蛋白质的四级结构

MSH 促黑激素
HbS与HbA的区别
Β-亚基第6位氨基酸
正常人：Glu
患者：Val
血红蛋白 由4个亚基组成
功能:运输O2
二、蛋白质空间结构与功能的关系
（一）肌红蛋白Mb与血红蛋白Hb 蛋白质的空间结构决定生物学功能
肌红蛋白（1个亚基）与血红蛋白（4个亚基） 且一级结构有较大差异，但均具有与氧可逆地 结合的能力 其结构特点是，都与血红素（辅基）共价结合
O2
（二）血红蛋白构象变化与结合氧的能力
O2
变构效应
蛋白质分子与它的配体结合后构象发生变化, 其功能也随之变化的现象,称为变构效应
协同效应
蛋白质分子中的1个亚基与其的配体结合后,
能影响其它亚基与配体的结合,称为协同效应
促进
正协同效应
抑制
负协同效应
血红蛋白与氧结合的正协同效应
100% -
氧 饱 和 度
Part 1 练习
1. 组成蛋白质的基本单位是什么？
2. 什么是等电点？
(2)解毒 (3)临床检验
使蛋白质沉淀的方法
(1) 盐析法( salting out)
•概念： 向蛋白质溶液中加入大量中性盐使 蛋白质沉淀称为盐析
•常用的中性盐： 硫酸铵、 硫酸钠、 氯化钠等 •作用原理: 盐离子与水亲和力极强， 夺去蛋白质的水化层，减少分子间静电斥力 •特点： 不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生 变性
在某些理化因素作用下.蛋白质的构象被破坏，失
去其原有的性质和生物活性，称为蛋白质的变性作
用(denaturation)
变性后的蛋白称为变性蛋白质
常见的变性因素： •化学因素
强酸、
生物碱、
强碱、 尿素、
有机溶剂、
胍、 重金属
•物理因素
热、 紫外线、 超声波、 剧烈振荡
变性蛋白质的主要特征:
（1）蛋白质分子中的次级键断裂,构象破坏，但不 涉及共价键的破坏,一级结构不变 （2） 生物活性丧失 （3） 变性蛋白质的溶解度常降低、粘度增加、 扩散系数减小 （4） 变性蛋白质容易消化
蛋白质分子所带正负电荷相等，净电荷为零
此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点(pI)
（二）蛋白质的胶体性质
蛋白质分子颗粒大小1-100nm之间,属胶体颗粒范 围，在溶液中能形成稳定的胶体
蛋白质的胶体原因： •表面形成水化层 •表面同种电荷的斥力
wenku.baidu.com白质的聚沉
（三）蛋白质的变性、沉淀与凝固
1. 蛋白质的变性作用 概念:
蛋白质的复性(renaturation)
除去变性因素后，有的变性蛋白质又可 恢复其天然构象和生物活性，这一现象 称为蛋白质的复性
蛋白质的沉淀(pre-cipitation)
概念:
当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至 蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析 出，这种现象称为蛋白质的沉淀。
应用:
(1)蛋白质分离纯化
再将肽链彻底水解，用离子交换层析法将各种 的氨基酸分离
第二步 测定肽链的氨基末端和羧基末端 1.N末端的测定
a.丹磺酰氯法
丹磺酰氯是一种强荧光剂，它能专一 地与链N-端α -氨基反应生成丹磺酰-肽， 后者水解生成的丹磺酰-氨基酸具有很强 的荧光，可直接用电泳法或层析法鉴定 出N-端是何种氨基酸。
b.二硝基苯氟法 ：过时
以124个氨基酸残基组成的牛胰核糖 核酸酶（4对二硫键）为例说明
牛胰核糖核酸酶的变性与复性
尿素或盐酸胍 β -巯基乙醇 透析
有活性
无活性
（二）一级结构与功能的关系 1.一级结构相似的蛋白质功能相似 一级结构不同的蛋白质功能不同
胰岛素的一级结构及种属差异
一级结构不同的蛋白质功能不同
ACTH 促肾上腺素皮质激素
若溶液pH大于蛋白质的pI，沉淀更易发生
•缺点： 此法常使蛋白质变性失活
(4) 生物碱试剂和某些酸类沉淀法
原理: 生物碱试剂 ( 如鞣酸、苦味酸、 钨酸等)，某些酸类(主要是指 三氯醋酸、磺酰水杨酸和硝酸 等)，与带正电的蛋白质 结合 生成不溶性的盐而沉淀
缺点：
常引起蛋白质变性
注意事项: 反应溶液的pH<pI，确保蛋 白质以阳离子形式存在
苯乙内酰硫氨基酸(PTH-aa)
环化
水解
失去原N-端氨基酸的肽
剩下的肽可反复进行上述处理，依次生成各种PTH-aa，
层析鉴定就可N-端开始确定被测肽段的氨基酸排列顺序
Edman降解法的示意图
第五步 肽链一级结构的确定
一般常用多种方法使肽链断裂， 并分析出各肽段中的氨基酸顺序。由
于在不同部位断链，只要找出多套肽
透析工作图
半透膜原理
(四) 层析 • 层析种类： –凝胶过（分子筛） –离子交换层析（阴离子和阳离子）
–亲和层析
阳 离 子 交 换 树 脂 工 作 示 意 图
带正电荷多蛋 白紧密结合
带负电荷多蛋 白流过层析柱
分子筛层析
•载体介质
•蛋白质
亲 和 层 析 工 作 示 意 图
•结合
•配体
•洗脱介质
亚基(subunit)
蛋白质分子由两条或两条以上肽链组 成，每条肽链各自形成了独立的三级 结构，分子中的每一个具有独立三级 结构肽链,称为亚基
2.维持蛋白质四级结构的作用力
次级键
主要是疏水作用
盐键、氢键
第三节 蛋白质结构与功能的关系
一、蛋白质一级结构与功能的关系 （一） 一级结构是空间构象的基础
3. 蛋白质的凝固作用
蛋白质的凝固作用实际上是蛋白质变
性后进一步发展的不可逆结果 如加热可使蛋白质变为不容再溶 解的凝块
二、 蛋白质的分离纯化
(一) 盐析和有机溶剂沉淀 (二) 电泳 (三) 透析和超滤
(四) 层析
(五) 超速离心
（二）电 泳
概念：带电颗粒在电场中向着所带电荷相反 方向移动称为电泳。 原理:不同的蛋白质的因结构、形状和带电 量的不同而有不同的泳动速度，从而 达到分析和分离蛋白质的目的
分类：根据支持物的不同，电泳电泳可分为： 薄膜电泳、凝胶电泳…… 应用：电泳技术是生化常用分析技术之一
（三）透析
将蛋白质溶液放在半透膜的袋内，置于 流动的适当的缓冲液（如纯水）中，小 分子杂质（如硫酸铵、氧化钠等）从袋 中透出，而蛋白质保留于袋中从而将蛋 白质纯化，这种方法称为透析
利用压力或离心力强行使水和小分子杂质 通过超滤膜(一种半透膜)除去，而蛋白质 留在膜上，称为超过滤
(2) 有机溶剂沉淀法
• 原理: 使蛋白质脱去水化层,又能降低溶 液的介电常数使蛋白质表面电荷减 少，导致蛋白质分子聚集而沉淀 •常用有机溶剂: •缺点： •注意事项:
甲醇、乙醇、丙酮
常会使蛋白质变性
必须在低温下操作 尽量缩短处理的时间 及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去
(3) 重金属盐沉淀法
•原理: 重金属离子如Cu2+、Hg2+、Ag2+、 Pb2+等带有正电荷，能与蛋白质分 子中带负电的基团结合，生成不溶 性的重金属蛋白盐而沉淀
•洗脱
(六)超速离心
三、多肽链中氨基酸的顺序分析
一般过程：
第一步： 分离提纯蛋白质 ，测定NH2末端的数 目，确定蛋白质分子是 由几条肽链构成的，并分 离出 每条肽链。测定肽链的分子量,计算组成该 肽链的氨基酸残基数。及每种aa的百分组成。 肽链分子中氨基酸残基数=肽链的分子量÷120 （各种的氨基酸残基的平均分子量为120）
四、蛋白质空间结构的测定
1. X射线晶体衍射法 X-衍射图代表射线穿过（蛋白质）晶体的 一系列平行剖面的各原子的电子密度，然后再 借助计算机绘制出三维的电子密度图 2.二维磁共振技术 3. 蛋白质空间结构的预测 （1）根据分子力学、分子动力学、物理化学 原理，从理论上计算推测蛋白质的空间结构 （2）从已知蛋白空间结构规律，从一级结 构推测空间结构
M b
Hb
静脉血
P50
动脉血 氧分压
第四节 蛋白质的理化性质 一 、蛋白质的理化性质
（一）两性解离和等电点
蛋白质是两性电解质。在溶液中的带电状况 主要取决于溶液的pH值
Pr
COOH +OHNH3+
+H+
Pr
COO-
+OH-
NH3+ +H+
Pr
COONH2
pH<pI
pH=pI
pH>pI
等电点（pI）：在某一pH值溶液中， 蛋白质酸性基团和碱性基团的解离程度相当
2.C末端的测定
常用羧基肽酶法 羧基肽酶专一地将肽链水解成片断， 分别进行顺序分析
第三步 肽链的局部水解
1. 酶解法
胰蛋白酶的作用原理
2.化学法 CNBr与Met反应测定Pr的一级结构
第四步 肽段氨基酸顺序分析 一般采用 Edman降解法
异硫氰酸苯酯
+
弱碱条件
N端α -氨基 酸性条件
苯氨基硫甲酰肽(PTC-肽）
段的重叠部位，然后组合排列对比，
即可推断肽段的排列顺序，从而得出
完整肽链中氨基酸的顺序
如测一个九肽
测得N端氨基酸残基为Thr
又分别测得片段: Ala-Ala-Trp-Gly-Lys Val-Lys-Ala-Ala-Trp Thr-Asn-Val-Lys
则其氨基酸排列顺序为： Thr-Asn-Val-Lys-Ala-Trp-Gly-lys 另外，亦可以通过基因中核苷酸顺序推测蛋白 质的氨基酸顺序