基因工程制胰岛素(生工版)概述
利用生物工程法制备重组胰岛素
串联BKRA基因的构建
• 为进行，合成了彼此互补的两个片段：
• 然F后7：将CTG磷GA酸G A化AC的TAFC 7TG与T A等AC摩CG尔T C的GC F正8向退链 火，中间 F8：AAT TGC GAC GGT TAC AGT AGT TCT CCA G 反向链
5’ -CTG GAG AAC TAC TGT AAC CGT CGC-
GTC ACA
TGC终A止CC TCC ATC TGC TCC CTT TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGT
人胰岛素原类似物BKRA基因的克隆
• 分别以EcoRⅠ- HindⅢ双酶切pUC18 DNA和上述构
建的BKRA基因片段（182bp），将载体DNA与BKRA 片段（171bp）连接，获得重组质粒pUCⅠ。分别经 EcoRⅠ-HindⅢ双酶切和PvuⅡ不完全酶切鉴定，均产 生了与 其大小的DNA片段。
GGC TTC
小C肽
GAG CAT CTT CGA GAC ATG GAC CAA ACG CCA CTT GCA
CCG AAG
Lys Arg
PvuII F7F8接头
TTT TAC ACT CCG AAA ACT AAG CGC GGT ATC GTT GAA
CAG TGT
AAA ATG TGA GE*GC TTT TGA TTC GCG CCA TAG CAA CTT
串联BKRA基因的构建
• 为了正确连接两个BKRA基因，在此设计了一个
连接头接在前一个BKRA基因的末端，并构建了 一个能与下一个BKRA基因5’端EcoRI粘端互补 的序列。
• 然而由于接头是在PvuII平末端与前一个BKRA
基因连接的，因此会切掉部分胰岛素A链基因， 所以接头要补上相应的部分。
胰岛素制备
生物技术制药参考资料基因工程制备胰岛素一、胰岛素的定义胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。
二、目前临床使用的胰岛素来源1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。
2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。
3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。
三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nant human insulin，rhI)的方法1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。
这一方法缺点较多，目前已较少使用；2、用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成hI。
E．coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi；3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。
酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。
因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。
另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。
通过基因工程体外制备胰岛素的关键步骤
通过基因工程体外制备胰岛素的关键步骤基因工程体外制备胰岛素的神奇之旅亲爱的朋友们，今天咱们要聊一聊那个让糖尿病人头疼不已的话题——如何通过基因工程体外制备胰岛素。
这可是个大工程啊，但别担心，跟着我的脚步，咱们一起轻松探索这个神奇的世界！咱们得知道，胰岛素可是个大宝贝，它就像是人体的小管家，帮我们调节血糖，保持健康。
但是呢，对于糖尿病患者来说，这个“小管家”可不好请，因为体内胰岛素分泌不足或者细胞对胰岛素不敏感，导致血糖控制不住。
所以啊，科学家们就动起了脑筋，想了个办法——通过基因工程体外制备胰岛素。
那么，这个神奇的过程到底是怎么一回事儿呢？咱们来慢慢道来。
1. 第一步，咱们得从人体中提取出一些特殊的细胞。
这些细胞可是大有用处的，它们可以像工厂里的工人一样，不停地生产胰岛素。
这些细胞就像是胰岛素的“生产车间”，而咱们就是它们的“老板”。
2. 第二步，咱们得给这些细胞装上一个“大脑”——胰岛素受体。
有了这个“大脑”，这些细胞就能更好地理解和执行咱们的命令了。
3. 第三步，咱们还得给这些细胞装上一种特殊的“武器”——胰岛素合成酶。
有了这个“武器”，这些细胞就能自己动手制造胰岛素了。
4. 最后一步，把这些细胞放回人体，它们就会像真正的胰岛素一样工作，帮助咱们控制血糖，保持健康。
听起来是不是挺神奇的？不过呢，这个过程可不是那么简单的。
科学家们可是费尽心思，才让这些细胞能够成功地生产出胰岛素。
而且啊，这个过程还需要在严格的实验室条件下进行，不能有半点马虎。
好了，说到这里，你是不是已经迫不及待想要尝试一下这个神奇的过程了呢？别急，科学的道路总是充满了未知和惊喜。
咱们还是先好好享受生活吧，毕竟，生活才是最重要的！好啦，今天的分享就到这里啦。
希望我的介绍能让你对基因工程体外制备胰岛素有个大概的了解。
如果你对这个话题还有更多的好奇和疑问，记得来找我哦，咱们一起探讨、一起学习！。
基因工程生产人胰岛素的技术路线
基因工程生产人胰岛素的技术路线人胰岛素是一种重要的药物，用于治疗糖尿病等疾病。
传统的人胰岛素生产方法是从猪胰腺中提取，但存在感染风险和胰岛素结构与人体有差异等问题。
为了解决这些问题，科学家们利用基因工程将人胰岛素基因克隆到大肠杆菌等微生物中，通过基因表达、突变、筛选、纯化等步骤，生产出高质量的人胰岛素。
技术路线如下：1. 克隆人胰岛素基因：从人胰岛细胞中分离出mRNA，利用反转录酶将其转录成cDNA。
通过PCR扩增，将人胰岛素A、B链合成成一个完整的人胰岛素基因。
在该过程中，要注意选择合适的启动子、终止子、信使RNA起始和终止密码子等。
将该基因插入到载体中，如大肠杆菌质粒pBR322中的限制性内切酶位点，使其能够在大肠杆菌中表达。
2. 基因表达：将含有人胰岛素基因的重组质粒经过转化技术，导入到大肠杆菌中，利用细胞自身的代谢活性，让其经过转录、翻译等步骤，表达出人胰岛素前体蛋白(Proinsulin)。
Proinsulin蛋白由A、B两个多肽链组成。
其中A链有21个氨基酸，B链有30个氨基酸。
A链和B链由两个酯键连接在一起，形成Proinsulin。
Proinsulin在细胞内被剪切成人胰岛素A、B链和C肽。
其中C肽并无生理作用，被细胞内酶降解分解。
3. 突变筛选：由于大肠杆菌系统中表达的人胰岛素前体蛋白形成的Proinsulin无法自行成熟转化为人胰岛素，因此必须人为帮助B链成熟多肽链的脱落。
突变技术可以改变Proinsulin分子内酶解的敏感性和特异性，使B链多肽链和C肽之间的酯键能够被限制酶特异性水解，得到纯度较高的人胰岛素。
4. 纯化：通过离心、层析、过滤等技术，将发酵液中的人胰岛素纯化提取。
常用的纯化方法包括离心、酸性沉淀、离子交换层析、有机溶剂沉淀、逆流层析、凝胶过滤等。
整个生产过程包括基因克隆、表达、突变、筛选、纯化，一般需要经过6-7天的培养过程。
通过基因工程生产人胰岛素，不仅能够解决传统人胰岛素来源的问题，而且能够生产高质量、高效率的人胰岛素。
胰岛素制备工艺
胰岛素制备工艺胰岛素是一种重要的药物，用于治疗糖尿病。
胰岛素制备工艺是指将胰岛素从动物源或基因工程菌株中提取或合成的过程。
本文将介绍胰岛素制备的工艺流程和关键步骤。
胰岛素的制备工艺可以分为两种：动物源胰岛素和基因工程胰岛素。
动物源胰岛素是从动物胰腺中提取的，而基因工程胰岛素是通过基因工程技术合成的。
这两种制备工艺在核心步骤上有所不同，但整体流程相似。
动物源胰岛素的制备工艺需要从猪、牛等动物的胰腺中提取。
提取胰岛素的方法通常是将动物胰腺切碎，用酸性溶液进行浸泡，使胰岛素从胰腺组织中释放出来。
然后，使用过滤和离心等方法将胰岛素分离出来。
而基因工程胰岛素的制备工艺则需要先选择合适的表达宿主菌株，如大肠杆菌。
将人类胰岛素基因导入到宿主菌株中，使其表达出胰岛素蛋白。
随后，通过培养和发酵等步骤，大量生产胰岛素蛋白。
最后，通过纯化和结晶等工艺步骤，得到纯度较高的基因工程胰岛素。
无论是动物源胰岛素还是基因工程胰岛素，制备工艺中的纯化步骤都非常重要。
纯化的目的是去除杂质，提高胰岛素的纯度。
纯化方法包括离心、层析、电泳等。
通过这些方法，可以将胰岛素从其他蛋白质和杂质中分离出来，得到纯净的胰岛素。
除了纯化步骤，胰岛素制备工艺中的结晶步骤也十分关键。
结晶是将溶液中的胰岛素分离出来，得到固体结晶体的过程。
结晶的方法有多种，如悬浮结晶、溶剂结晶等。
通过合适的结晶条件，可以得到高纯度的胰岛素晶体。
胰岛素制备工艺中还有一些辅助步骤，如溶解、过滤、浓缩等。
这些步骤的目的是在制备过程中保证胰岛素的质量和纯度。
总结起来，胰岛素制备工艺包括胰岛素提取、纯化、结晶等关键步骤。
无论是动物源胰岛素还是基因工程胰岛素，都需要经过这些步骤来得到高纯度的胰岛素。
胰岛素的制备工艺是一个复杂而精细的过程，需要严格的操作和控制。
随着科技的发展，胰岛素制备工艺将不断改进和完善，为糖尿病患者提供更好的治疗药物。
基因重组技术生产胰岛素
基因重组技术生产胰岛素介绍胰岛素是一种由胰岛细胞分泌的蛋白质激素，它在调节血糖水平中起着重要的作用。
胰岛素的生产曾经面临着供应不足的挑战，然而通过基因重组技术，科学家们成功地生产了大量的胰岛素，从而满足了临床需求。
本文将介绍基因重组技术生产胰岛素的过程和意义。
胰岛素的生产过程对基因重组技术生产胰岛素的理解首先需要了解传统的生产过程。
传统方法中，胰岛素是从猪和牛的胰腺中提取得到的。
这种方法存在着供应不稳定、产品纯度不高以及与人体胰岛素之间存在差异等问题。
而基因重组技术生产胰岛素则是通过将人类胰岛素基因导入到大肠杆菌等微生物中进行生产。
下面是具体的步骤：1.获得胰岛素基因：从人类胰岛细胞中获得胰岛素基因的DNA序列。
2.构建基因重组载体：将胰岛素基因插入到合适的基因重组载体中，如质粒或病毒。
3.转导宿主细胞：将构建好的基因重组载体导入到宿主细胞中，如大肠杆菌。
4.培养和表达：在适当的培养条件下，促使宿主细胞进行复制和转录，从而表达胰岛素基因并产生胰岛素蛋白质。
5.纯化和提取：通过分离和纯化的步骤，得到纯度较高的胰岛素。
基因重组技术的意义基因重组技术生产胰岛素具有许多优势和意义：1.提供稳定供应：通过基因重组技术生产的胰岛素能够提供更加稳定的供应，解决了传统生产方法中供应不足的问题。
2.提高纯度：基因重组技术可以实现胰岛素的高纯度生产，减少了杂质的存在，从而提高了产品质量。
3.与人体胰岛素相似：基因重组技术生产的胰岛素与人体胰岛素在结构和功能上更为接近，减少了在使用过程中出现的副作用和风险。
4.降低成本：基因重组技术可以实现胰岛素的大规模生产，从而降低了生产成本和售价，使胰岛素更加可负担。
应用领域和前景基因重组技术生产的胰岛素在医药领域有着广泛的应用。
主要包括：1.糖尿病治疗：胰岛素是糖尿病治疗中必不可少的药物，通过基因重组技术生产的胰岛素可以满足糖尿病患者的需求。
2.研究工具：基因重组技术生产的胰岛素可以作为研究工具，用于研究胰岛素的生物学功能以及与糖尿病等疾病的关系。
胰岛素制备
生物技术制药参考资料基因工程制备胰岛素一、胰岛素的定义胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。
二、目前临床使用的胰岛素来源1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。
2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。
3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。
三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nant human insulin，rhI)的方法1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。
这一方法缺点较多，目前已较少使用；2、用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成hI。
E．coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi；3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。
酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。
因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。
另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。
基因工程--胰岛素
胰岛素能降低人体血糖的含量。
糖尿病患者是由于胰腺的β细胞不能分泌胰岛素，使患者血糖过高，继而带来吃得多、喝得多、尿得多、体重减少(即三多一少)的一系列临床症状。
糖尿病的死亡率仅次于心脏病和癌症。
19世纪以前，糖尿病像妖魔一样肆意夺走人们的生命，那时糖尿病患者的平均生存时间仅4．9年，面对这旷日持久的大浩劫，人类一筹莫展。
1921年，加拿大医生班廷(Banding)取两条狗的胰脏，将之搅碎过滤，并收集少量液体注射到一只已经出现糖尿病昏迷的小狗身上，奇迹发生了，昏迷的小狗血糖开始下降，当液体注射完毕，世界上第一只从糖尿病昏迷状态下苏醒过来的小狗就站起来跑开了。
从狗胰脏收集的“神奇”液体，就是我们现在使用的胰岛素。
1922年1月班廷第一次使用从牛胰脏中提取的胰岛素，对一个患糖尿病2年，已被医生放弃的男孩进行治疗，结果“药到病除”。
全世界为这个划时代的医学成果而欢呼!班廷也由此荣获1923年诺贝尔生理学和医学奖。
胰岛素治疗糖尿病至今仍然是临床上最有效的方法。
过去，胰岛素主要靠从猪等大家畜胰腺中提取。
从一头猪的胰腺中只能提取出300单位胰岛素，而一个病人每天就需要40单位胰岛素，因此远远不能满足需要。
图7-1 胰岛素生成图大肠杆菌说：给我一个基因，我将源源不断给你药物”基因工程技术一问世，科学家就想到利用该技术来解决胰岛素药源不足的问题。
他们首先要找到胰岛素基因，在人的胰岛细胞里有一段特定结构的DNA分子指挥着胰岛素的合成，然后又找到在人的大肠里存在对人体无害的大肠杆菌。
把人的胰岛素基因转入到大肠杆菌的细胞中，随着大肠杆菌的繁殖，胰岛素基因也一代代的遗传下去。
大肠杆菌繁殖速度相当快，大约20分钟就能繁殖一代，把它放到大型的发酵罐里进行人工培养，就可以大量繁殖，并且生产出大量人的胰岛素(图7．1)。
实际上这种大肠杆菌是经过改造已经带上新的遗传性状的细菌，称为基因工程菌。
1978年美国的吉尔伯特研究组用此方法成功地生产了鼠胰岛素，随后依塔库拉研究组用相同方法生产出了人的胰岛素。
胰岛素 转基因-概述说明以及解释
胰岛素转基因-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述：胰岛素是一种重要的激素，在调节血糖水平方面发挥着关键作用。
胰岛素转基因技术是利用基因工程技术将胰岛素基因导入其他生物体中，以便在更大规模上生产胰岛素。
这一技术的应用不仅提高了胰岛素的生产效率，也为糖尿病患者提供了更好的治疗选择。
本文将探讨胰岛素的作用、转基因技术与胰岛素生产的关系，以及胰岛素转基因产品的应用，旨在全面了解胰岛素转基因技术的意义和影响。
1.2 文章结构文章的结构分为引言、正文和结论三部分。
在引言部分，我们将会介绍胰岛素和转基因技术的基本概念，以及本文的目的和意义。
在正文部分，我们将会探讨胰岛素的作用及其在人体内的功能，以及转基因技术如何被应用于胰岛素的生产过程中。
我们还将探讨胰岛素转基因产品的应用，以及与传统胰岛素相比的优势和局限性。
在结论部分，我们将总结胰岛素转基因的影响，探讨未来发展的展望以及对这一技术的评价和展望。
通过全面的讨论和分析，希望能够对胰岛素转基因技术有一个更深入的了解。
1.3 目的本文的目的主要在于探讨胰岛素转基因技术在生产和应用中的重要性和影响。
首先，我们将介绍胰岛素的作用以及为什么胰岛素对人类健康至关重要。
其次，我们将深入探讨转基因技术如何在胰岛素的生产过程中发挥作用，以及转基因胰岛素产品的优势。
最后，我们将讨论胰岛素转基因对医疗领域和人类健康的影响，展望未来胰岛素转基因技术的发展方向。
通过本文的阐述，希望读者能够更全面地了解胰岛素转基因技术的重要性和潜力，从而推动相关领域的发展和进步。
2.正文2.1 胰岛素的作用胰岛素是一种由胰腺分泌的激素，非常重要的作用是调控血糖水平。
当我们进食时，食物中的碳水化合物被消化吸收后，血糖水平会上升。
胰岛素的主要作用是促使体内细胞摄取血液中的葡萄糖，转化为能量供给身体各个器官和组织使用，从而使血糖水平维持在恰当的范围内。
此外，胰岛素还能促进体内脂肪和蛋白质的合成，并抑制葡萄糖的产生。
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素[宝典]
![基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素[宝典]](https://img.taocdn.com/s3/m/90a698430242a8956aece443.png)
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素[宝典] 基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的工艺一，背景知识1，基因工程科技名词定义中文名称:基因工程英文名称:genetic engineering;gene engineering其他名称:重组脱氧核糖核酸技术(recombinant DNA technique) 定义1:狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因;广义的基因工程则指按人们意愿设计，通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。
如用重组DNA技术，将外源基因转入大肠杆菌中表达，使大肠杆菌能够生产人所需要的产品;将外源基因转入动物，构建具有新遗传特性的转基因动物;用基因敲除手段，获得有遗传缺陷的动物等。
定义2:将在体外进行修饰、改造的脱氧核糖核酸分子导入受体细胞中进行复制和表达的技术。
扩充:基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组DNA技术);而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有:(1)外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。
这一部分的工作是整个基因工程的基础，因此又称为基因工程的上游部分;(2)适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组;(3)外源基因的导入;(4)外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选;(5)外源基因表达产物的生理功能的核实;(6)转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析;(7)生态与进化安全保障机制的建立;(8)消费安全评价。
基本操作步骤(上游技术)提取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步。
如植物的抗病(抗病毒抗细菌)基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。
要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。
胰岛素的制备
结
果
2．l 重组质粒的构建 利用5´端起始密码子ATG和胰岛素B1 TTT之间 加入Lys密码子AAG的突变引物相3´端通用引物，以 含双C肽胰岛素原基因的质粒pJG111作模板，进行 PCR扩增，获得约380bp的产物，由于胰岛素原基因 的5´端和3´端分别引入了EcoR I和BamH I酶切位点， 因此PCR产物和载体质粒pJGl03(含B—C—A人胰岛 素原基因)可分别用这两种酶酶切后产生粘性末端，经 回收的PCR产物酶切小片段与载体大片段连接，转化 E．coliDH5α后获得重组质粒pJG112，采用3种方法 进行筛选和鉴定。
1．2．3 Met—Lys—双C肽人胰岛素原基因的摇瓶表 达 挑取单菌落于3 ml LB Amp+培养液中，37℃培养 12 h，扩大100倍30℃培养过夜，次日上午以1：10稀 释，30℃培养4 h，42℃诱导6 h，6000r／min离心收 获菌体．
1．2．4 Met—Lys—双C肽人胰岛素原的分离纯化 20g湿菌体经超声破碎细胞，裂解包含体，还原， 重组，超滤浓缩至6～7 ml的重组液．经 SephadexG—75(1．7cm×l00cm)层析分离，收集目 的蛋白．取少量进行“％SDS—PAGE分析，其余的 调pH2．5～3．0，加入NaCl使终浓度达12％(W／V)， 离心，收集沉淀，冰冻保存．
用E.coli做表达系统 及A链、B链分别表达的问题
E.coli是原核生物没有真核生物翻译后加工、 修饰。 E.coli中表达的小分子外源蛋白不稳定。 E.coli与人的种属差异较大，有密码子的偏好 性。 A链、B链间二硫键正确连接和其空间构象正 确形成较难。
一些解决办法
胰岛素制备
胰岛素制备 Prepared on 22 November 2020生物技术制药参考资料基因工程制备胰岛素一、胰岛素的定义胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。
二、目前临床使用的胰岛素来源1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。
2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。
3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。
三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nant human insulin，rhI)的方法1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。
这一方法缺点较多，目前已较少使用；2、用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成hI。
E．coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi；3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。
酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。
因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。
人胰岛素的工业制备
人胰岛素的工业制备
人类胰岛素是一种由蛋白质构成的药物，可用于控制血糖水平。
它由 51 个氨基酸残基组成，这些氨基酸残基以特定的顺序排列在链上，形成了一条螺旋式结构。
人类胰岛素的制备主要涉及以下步骤：
1. DNA 重组技术生产基因
制备人类胰岛素的第一步是利用 DNA 重组技术生成表达人类胰岛素的基因。
这种基因可以使用人类组织中自然存在的胰岛素基因作为模板，并对其进行修改，使得其在细胞中产生大量的胰岛素。
2. 重组表达
重组表达是将人类胰岛素基因插入到合适的宿主细胞中，并使其在宿主细胞中大量表达胰岛素的技术。
这个过程需要在生物发酵釜中进行，一般采用大肠杆菌作为宿主细胞。
3. 提纯和分离人胰岛素
当大量的细胞表达人类胰岛素后，需要分离和提纯胰岛素，以获得高纯度的药物。
这个过程通常包括柱层析、钠离子置换、逆流层析和超过滤等步骤。
使用这些技术，可以将胰岛素从其它蛋白质和杂质中去除。
4. 人胰岛素的晶体化
在提纯的最后阶段，人胰岛素的晶体化是非常必要的。
人类胰岛素是一种结构较为稳定的蛋白质，其结晶过程可使其更为纯净和稳定。
晶体化通常使用静态或动态技术，如批量结晶或连续结晶等方法。
总的来说，制备人类胰岛素需要经过一系列的制备和纯化过程，并需使用复杂的技术手段。
尽管人类胰岛素的制备过程复杂，但其应用广泛，已经成为治疗糖尿病的重要药物。
基因工程制胰岛素生工版
2．提取RNA，分离RNA
2．1 总RNA的提取
2．2 mRNA的纯化
2．3 mRNA的保存
2021/6/4
11
一、获取外源目的基因片段
2．1 总RNA的提取
总RNA的抽提方法有多种，TRIzol试剂是使用组广 泛的RNA抽提试剂，主要由苯酚和异硫氰酸胍组成， 可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的 RNA释放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离。苯 酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活 性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、 β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。 TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂， 在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。 提 取 RNA 时 ， 首 先 用 液 氮 研 磨 材 料 ， 匀 浆 ， 加 入 TRIzol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分。然后加 入氯仿抽提，离心，分离水相和有机相，收集含有 RNA 的 水 相 ， 通 过 异 丙 醇 沉 淀 ， 可 获 得 比 较 纯 的 总 RNA，用于下一步mRNA的纯化。
配对率提高，折叠率高。工艺路线依然繁琐。
方法三： 需体外折叠。
2021/6/4
7
基因工程获取胰岛素的步骤
一、获取外源目的基因片段 二、选择与获取表达载体 三、重组目的DNA片段与表达载体 四、选择与获取表达细胞 五、重组体导入表达细胞 六、对重组体细胞进行筛选纯化鉴定 七、工程菌产物鉴定和保存 八、发酵培养
③ 十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动， 若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
④ 寡聚（dT）纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依 次用NaOH、灭菌ddH2O、上样缓冲液洗柱。
基因工程制备胰岛素2
2、用基因工程 E．coli 发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成 hI。
E． coli 系统表达量高，但缺点是不利于表达 hI 这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白 形式将 hPI 连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活 性的 hi； 3 、通过基因工程酵母菌发酵生产 hPI ，经后加工形成 hI 。酵母系统下游后加工比细菌表 达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少 (1 ～ 50 mg ／ L) ，产量低。 因此，虽然 rhI 投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的 表达策略 I2 J ，尤其是对
中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基 因从原 DNA 中分离。主要有如下 4 种方法： （ 1 ）鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。 至于如何筛选，用 DNA 分子杂交，即 DNA 探针 （ 2 ）人工合成法：根据转录蛋白或者 mRNA 推导出基因序列，然后人（ 4 ） PCR 扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作 …… 2 、提取质粒：使用细胞工程 , 培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒为 环状。主要有如下 2 种方法： （ 1 ）碱裂解法：此方法适用于小量质粒 DNA 的提取，提取的质粒 DNA 可直接用于 酶切、
E ． CO 一尻表达系统的研究更是越来越深入，用 E ． coli 系统表达 hPI 的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂 的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。 本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量， 简化 下游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过优化的高效完整的基因工程 E ． coli 发酵表 达 (His)6 一 Arg — Arg 一人胰岛素原 [(His)6 一 Arg — Arg — human proinsulin ， PPh — PI] ，后加工 成 hI 的制备工艺。 四、基因工程制备胰岛素 1 、提取目的基因：既从人的 DNA
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第四组
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胰岛素是由胰岛B细胞受内源性或外源性 物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、 胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白 质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖 的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质 合成。外源性胰岛素主要用来糖尿病治 疗。胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因 子具有高度生物活性，分子量很大，立 体结构异常复杂，体外难以人工合成。 所以过去糖尿病患者只能服用从牛、猪 体中提取的胰岛素来治疗；但牛、猪胰 岛素结构上与人胰岛素有差别，如与猪 胰岛素B链第30个氨基酸残基不同，长期 服用会引起肾和眼的疾病，故必需要用 基因工程方法获得重组人胰岛素进行治 疗。
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基因工程获取胰岛素的步骤
一、获取外源目的基因片段 二、选择与获取表达载体 三、重组目的DNA片段与表达载体 四、选择与获取表达细胞 五、重组体导入表达细胞 六、对重组体细胞进行筛选纯化鉴定 七、工程菌产物鉴定和保存 八、发酵培养
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一、获取外源目的基因片段
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一、获取外源目的基因片段
2．2．1 寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA （1）试剂准备： ① 3M醋酸钠（pH5.2）； ② 0.1M NaOH； ③ 上样缓冲液：20mM Tris-HCl（pH7.6）,0.5M NaCl,1M EDTA (pH8.0),0.1%SLS(十二烷基氨酸钠)。配制时可先配制 Tris-HCl（pH7.6）、NaCl、EDTA（pH8.0）的母液，经高压 消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至 65℃，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%； ④ 洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl（pH7.6），1mM EDTA （pH8.0），0.05%SDS； ⑤ 无水乙醇、70%乙醇； ⑥ DEPC（0.1%焦炭酸二乙酯）
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基因工程制胰岛素三种方法
一、A链和B链分别表达法
化学合成 A链和B链 的编码序 列
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基因工程制胰岛素三种方法
一、A链和B链分别表达法
表达产
物的后 期处理 路线：
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基因工程制胰岛素三种方法
二、人胰岛素原表达法
基因工程菌的构建战略：
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基因工程制胰岛素三种方法
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一、获取外源目的基因片段
2．1．1 TRIzol法提取流程图
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一、获取外源目的基因片段
2．2 mRNA的纯化
该方法利用mRNA 3＇端含有PolyA（多聚腺苷 酸）的特点，当RNA流经寡聚dT纤维素柱时， 在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性的结 合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。 经过两次寡聚纤维柱后可得到较高纯度的 mRNA。
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一、获取外源目的基因片段
2．提取RNA，分离RNA 2．1 总RNA的提取 2．2 mRNA的纯化 2．3 mRNA的保存
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一、获取外源目的基因片段
2．1 总RNA的提取
总RNA的抽提方法有多种，TRIzol试剂是使用组广 泛的RNA抽提试剂，主要由苯酚和异硫氰酸胍组成，可 以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的 RNA释 放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离。苯酚虽可有 效地变性蛋白质，但不能完全抑制 RNA 酶活性，因此 TRIzol 中还加入了 8 －羟基喹啉、异硫氰酸胍、β- 巯 基乙醇等来抑制内源和外源 RNase （ RNA 酶）。 TRIzol 是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，在样品裂 解或匀浆过程中， TRIzol 能保持 RNA 完整性。提取 RNA 时，首先用液氮研磨材料，匀浆，加入 TRIzol 试剂， 进一步破碎细胞并溶解细胞成分。然后加入氯仿抽提， 离心，分离水相和有机相，收集含有RNA的水相，通过 异丙醇沉淀，可获得比较纯的总RNA，用于下一步mRNA 的纯化。
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一、获取外源目的基因片段
2．1．1 TRIzol法提取流程
（1）样品处理① 培养细胞：收获细胞1-5*10^7，移入 1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol，混匀，室温静置5min。 ② 组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组 织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol充分匀浆，室 温静置5min。 （2）加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。 （3）4℃离心，12000g*15min，取上清液。 （4）加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置 10min。 （5）4℃离心，12000g*10min，弃上清液。 （6）加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g*5min， 弃上清液。 （7）晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。
1．选择实验材料 2．提取RNA，分离RNA 3．逆转录mRNA,得cDNA第一链 4．得双链DNA 5．DNA序列纠错 6. 目的基因通过细胞克隆扩增 7. 目的基因回收及DNA测序，最终目的 基因获取
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一、获取外源目的基因片段
1．选择实验材料 胰岛素是一种蛋白质类激素，体内胰岛 素是胰岛B细胞（即胰岛β细胞）受内 源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核 糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分 泌的。胰岛素基因只有在胰岛B细胞中 才能转录出信使RNA，所以用基因工程 方法生产胰岛素时，选用胰岛B细胞为 获取目的基因的实验材料。
二、人胰岛素原表达法
表达产物的后
期处理路线：
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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基因工程制胰岛素三种方法
三、A链和B链同时表达法
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基因工程制胰岛素三种方法
三种方法比较：
方法一： 由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二 硫键的正确配对率较低，通常只有10% - 20%，因此成 本高。
方法二： 胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正 确配对率提高，折叠率高。工艺路线依然繁琐。 方法三： 需体外折叠。