第五章 分子生物学研究方法PPT课件

5. 特点： （1） 扩增产物的长度及位置由引物确定； （2）特异性（取决于引物的特异性） （3.）灵敏性（扩增效率）
理论上: 2n （230=109） 实际 : 106 ~ 107
6. 应用：
（1）PCR产物的克隆；
（2）检测（疾病、突变、育种、法医
鉴定、生物进化、分类等）
（3）多态性分析
7. 常见问题： 污染（试剂、实验室、样品） 酶活性及种类
DNA测序(Sequence)
基本原理: 先进行末端标记，作为长度参考 位置，把核苷酸的序列测定
1.Sanger双脱氧链终止法 （1）发明 （2）原理： （3）注意：样品中加入一定比例的ddNTP。 dNTP / ddNTP = 1：50 或 1：100
2. Maxam-Gilbert化学修饰法 （1）发明 （2）原理： （3）通常用的化学试剂是硫酸二甲酯和肼
2. 主要步骤：
（1）将核酸样品转移到固体支持物滤膜上
（2）将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性 或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。
五. 细菌转化
1. 转化作用 transformation 通过自动获取或人为地供给外源DNA使
细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型 的过程.
六. 核苷酸序列分析
反应管中）将要研究的目的基因或DNA片段 在短时间内扩增上百万倍，称为DNA聚合酶 链式反应（ Polymerase Chain Reaction ， PCR ）
2. 发展简史 3. 基本原理
4. PCR反应所需成分：
（1）DNA模板 （2）引物（前、后）
（3） dNTP（dATP、 dTTP 、dCTP 、dGTP ） （4）反应缓冲液 （5）Mg++ （6）DNA聚合酶
二. 限制性内切Βιβλιοθήκη 图谱（1）限制性内切酶的发现
（2）限制性内切酶的定义：特异性的识别某些 核酸序列，并将双链切断的酶。
（3）DNA物理图谱： 定义:指DNA链的限制性酶切片段的排列
顺序,即酶切片段在DNA链上的定位。 （4）意义:
三. DNA突变分析
1. DNA → RNA → Protein → 性状 碱基改变后，或会影响蛋白质的形成，→
3. DNA序列分析的自动化 （1） 标记物——四甲基若丹明 tetramethylrhodamine （2） 读取——在电泳凝胶的侧面，固定一个激光通道
小孔，安装荧光信号接收器。
（3） 双脱氧法——ddNTP分别用四种不同颜色的荧光 标记。
七. 基因扩增（PCR技术）
1. 定义 又称体外基因扩增法，在体外（试管、
将外源DNA，通过具有复制能力的载 体分子形成重组DNA分子，导入受体细胞， 进行持久稳定的复制和表达，使受体细胞 产生外源DNA或蛋白质。是核酸操作技术 的一部分。
3. 二十世纪分子生物学的三大成就 4. DNA 重组技术
recombinant DNA technique 其核心是用限制性核酸内切酶和DNA连 接酶对DNA分子进行体外切割与连接。
制作方法：酶切—加接头—PCR—电泳—分析。 RFLP、AFLP用于突变分析的局限性：
突变必须发生于酶切位点区域，否则检测不到。
5. SSCP—单链构象多态性分析 （Single strand conformation polymorphism）
（1）基本原理：
（2）基本过程:
（3）局限性：
只有突变位点影响其空间构象才能被检出来。检 出率：70%
6. DGGE—变性梯度凝胶电泳 ( Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
（1）基本原理
（2）优缺点
变性梯度胶凝电泳能够将具有单个碱基差别的 DNA分子分离开来。点突变检出率可达100%，但操 作复杂，技术要求较高。
四. 核酸的分子杂交
1. Southern blotting杂交中常用的滤膜： 尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜、二乙氨基乙基纤 维素滤膜
5.重组DNA技术史上的主要事件
6.生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶 工程、细胞工程
第二节 DNA操作技术
一. DNA的分离、提取
1. 材料的选择 2. 组织匀浆
3. 破碎细胞 4. 除蛋白
5. 除RNA
6. DNA回收
7. 纯度鉴定：
（1） 电泳：常用琼脂糖凝胶电泳，，用 溴化乙锭（EB）染色，紫外灯下检测。
第一节 重组DNA技术发展史上的重大事件
1. 基因操作 gene manipulation
主要包括DNA分子的切割与连接、核 酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列 分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩 增等，是分子生物学研究的核心技术。
2. 基因工程 genetic engineering
第三节 基因克隆的主要载体系统
一.名词
1. 克隆（clone）
(1)细胞学定义，即无性繁殖，从一个共同 祖先无性繁殖下来的一群遗传上相同的DNA分 子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。
(2)分子生物学定义，指将外源DNA插入 具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保 存和复制的过程。
2. 基因克隆 gene cloning
也用聚丙烯酰胺凝胶电泳
A.琼脂糖凝胶电泳原理
B.检测量： C.检测信息： D. 两种方法比较
（2）纯度检测： 紫外吸收法（260nm） OD260 ---- 决定DNA的量 OD280 ---- 决定Protein的量 1.8 ≤ OD260/280 < 2.0 纯样品 < 1.8 不纯 ≥ 2.0 RNA（纯）
关键部位， 或无改变 ——非关键部位。
2. DNA结构变化：点突变、缺失、扩增
3. RFLP—限制性内切酶多态性分析（ Restriction Fragment Length Polymorphisms ）
制作方法：酶切—电泳—（转膜—杂交）—分析
4. AFLP—扩增片段长度多态性分析 （Amplified Fragment Length Polymorphism）
应用酶学的方法，在体外将目的基因与载 体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分 子（重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、 筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩 增、提取获得大量同一DNA分子拷贝