讲义3：微生物基本操作规范(3)采样和取、制样

三 级 方 案
2.轻度间接指 标菌
例1 n=5 c=3 例4 n=5 c=3
例2 n=5 c=2 例5 n=5 c=2
例3 n=5 c=1 例6 n=5 c=1
3.中度程度局 部传播 二 级 方 案 4.中度程度广 泛传播
例7 n=5 c=2 例10 n=5 c=0
例8 n=5 c=1 例11 n=10 c=0
食品微生物检验
规范操作基础培训
3 采样和取、制样
福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验室
2010.05
主要内容：
§ 1 § 2 清洗、消毒和灭菌操作 培养基的制备
§ 3
§ 4 § 5 § 6
采样和取、制样
接种、分离纯化 制片、染色及显微观察 实验室安全基础知识
§ 3.采样和取、制样
随机采样：在一批产品中，每个样品或 单元都有同样被选择的机会。这种采样 方法被称为随机采样。采样时常需要查 阅随机数字表。 代表性样品：广义上讲是指能够代表一 个批的样品，而不是仅代表其中的一部 分。要获得代表性样品需要以下四个条 件：确定整批产品的采样点；建立能够 代表整个产品特征的采样方法；选择样 品大小；规定采样的频率。
1)采样的术语 批量货物：数量确定的货物，品质必须均匀一致。 抽检货物：从批量货中的一个位置取出的少量货物。 混合货样：条件允许，从某一特定批量采样、混合， 即为混合货样，亦即大样。 样品单位：从监督总体中抽取用于检验的样品中的单 位产品。 样品量：样品中所包含的样品单位数。 合格判定数：在计数采样检查中，对接收批的样品允 许出现的缺陷数或不合格品数的上限 值，合格判定数又称可接受数。 批：一批产品中或特定阶段或时间内代表相同质量样 品的单元数。
（2）各类食品的采样方案
按相应产品标准中的规定执行。
（3）食源性疾病及食品安全事件中食品样品的 采集
由工业化批量生产加工的食品污染导致的食源性疾病 或食品安全事件，食品样品的采集和判定原则按以上 的（1）和（2）执行。同时，确保采集现场剩余食品 样品。 由餐饮单位或家庭烹调加工的食品导致的食源性疾病 或食品安全事件，食品样品的采集按GB14938中卫生 学检验的要求，以满足食源性疾病或食品安全事件病 因判定和病原确证的要求。
3.1 采
样
采样是指在一定质量或数量的产品中， 取一个或多个代表性样品，用于微生物检 验的过程。 样品必须对采样的整个产品或批量具有 代表性。样品的大小应能满足在需要时进 行重复分析的需要。
3.1.1 采样准备工作
1.采样工具 采样工具要达到无菌的要求。对采样工具和一些试剂材 料应提前准备、灭菌。 1）开启容器的工具：剪刀、刀子、开罐器、钳子等。双层纸包 裹灭菌（121 ℃ ，15min），干燥洁净的环境中保存2个月。 2）样品采集工具：灭菌的铲子、勺子、取样器、镊子、锯子、 刀子、剪子、压舌板、木（电）钻、打孔器、金属试管和试 子等。 3）取样容器：灭菌的广口瓶或细口瓶，聚乙烯袋（瓶）、金属 试管或类似的密封金属容器。最好不使用玻璃容器，运输中 易碎。 4）温度计：-20 ℃ ~100 ℃ ，温度间隔1 ℃。最好使用金属或 电子温度计。使用前在70%~75%乙醇溶液或次氯酸钠（浓度 不小于100mg/L）中浸泡消毒（不小于30s）。
4）ICMSF采样方案简介 国际食品微生物标准委员会（ICMSF） 所建议的采样计划是目前世界各国在食品微 生物工作中常用的采样方案。 ICMSF提出的采样基本原则根据： a)各种微生物本身对人的危害程度各有不 同。 b）食品经不同条件处理后，其危害度变 化情况：①降低危害度；②危害度未变；③ 增加危害度，来设定采样方案并规定其不同 采样数。
例9 n=10 c=1 例12 n=20 c=0
5.严重程度
例13 n=15 c=0
例14 n=30 c=0
例15 n=60 c=0
注：1.表中“减少”系指食品经加热杀死污染的细菌。 2.“无变化”系指微生物数不增减例如冷冻食品或干燥食品。 3.“增加”系指将食品保存在不良环境中使微生物易于繁殖和产毒。 4.n：一批产品采样个数。c：该批产品的样品菌落数中，超过限量的 检样数。
2）采样原则 (1)根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、 微生物的危害程度等确定采样方案; (2)应采用随机原则进行采样，确保所采集的样 品具有代表性; (3)采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能 的外来污染； (4)样品在保存和运输的过程中，应采取必要的 措施防止样品中原有微生物的数量变化，保 持样品的原有状态。
根据表1中15种情况的举例，1-3可用三级法，45可用二级法来判定是否合格。 考虑到以上15种情况，分别设定不同的取样数 及检样污染数，在1-9例中检样需采5个（n=5），而 污染检样数设定为c=3，2，1。在10-15例用二级法 则不得检出该致病菌c=0。例如冷冻食品，细菌数按 例2，大肠菌按例5，金黄色葡萄球菌按例8，沙门氏 菌按例11的二级法判定。 对食品处理应酌情考虑，例如生肉火腿中的金 黄色葡萄球菌，被腐败菌所抑制，不易发生食物中 毒，适用例7和例8。烹调加工后的熟肉，对腐败菌 没有抵抗力，则易发生食物中毒，适用例9。加热盐 腌的火腿，水分活性为0.86以下，金黄色葡萄球菌 有增殖的可能性，因此适用例9。沙门氏菌水活性在 0、94以下不能繁殖，适用例11，如上所述，应根据 各种食品的危害度进行设定。
• 样品的采样和取、制样是食品微生物检验的重要组成 部分。 • 要得到准确的检测结果，必需正确掌握采样技术、样 品传递、样品保存方法和样品的制备技术，保证样品 在从采样到制样整个过程中的一致性。如果样品的采 取、运送、保存或制备过程中操作不当，或者样品不 具有代表性，就会使实验室的微生物检验结果毫无意 义。 • 对采样人员和制样人员提出了很高的专业要求，既要 保证样品的代表性和一致性，又要保证整个微生物检 验过程在无菌操作的条件下完成。
应根据不同的样品特征和采样环境，对采样 物品和试剂进行事先准备和灭菌等工作。 实验室的工作人员进入车间采样时，必须更 换工作服，避免将实验室的菌体带入加工环 境，造成加工过程的污染。
2.采样方案 微生物检验的特点是一个以小份样品的检测结果
来说明一大批食品卫生质量，因此，用于分析的样品 的代表性至关重要，也即样品的数量、大小和性质对 结果判定产生重大影响。要保证样品的代表性首先要 有一套科学的采样方案，其次使用正确的采样技术， 并在样品的保存和运输过程中保持样品的原有状态。 一般说来，进出口贸易合同对食品采样量有明确 规定的，按合同规定采样；进出口贸易合同没有具体 采样规定的，可根据检验的目的，产品及被抽样品批 的性质和分析方法的性质确定采样方案。 目前的采样方案多为ICMSF推荐的采样方案和随 机采样方案。无论采取何种方法采样，每批货物的采 样数量不得少于5件。对于需要检验沙门氏菌的食品， 采样数量应适当增加，最低不少于8件。
ICMSF方法是以二级法、三级法和抽 样的概念为基础，再将微生物的知识加进 来，则可以提出各种食品的微生物标准。 如表2。 为了安全，冷冻生虾加热吃，减少危 害度适用例1、4、10。冷冻加工虾，为了 不加热就食，在解冻中有增强危害度的可 能性，适用例3、6、9、12，对象微生物特 别指定金黄色葡萄球菌肠毒素，两者虽菌 数限量是相同的，但情况有所不同，分别 适用c=3，c=1，因此不依靠菌数限量，而 用合格率来控制。
（3）ICMSF对食品中微生物的危害度分类与采样 方案说明 为了强调采样与检样之间的关系，ICMSF已 经阐述了把严格的采样方案与食品危害程度相联 系的概念（ICMSF，1986）。在中等或严重危害 的情况下使用二级采样方案，对健康危害低的则 建议使用三级采样方案。 ICMSF是将微生物的危害度、食品的特性及 处理条件三者综合在一起进行食品中微生物危害 度分类的。这个设想是很科学的，符合实际情况 的，对生产厂及消费者来说都是比较合理的。下 面结合表1加以说明。
ICMSF的采样方法
有些实验室在每批产品中，仅采一个检样进 行检验，该批产品是否合格，全凭这个检样来决 定。ICMSF方法与此不同，它是从统计学原理来 考虑，对一批产品，检查多少检样，才能够有代 表性，才能客观地反映出该产品的质量而设定的。 ICMSF方法中包括二级法及三级法两种。二 级法只设有n、с及m值，三级法则有n、c、m及M 值。M即附加条件后判定合格的菌数限量。
3）采样方案的类型 依据GB 4789.1-2010《食品安全国家标 准 食品微生物学检验 总则》 (1)类型 采样方案分为二级和三级采样方案。二 级采样方案设有n、c和m值，三级采样方案 设有n、c、m和M值。
n：同一批次产品应采集的样品件数； c：最大可允许超出m值的样品数； m：微生物指标可接受水平的限量值； M： 微生物指标的最高安全限量值。 注1： 按照二级采样方案设定的指标，在n个样品 中，允许有≤c个样品其相应微生物指标检验值大 于m值。 注2： 按照三级采样方案设定的指标，在n个样品 中，允许全部样品中相应微生物指标检验值小于 或等于m值；允许有≤c个样品其相应微生物指标 检验值在m值和M值之间；不允许有样品相应微 生物指标检验值大于M值。
5)消毒剂： 70%~75%乙醇溶液、中等浓度（100mg/L） 次氯酸钠溶液等。 6）标记工具：标签纸（不干胶标签纸）、油性或不可 擦拭记号笔。 7）样品运输工具：便携式冰箱或保温箱。 8）天平：最大量程为2000g，感量为0.1g。 9）搅拌器和混合器：必要时配备带有灭菌灌的搅拌器 或混合器。 10）稀释液：灭菌的磷酸盐缓冲液、0.1%蛋白胨水、 生理盐水以及其他稀释液如脑心浸液肉汤、M肉汤、 LB肉汤等。 11）防护用品：对样品的防护。即保护生产环境、原 料和成品等不会在取样过程中被污染，同样也保护 样品不被污染。工作服、工作帽、口罩、雨鞋、手 套等。事先消毒灭菌（或使用一次性无菌物品)。
例如：n=5，c=2，m=100 CFU/g，M=1 000 CFU/g。 含义是从一批产品中采集5个样品，若5 个样品的检验结果均小于或等于m值（≤100 CFU/g），则这种情况是允许的； 若≤2个样品的结果（X ）位于m值和M值 之间（100 CFU/g <X≤1 000 CFU/g），则 这种情况也是允许的； 若有3个及以上样品的检验结果位于m值 和M值之间，则这种情况是不允许的； 若有任一样品的检验结果大于M值（>1 000 CFU/g），则这种情况也是不允许的。
（2）三级采样方案 设有微生物标准m及M值两个限量如同二级法， 超过m值的检样，即算为不合格品。其中以m值 到M值的范围内的检样数，作为c值，如果在此范 围内，即为附加条件合格，超过M值者，则为不 合格。 例如：冷冻生虾的细菌总数标准n=5，c=3， m=101，M=102，其意义是从一批产品中，取5个 检样，经检样结果允许≤3个检样的菌落数是在m 和M值之间。如果有3个以上检样的菌落数是在m 和M值之间或一个检样菌落数超过M值者，则判 定该批产品为不合格品。
表1、ICMSF按微生物的危害度及食品处理进行情况分类
级 别 危害程度 对象微生物
减少 （加热）
食品经不同处理后的危害度
无变化（冷冻 品立刻进食） 增加危害度（未加热吃 到吃前还有一段时间）
1பைடு நூலகம்食品的保藏
菌落总数 大肠菌群、大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 （指标菌） 金黄色葡萄球菌 蜡样芽孢杆菌 产气荚膜梭菌 沙门氏菌 副溶血性弧菌 致病性大肠杆菌 肉毒梭菌、霍乱弧菌 伤寒沙门氏菌 副伤寒沙门氏菌
（1）二级采样方案 自然界中材料的分布曲线一般是正态 分布，以其一点作为食品微生物的限量值， 只设合格判定标准m值，超过m值的，则 为不合格品。检查在检样是否有超过m值 的，来判定该批是否合格。 例如生食海产品鱼的副溶血性弧菌标 准为n=5，c=0，m=102，n=5即采样5个， c=0即意味着在该批检样中，未见到有菌 落数超过m值的检样，此批货物为合格品。