、接种环、染液、载玻片、菌种、生理盐水等步骤：
1.取清洁无油玻片一块，置火焰上通过数次，用烧灼并冷却了的接种环取菌液1～2环，均匀涂布于载玻片中央（直径1～1.5 cm）。
注意：将接种环在火焰上烧灼灭菌，要保证接种环是无菌的。
3.待接种环冷却后从固体培养基上挑取少许菌落，注意挑取菌落不宜太多，避免造成细菌堆积。
4.将接种环挑取的菌落与置于载玻片的生理盐水上混匀，形成直径约1cm的涂面，要薄而均匀，使细菌呈现单层分布，涂匀后再次将接种环在酒精灯上烧灼灭菌。
5.干燥：涂片放室温自然干燥；也可将标本面向上，在离火焰约15 cm高处微微加热烘干，切勿靠近火焰；或用电吹风吹干。
6.固定涂片：常用加热固定法，固定的方法是手执载玻片一端，标本面向上，在火焰外焰上水平地以钟摆速度来回通过3次，注意温度不宜太高，以玻片反面触及手背部皮肤感觉热而不烫为宜。
涂片的制作有一定要求，即涂片不能太厚，细菌在涂片中应呈单层分布。
临床微生物学检验理论课：02细菌鉴定试验-涂片染色
涂片抗酸染色结果观察
镜检时，油镜下仔细查遍整个涂片或至少100个视野； 抗酸性菌呈红色，其它细菌及细胞呈蓝色； TB为细长，着色不均匀，可2个以上的菌形成V、Y、T
等或平行排列等。
涂片抗酸染色结果报告
结果报告，1984年国内统一暂行规定报告方式： 未找到抗酸菌-； 找到抗酸杆菌1或2个，全视野发现1或2个； 找到抗酸杆菌+，全视野发现3-9个； 找到抗酸杆菌++，全视野发现10-99个； 找到抗酸杆菌+++，每视野发现1-9个： 找到抗酸杆菌++++，每视野发现10个以上。
（二）蛋白质和氨基酸的代谢试验
吲哚（靛基质或蛋白胨水）试验： 阳性：色氨酸酶，分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚，
加入指示剂形成红色界面； 阴性：加入指示剂不变色； 区分普通变形杆菌（+），奇异变形杆菌（-）。
尿素分解试验： 阳性：尿素分解酶分解尿素产生大量的氨，使培养基
呈碱性，加入指示剂为红色； 阴性：加入指示剂不变色。
4、墨汁染色查隐球菌
新生隐球菌广泛分布于自然界，也可存在于人体体表、 口腔及肠道中；
经呼吸道侵入人体，由肺经血行播散时，可侵犯所有脏 器组织，主要侵犯肺、脑及脑膜；
好发于细胞免疫功能低下者，如AIDS、恶性肿瘤、糖尿 病、器官移植及大剂量使用糖皮质激素者；
临床上怀疑脑膜炎时，常抽取脑脊液检查细菌真菌、抗 酸菌、隐球菌。
3、涂片抗酸染色：检查抗酸杆菌
据世界卫生组织估计，全球每年增加结核病人约800万 1000万，死亡病人约300万；
全人类的三分之一即17亿人曾感染过结核杆菌； 结核病人主要见于发展中国家，尤其经济落后地区； 我国是结核病高发国家，广东地区发病率较高。
常见细菌及图片
肺炎克雷伯菌1.宇文皓月2.形态结构：肺炎克雷伯菌肺炎亚种为革兰阴性杆菌，无鞭毛，无芽孢，标本直接涂片或在营养丰富培养基上的营养物可见菌体外有明显的荚膜。
3.培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，在初次分离培养基可形成较大、凸起灰白色黏液型的菌落。
菌落大而厚实、光亮，相邻菌落容易发生融合，用接种蘸取时可挑出长丝状细丝。
在麦康凯琼脂（MAC）培养基上形成较大的黏液型、红色的菌落，红色可扩散至菌落周围的培养基中。
在伊红美蓝琼脂（EMB）上为大、粘稠、红色、易融合成一片的菌落。
在血琼脂上为灰白色、大而黏、光亮且形成菌丝的菌落。
4.生化特性：氧化酶阴性，葡萄糖产酸产气，动力阴性，吲哚阴性，脲酶阳性。
金黄色葡萄球菌典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。
金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。
金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH7.4。
平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。
血平板菌落周围形成透明的溶血环。
在EMB培养基上基本不生长。
金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。
可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。
甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。
许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。
金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。
大肠埃希氏菌1．形态与染色特性菌体两端钝圆、中等大小，杆状(有时呈卵圆形)、1—3um X0.6um、周生鞭毛，能运动，不发生荚膜，革兰氏阴性，而且一般是对碱性染料着色较好，但有时两端着色较浓，要与巴氏杆菌区分开来。
2．培养特性1)需氧及兼性厌氧菌2)对营养的要求不高，在普通琼脂上就生长良好，在15C-45℃范围内均可生长，但最适生长温度为37℃，最适pH为7.2—7.4。
微生物各种标本的涂片检验程序
各种标本的涂片检验程序1.概述各种标本涂片的结果一方面可为临床提供快速的诊治依据，同时还可作为分离培养标本的质量指标。
例如，穿刺液（胆汁，胸腔积液，腹水，心包液等），脑脊液标本，因原部位是无菌的，只要检出细菌即可提示感染的原因，具有诊断意义。
粪便标本倡导微生态菌群含量甚多，粪便球杆菌比例涂片检查可反映菌群的数量和比例，有些细菌可通过直接涂片镜检来协助诊断疾病，如霍乱弧菌，难辨梭菌，假丝酵母菌感染等。
痰液涂片除了可初步判定是否有病原菌存在外，还用于确定标本取材是否合格，是否适合做细菌培养。
不同的标涂片检出不同的细菌各有不同的临床意义。
2.脑脊液涂片处理2.1.检验前处理2.1.1.革兰染色：肉眼观察，混浊或脓性脑脊液可直接涂片。
无色透明的脑脊液，首先进行2000r/min离心10min，倒去上清液用沉淀物涂片，经自然或温箱干燥、火焰固定后，进行革兰染色。
2.1.2.抗酸染色（萋-纳染色法）：脑脊液经2000r/min离心10min，倒去上清液后取沉淀物涂片，经自然或温箱干燥、火焰固定后，进行萋-纳法染色。
2.1.3.墨汁染色：脑脊液经2000r/min离心10min后弃去上清液，将离心标本沉淀物放于试管，与墨汁均匀混匀调至恰当的浓度（4:1），取一滴混合物于玻片上，然后盖上盖玻片，直接用高倍镜镜检。
2.2.染色操作各染色操作见《革兰染色操作程序》、《抗酸染色操作程序》、《墨汁染色操作程序》。
2.3.镜检与报告方式2.3.1.脑膜炎奈瑟菌涂片检查：涂片经革兰染色，在油镜下找到革兰阴性、平面相对的双球菌，细菌可位于细胞内或外。
此时可报告临床“找到革兰阴性双球菌位于细胞内（外）”。
如镜检未发现该细菌可报告“未找到革兰阴性双球菌”。
2.3.2.细菌、真菌涂片检查：涂片经革兰染色，根据细菌的染色特点、形态、排列，初步可报告“找到革兰阴性或阳性球菌呈XX排列”；如镜检未发现细菌可报告“未找到细菌”；在油镜下找到革兰阳性真菌孢子或菌丝，可报告“找到真菌孢子或菌丝”；镜检为发现真菌孢子或菌丝可报告“未找到真菌孢子和菌丝”。
细菌染色技术1
细菌染色技术(2010-11-22 22:29:46)目的要求初步掌握细菌涂片制作，单染色法及革兰染色法等染色技术。
实验内容1．细菌染色一般程序涂片干燥固定初染 (媒染) 脱色复染(1) 涂片临床标本或液体培养物可直接涂抹于洁净的载玻片上，固体培养的细菌先在玻璃片上滴一滴生理盐水，然后取菌少许在盐水中磨匀，呈轻度混浊。
涂好的菌膜大小一般以1cm2左右为宜。
(2)干燥涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于酒精灯火焰高处慢慢烘干，切不可在火焰上烧干。
(3)固定细菌的固定常用火焰加热法，即将上述已干的涂片在火焰中迅速通过3～5次，温度以手能摸时热而不烫为度。
目的在于杀死细菌，凝固细胞质，改变细菌对染料的通透性。
(4) 初染不同的染色方法，所用染液也不同。
染液以覆盖菌膜为度。
(5) 媒染通过媒染可增加染料和被染物质的亲和力。
媒染剂还可用于固定之后，亦可含在固定液或染液中。
(6) 脱色此步骤主要目的是观察细菌与染料间结合的稳定程度，作为鉴别染色之用。
(7) 复染细菌初染色被脱色后常以复染液复染，便于观察。
复染液的颜色与初染液有明显不同。
2．常用染料原液配制一般制备100ml纯酒精饱和溶液所需染料量：美兰2g～5g；结晶紫7g～14g；碱性复红3g～7g。
3．常用的染色方法(1) 单染色法即用一种染料染色的方法。
常用吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液。
1) 染液①吕氏美兰液美兰酒精饱和液30ml+0.01%KOH溶液70ml即成。
②稀释石炭酸复红液碱性复红酒精饱和液10ml+5%石炭酸溶液90ml，然后用蒸馏水作10倍稀释即成。
2) 菌种大肠埃希菌普通斜面培养物。
3) 染色方法于已做好的涂片上滴加吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液，染色1min，以水冲洗至无颜色流下为止，自然干燥或以远火烘干后镜检。
4) 结果以美兰染色者菌体呈现兰色；以稀释石炭酸复红染色的菌体呈现红色。
(2) 革兰染色法1) 原理细菌被结晶紫着色后，再经媒染剂处理，染成深紫色或紫黑色。
常见微生物涂片检查
结果报告：
阴性：抗酸染色镜检未发现抗酸杆菌。 阳性：抗酸染色镜检发现抗酸杆菌。
03
墨汁荚膜染色
新型隐球菌在组织中呈圆 形或卵圆形，外周有宽厚的荚 膜，荚膜较菌体大1～3倍， 折光性强，一般染色法不易着 色，常采用墨汁负染色法，在 黑色背景下可镜检到透亮菌体 和宽厚荚膜，非致病性隐球菌 无荚膜。
脱色：
D 除去残水后，滴加95%酒精进 行脱色约30 sec，后立即用流 水冲洗
镜检：
F 用滤纸吸水，干燥后，显微 镜油镜观察。
实验室快速革兰染色步骤：
1.用龙胆紫染色10s 2.用碘液酶染10s 3.用乙醇脱色10s
4.用沙黄溶液复染10s
注意事项：
涂片薄而均匀，单个菌落涂片时应滴加无菌生理盐水乳化。 制备后的涂片应自然干燥，加热固定，5s内将玻片来回过火焰四次。温度不
常见微生物涂片检查
微生物染色的基本原理
• 借助物理和化学因素的作用而进行
1、物理因素如：细胞及细胞物质对 染料的毛细现象、渗透、吸附作用 等。 2、化学因素如：正负离子之间的相 互吸引等
• 染色剂，按其电离后所带电荷的性质分：
1、酸性染料：酸性复红、刚果红、伊 红、藻红、苯胺黑
2、碱性染料：碱性复红、孔雀绿、番 红、结晶紫、美兰、甲基紫等
结果判读：
• 二、大便标本
• 主要报告球杆比，是肠道菌群失调一个重要的指标，指球杆比即粪便中G+ 球菌和G-杆菌的比例。
• 细菌约占粪便干重的1/3。成人粪便中主要的菌群是大肠埃希菌、肠球菌和 碱厌氧菌，约占80%。另外还有少量的产气杆菌、变形杆菌、芽胞菌及酵母 菌等。
• 长期使用广谱抗生素、免疫抑制剂及慢性消耗性疾病患者可发生肠道菌群失 调，引起革兰阴性杆菌数量严重减少甚至消失，而葡萄球菌或真菌等明显增 多，粪便中球菌/杆菌比值变大。粪便涂片染色后油镜可初步判断细菌的种 类，但确证需通过细菌培养与鉴定。
常见标本细菌涂片
尿常规湿片
革兰染色
尿液常见菌
革兰阳性菌 肠球菌属 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 腐生葡萄球菌 厌氧链球菌 化脓性链球菌 无乳链球菌 结核分枝杆菌 白念珠菌 光滑念珠菌
革兰阴性菌 大肠埃希菌 肺炎克雷伯菌 产气肠杆菌 沙门菌属 变形杆菌属 沙雷菌属 铜绿假单胞菌 不动杆菌属 阴道加德纳菌 淋病奈瑟菌
黏液型铜绿革兰染色
黏液型铜绿血平皿
黏液型铜绿抗酸染色
“ 过 目 难 忘 ”
黏液型铜绿瑞姬染色
黏液型铜绿 六铵银染色
粘液型肺克
3.真假“美猴王”
细胞连接处缩 窄，藕节样
竹节样，平切， 鹿角样分枝 （45°）
痰液里的真菌丝
支气管盥洗液可见 大量假菌丝
痰液10%KOH 压片400 倍
曲霉菌菌丝如鹿角，45°度 锐角分枝，盲端钝圆。
染 色
成对或短链排列。如右图菌落直
接涂片。
血培养金黄色葡萄球菌
菌体较大，葡萄串状，感觉不 厌氧瓶菌涂片体小，葡萄串状。 在同平面，易误认。
需氧瓶： 染料沉渣？
厌氧瓶
血培养G+链球菌？
多个视野阅片，特别 是较薄的地方看看。
皓 月 当 空 似 有 佳 人 来
百变美女—马内菲篮状菌
马内菲篮状菌是青霉中惟一的
一 河 两 岸 斗 鸡 眼
二、脑脊液
送检顺序：第一管生化，第二管微生物，第三管细 胞计数及其他。因为首管标本由于极易被皮肤定植 菌污染，不应做直接涂片、培养和分子研究。
脑脊液增菌：一般用儿童瓶，1-3ml，因为成人瓶含 聚茴香脑磺酸钠对奈瑟菌属的检出有影响，如怀疑 诺卡菌属、真菌或分枝杆菌等不常见细菌感染，应 提醒微生物室延长培养。
常见病原性细菌的分离鉴定方法1
在载玻片两端滴加生理盐水一滴，用 接种环挑取待检菌(金葡菌、白葡菌)， 分别与它们研磨、混匀，滴加兔血浆1滴， 立即观察有无凝固颗粒，若有即为阳性。 此法用于测定结合型凝固酶。
二、链球菌属
葡萄球菌菌落观察（教师示教）
分别取金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球 菌培养物，用分离划线方法接种血平板， 置37℃培养，18h～24h以后观察结果。
血琼脂平板中18h-24h后形成圆形隆 起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明 的菌落，不同菌种可产生金黄色、白色或 柠檬色色素。某些菌种（株）有溶血现象。
血浆凝固酶试验（教师示教）
（学生操作 ）
小结
1.一般细菌的鉴定流程 2.化脓性球菌的鉴定方法
一般细菌的鉴定流程 细菌学检验Biblioteka 采集标本和注意事项的一般程序
分离与培养 1.培养基的选用
2.培养方法
3.无菌操作
细菌的鉴定 1.涂片，革兰染色，镜检
2.生化反应
3.血清学鉴定
化脓性球菌的生物学性状
葡萄球菌 链球菌（肺炎球菌） 奈瑟菌属
麦芽糖发酵试验：分别取脑膜炎球菌、 淋球菌接种于麦芽糖发酵管中，置 37℃24h～48h观察结果。
细菌学检验的一般程序
涂片染色
初步诊 断报告
增菌
快速诊 断试验
接种平板培养基，分离单个菌落
挑取可疑菌落
涂片染色
各种鉴定试验
生化试验 血清学实验 动物试验 药敏试验
明确诊断报告
血液标本
革兰染色 染色性 形状排列
血平板分离培养 溶血现象、革兰染色
初步诊断
常见细菌涂片
➢>10鳞状上皮细胞/LPF——不合格
痰涂片的判读
痰涂片的判读
❖ 痰标本检出假菌丝
低倍镜下假菌丝
高倍镜下假菌丝
痰涂片的判读
❖ 真菌丝和假菌丝鉴别要点
油镜下假菌丝形态：菌丝有隔，分隔处有缩窄，并且有相应的孢子。 真菌丝：菌丝可以有隔也可以无隔，两条平行菌丝,分隔处无缩窄。
痰涂片的判读
标本中折射性或者染色不均的，有分枝状的杆菌，可能抗酸杆菌， 一定要同时做强弱抗酸染色。
革兰阳性球菌呈堆排列，通常很圆， 细胞较大，不拉长，可成对,可能因脱 色过度看似革兰阴性双球菌。
❖革兰阳性球菌（链球菌）
革兰阳性球菌长链状排列>6个
❖ 革兰阳性杆菌
形态学鉴别要诀
两端截平，可能是芽胞杆菌属， 如枯草杆菌
革兰阳性不规则的杆菌（多形态）， 一端比另一端粗，八字状，栅栏状排列 可能是棒状杆菌属，如类白喉杆菌
阴道加特纳菌和厌氧菌黏附于上 皮细胞边缘，成为“线索细胞”
大量乳酸杆菌缺失是细菌性阴道 病的标志
除乳酸杆菌外，其它细菌很少， 多种形态并存 特别是弯曲的杆菌
混杂的细菌形态提示厌氧菌和阴 道加特纳菌
白细胞，酵母菌，精子等可能存 在
革兰染色不能辨别阴道毛滴虫
无菌体液涂片的判读
低倍：真菌 丝，假菌丝
油镜：白细 胞
油镜：细菌， 真菌，胞内 吞噬现象
步骤1
步骤2
步骤3
❖ 分泌物标本
无菌体液涂片的判读
涂片中的丝状体也是阴 性杆菌（可能是受药物 影响或者细菌处于有丝 分裂的状态，导致菌体 发生较大变化。）
无菌体液涂片的判读
❖分泌物标本
低倍镜下更容易发现菌丝，直 接用油镜观察容易造成漏检。
实验二细菌涂片的制备和染色镜检
革兰阳性菌 革兰阴性菌
革兰氏 染 色法
革兰氏染 色法动画
实验报告：
1、细菌抹片或涂片革兰氏染色的显微镜观察结果。 2、革兰氏染色法的具体程序和注意事项。
细菌的单染色
涂片
干燥
固定
镜检
水洗、吸干
染色1~2min
细菌抗酸染色
1. 初染:用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰 高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发 减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用 水冲洗。
2. 脱色: 3%盐酸酒精脱色30秒~1分钟；用水冲洗。
3.复染：用碱性美兰溶液复染1分钟，水镜检
目的要求：1、掌握细菌抹片的制备方法和常用染色方法。 2、认识革兰氏染色和抗酸性染色的反应特性。
实验内容：
1、 细菌抹片的制备：
玻片准备：透明、洁净、无油渍。
细菌抹片 的制备
抹片：液体材料、非液体材料、组织脏器材料的抹片方法讲解、示范。
干燥固定：火焰固定和化学固定的示范。讲解其目的及注意事项。
5.复染：用复红液复染约2分钟，水洗。 6. 镜检：用滤纸吸水，干燥后，显微镜油镜观察。
革兰氏染色法原理：
革兰氏染色法将细菌分为G＋和G- ，这由两类细菌细胞壁的结构和组成 的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染 剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。 用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。G＋细菌的细胞壁主 要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使 细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫—碘的复合物 不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。 G-细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处 理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫—碘的复合物比 较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色。
细菌标本片的制备及染色法
• 室温下自然干燥
血涂片及瑞士染色
1 推片 2 干燥 3 瑞氏染色
• 滴加瑞氏染色液于涂片上 以固定标本，1～3min后， 再滴加与染色液等量的磷 酸缓冲液或中性蒸馏水于 玻片上，轻轻摇晃使与染 色液混和均匀，5min左右 水洗，干后镜检
•ห้องสมุดไป่ตู้注：瑞氏染液含甲醇，无需另 行固定
明确本技能在实践中的意义。
• 标本片固定必须确实，以免水洗时菌被冲掉。
• 水洗时，不要先弃去染液，应让水与染色液一并冲 洗掉，以避免染色液中沉渣粘附于玻片影响染色效 果。
谢谢观看
水洗 水洗 水洗
革兰氏染色镜检结果
葡萄球菌（G+菌，蓝紫色）
大肠杆菌（G-菌，红色）
血涂片及瑞士染色
1 推片 2 干燥 3 瑞氏染色
45°
• 取一张边缘整齐的载玻片，用其一端醮取血 液等液体材料少许，在另一张洁净的玻片上， 以45°角均匀推成一薄层的涂面。
血涂片及瑞士染色
1 推片 2 干燥 3 瑞氏染色
细菌病料触片及美兰染色
1 触片 2 干燥 3 固定 4 美兰染色
• 镊子、剪刀在酒精灯火焰上烧灼灭菌，用镊子夹持、剪刀剪取小块 病料组织，以其新鲜切面在玻片上轻触3~5个压迹。
细菌病料触片及美兰染色
1 触片 2 干燥 3 固定 4 美兰染色
• 室温下自然干燥或将标本片 的涂面向上，置酒精灯火焰 高处微烤加热干燥。
实验目标
• 使学生掌握利用细菌病料、细菌培养物、血液等材 料制备标本片的方法及常用染色法。
• 进一步认识细菌的形态结构，，会识别病料组织标 本片上的细胞和细菌，能区分培养物标本片上的G+ 菌、G-菌。
• 明确本技能在实践中的意义。
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制片：革兰染色、抗酸染色、墨汁染色前应进行离 心，2000r，10-15min，细胞离心机可以提高阳性率。
隐球菌为圆形，革兰阳性，有出芽，但无真、假菌丝。
纯菌落涂片易见六边形样排列。最常见的新型隐球菌， 菌体外有宽厚荚膜，荚膜比菌体大1-3倍，折光性强， 一般染色法不易着色，常用墨汁负染色法。
3.真假“美猴王”
细胞连接处缩 窄，藕节样
竹节样，平切， 鹿角样分枝 （45°）
痰液里的真菌丝
支气管盥洗液可见 大量假菌丝
痰液10%KOH 压片400 倍
曲霉菌菌丝如鹿角，45°度 锐角分枝，盲端钝圆。
4.“鬼影”
李晨提供
抗酸染色
抗酸一液加热有致癌性，目前用的Fra bibliotek是高浓度石炭酸 冷染！脱色要完全，时间灵活掌握，一般到无肉眼可 见染液流出为止。
第一步：1%沙黄水溶液（抗酸3 液），在酒精灯火焰上微微加热 至出现蒸汽为止，2分钟后水洗。
第二步：用1%亚甲蓝染色液（革 兰1液）复染60秒。 染色后镜下形态特点 本属细菌为革兰染色阴性，短小 球杆菌，菌体常单个存在，少见 成对或短链排列。如右图菌落直 接涂片。
柯 氏 染 色
血培养金黄色葡萄球菌
的杆菌，联系大夫得知，病人糖尿病、发烧、有尿路感 染症状。建议送即时尿培养，结果是满板的大肠。
尿常规湿片 革兰染色
尿液常见菌
革兰阳性菌 肠球菌属 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 腐生葡萄球菌 厌氧链球菌 化脓性链球菌 无乳链球菌 结核分枝杆菌 白念珠菌 光滑念珠菌
少见吞噬、有荚膜的G+肺炎链球菌
吞噬G+肺炎链球菌
吞噬菌多为感染菌，却不一定是优势菌。
镜下很难区分，结合临床综合分析
痰液吞噬鲍曼不动杆菌
痰液吞噬卡他球菌
2.留意粘液型细菌
黏液型铜绿革兰染色
黏液型铜绿血平皿
黏液型铜绿抗酸染色 黏液型铜绿 六铵银染色
“ 过 目 难 忘 ”
黏液型铜绿瑞姬染色
粘液型肺克
血培养单瓶报阳，应综合其他炎性指标，如血象、PCT、 CRP、G/GM试验以及临床症状综合分析。
阅片时应特别留意布鲁菌属、金黄色葡萄球菌、马内菲 篮状菌、鲍曼不动杆菌（染色不定）。
血培养报阳革兰染色看不到细菌？仔细看细砂粒 样一片一片东东是什么？
布鲁菌属
生长缓慢，专性需氧（只有需氧瓶报阳）血 培养报阳时间一般得3-4天，此菌为人畜共患病原菌，为细 胞内寄生菌，由于其对人有极强的致病力，常导致实验室获 得性感染，被认为是潜在的生物恐怖病原菌。必须在2级及 以上水平实验室，并在安全柜中处理。 血培养报阳曲线平缓103h 转板24h菌落细小
（一）痰细胞学筛选标本
不合格标本
指唾液或唾液严重污染的 痰标本，含大量的鳞状上 皮细胞多，而白细胞少。
合格标本
应是从下呼吸道咳出的痰， 镜下以白细胞为主，鳞状 上皮细胞少。
痰涂片镜检评价表：
分类中1～3类不做培养，要求重新留取标本；4、5类为合格标本；
Remember: Garbage in, Garbage out！
慢性皮肤坏死、溃疡性结节：放线菌，奴卡菌，分枝杆菌
外耳道：金葡菌，化脓性链球菌，大肠杆菌，铜绿假单胞菌，曲 霉菌
耳分泌物
标本涂片革兰染 色可见真菌菌丝
沙氏琼脂、血 平板培养48h
“美的不像话”
乳酸芬棉兰压片
脓液标本可见大 量吞噬G+球菌
这是原始板， 不是分纯的。
功夫不负有心人，当你坚持寻找的目标期遇在你的 显微镜下时，你的心里瞬间如烟花般绚烂。
阴道加德纳菌
阴道分泌物
标本可见大量白细胞,上皮少， BV(唾液酸酶法)阴性，瑞姬染 色如下。
给点染液就灿烂！？
革兰阴性细杆菌
阴性细杆菌美兰染不上？
白带常规湿片 看有真菌孢子
革兰染色
用10% K0H溶解细胞，真菌及菌丝更清楚。
分泌物淋球菌 男性分泌物查淋球菌易见， 女性阴道细菌繁多，淋病 奈瑟菌的检查必须靠培养 及准确的鉴定，推荐PCR或 培养方法。 新生儿眼部分泌物涂 片，如果看到白细胞 内外存在革兰阴性双 球菌是有意义的。
抗生素使用前采集标本，立即送检、及时接种。
如果不能在30min内接种应置于冰箱，冷藏保存
标本必须在6h内进行接种
冷藏保存的标本不能用于淋病奈瑟菌培养
尿培养有助于尿路感染的诊断，关键是留取合格 标本，出现多种细菌生长应联系临床，询问病人 有无插管，标本是如何留取的。
“多此一举？”门诊病人尿常规可见大量细长
5.革兰染色可见分支状菌丝？
弱抗酸染色
染色方法：用抗酸 染液试剂盒，只需 换掉第二步脱色液， 2-3%的硫酸（免疫 室的终止液），一 般不稀释，脱到没 有红色溢出，约30 秒，其他两步同抗 酸染色（复染时间 可缩短些）。
皮疽诺卡菌
豚鼠奴卡弱抗酸
五、生殖道分泌物
阴道分泌物
线索细胞
上皮细胞和乳酸杆菌
六、伤口分泌物及脓液
伤口分泌物应评估其质量，白细胞>10个/Lp，鳞状上皮<10个/Lp 为合格标本。 所有标本都应进行涂片。 封闭性脓肿应革兰染色，帮助检出厌氧菌，若发现G+芽孢杆菌， 应注意产气荚膜梭菌和破伤风梭菌（鼓槌状）。 创伤（交通事故、刺伤等）分泌物：创伤弧菌，炭疽芽孢杆菌， 破伤风梭菌；巴斯德菌属（动物咬伤）
柯氏染色，菌体较清楚，找到元凶了。
布鲁菌属的鉴定
革兰
染色细小的G-球杆菌 氧化酶阳性（+） 触酶（+） 麦康凯不生长 快速尿素试验强阳性（+） 送CDC，不做药敏，菌株高 压灭菌。
柯氏染色步骤（柯兹洛夫斯基染色法）
用途 常用于实验室鉴别布鲁菌的染色 方法。 染色步骤
借我一双慧眼
—常见标本细菌涂片
陕西省宝鸡市人民医院检验科 微生物 白雅红
目
录
血培养 脑脊液 尿液 痰液 生殖道分泌物 伤口分泌物及脓液
一、血培养
血液中很难看到细菌，所以一般送来的血培养不建议直 接涂片。
血培养报阳，一定要涂片并报危急值，应明确革兰染色 阴性/阳性、球菌/杆菌、报阳时长、单瓶/双瓶/需氧/ 厌氧等，并且要对方复述，防止误传。
革兰阴性菌 大肠埃希菌 肺炎克雷伯菌 产气肠杆菌 沙门菌属 变形杆菌属 沙雷菌属 铜绿假单胞菌 不动杆菌属 阴道加德纳菌 淋病奈瑟菌
四、痰液、咽拭子
社区获得性肺炎（CAP）:流感嗜血杆菌，卡他布兰 汉菌，肺炎链球菌特殊细菌：白喉棒状杆菌，百日 咳鲍特菌 医院获得性肺炎（HAP）:金黄色葡萄球菌，肠杆菌 科，非发酵菌科，丝状真菌，新型隐球菌，（包括 CAP） 特殊细菌：奴卡菌、结核分枝杆菌(培养较困难， 染色的意义可能大于培养)、军团菌（患者很少有 痰，痰中菌量也很少，目前常用的检测方法有血清 Ab检测，尿Ag检测)。
菌体较大，葡萄串状，感觉不 在同平面，易误认。
需氧瓶： 染料沉渣？
厌氧瓶菌涂片体小，葡萄串状。
厌氧瓶
血培养G+链球菌？
多个视野阅片，特别 是较薄的地方看看。
皓 月 当 空 似 有 佳 人 来
百变美女—马内菲篮状菌
马内菲篮状菌是青霉中惟一的
双相型的致病菌。本病可发生于健 康者（多有竹鼠接触史），但更多 见于免疫缺陷或抑制者，如HIV、肿 瘤患者多见。
来自网络
新型隐球菌优质墨汁法
湿片法：脑脊液与 墨汁比例为约5:1。 许绍强老师推荐 25ul的脑脊液加45ul的墨汁效果最 佳。 干片法：脑脊液离 心后，或者标本直 接涂片，紫外消毒 后干片，用4倍稀释 的墨汁压片。
来自网络
新型隐球菌
这是什么？
脑脊液革兰染色
脑脊液BAP
是淋巴细胞吗？
新型隐球菌与大肠埃希菌混 涂革兰染色荚膜清晰可见
病理科 回报结果
痰液烟曲400倍镜下
痰液头地霉400镜下
库什曼螺旋体是粘液丝在支气管内浓缩后形
成的管型，多见于慢性支气管炎，哮喘等。
鹅口疮黏膜拭子
（三）仔细阅片
1. 吞噬、粘附、伴形
气管切口取痰
痰液吞噬鲍曼和绿脓杆菌
ICU痰鲍曼大量弥散分布
观察吞噬与包裹现象是鉴别定植与感染的有效手段。但 无吞噬现象的可能为定植菌，也可能为感染菌，如感染早 期产生荚膜的细菌具有抗吞噬能力。
新隐革兰染色 六边形排列
痰液六铵银染色“米奇”
痰液新型隐球菌 革兰染色(可用 KOH消化）
“看我七十二变”
再换几个视野 转板生长 纯鲍曼？
脑脊液四瓶血培养 报阳涂片G+杆？
“看我七十二变”
重新再转 厌氧
原始瓶重新涂片 （加质控）染色， 延长脱色时间。
原始区刮涂
“明明白白我的心”
bjyy
三、尿液
（二）染色评估
革兰染色关键步骤就是脱色环节，应根据涂片薄厚灵活掌 握，一般约5秒左右。个别情况可同片带质控。
痰液中黏液型肺克脱色欠 佳，应增加阅片视野。
（三）仔细阅片
1.阅片勿忘低倍扫！
核固缩
痰嗜酸粒细胞
痰涂片革兰染色？
联系临床，不除外肿瘤。标本转送病理科。
痰涂片瑞姬染色
三大: 胞体大， 胞核大， 核仁大。 三千: 形态千姿百态， 胞质千变万化， 胞核千奇百怪。
小小亭楼，尽观苍穹，让我们在微生物浩 瀚的海洋里尽情翱翔。如上内容纯属个人学习 感受，如有问题，敬请指正。
35度酵母相