检验技术化学发光和荧光免疫技术及仪器

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(二)化学发光效率
化学发光反应的发光效率(φCl)又称为化学发光总能量的产生率
φCl取决于生成激发态产物分子的化学激发效率 (φCE) 和激发态产物分子的发射效率(φEM)。 一般化学发光反应，φCl值约为10-6
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(三)强度与反应物质浓度之间的关系
化学发光反应所发出的光的强度
反应速度
反应物的浓度
1．液相 吖啶酯(AE)。
2．固相
氧化铁(Fe2O3)。
包被面积大,减少了扩散时间,增加了捕获效率
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(二)ADVIA CENTAUR的反应类型
1．双抗体夹心法
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2．竞争法
包括AE标记抗原法和AE标记抗体法。
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3．捕获法
常用来检测样本中的特异性抗体，又称为抗体捕获法。
试剂中使用了一种抗人免疫球蛋白的抗体。抗 体捕获法通常使用两次温育和洗涤，第一次温育和 洗涤是为了除去样品中过多的干扰物质；第二次温 育和洗涤是为了检测样品中的抗体。
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4．戊二醛法
间接偶联
氨基
芳香伯胺基
双功能偶联剂
由于戊二醛在溶液中以单体和聚合体形式存在，后 者占多数，所以在标记反应中双方分子间构成较大的距 离，减少了在抗原抗体反应时的空间位阻；但因偶联不 易定量控制且缺乏特异性等而未得到广泛应用
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5．琥珀酸酐法(环内酸酐法) 间接偶联
此法没有双功能交联剂的不良反应，能实现标记物 和蛋白质分子间的单向定量缩合，标记效率高，已有商 品化试剂供应。
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6．异硫氰酸酯衍生物法
间接偶联
标记物
发光标记物
此法标记温和、稳定，获得的标记物不易脱落， 且不损失蛋白质等的生物活性
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7． O-(羧甲基)羟胺法
O-羧甲基衍生物
8．混合酸酐法
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四、反应类型
根据发光免疫分析中发光反应的不同体系和标记方法不同
化学发光免疫分析
化学发光酶免疫分析
微粒子化学发光免疫分析
A + B
C* + D,
C*
C + h
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(一)产生化学发光反应的条件和过程
化学发光与荧光的区别:
化学能 光能
化学发光反应的条件 :
反应必须提供足够的激发能焓变(△H)介于170～300 kj· mol-1 之间， 才能在可见光范围观察到化学发光现象 吸收了化学能后处于激发态的分子或原子，必须以光子形式将能量 释放出来，或者将能量转移到另一种物质的分子上并使该分子激发， 当被激发的分子回到基态时，也以光子的形式释放能量
直接偶联
芳香伯胺
此法简易、成本低、重复性好，但不适用于脂肪伯 胺基发光剂，因其生成的重氮盐不稳定，即使在０℃也 会生成氮气。此外，ABEI等伯胺基位于侧链者也不适用 此法。
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3．过碘酸盐氧化法
直接偶联
标记物可用发光剂或催化剂，适用于芳香伯胺或脂 肪伯胺发光剂，标记方法稳定标记物不易脱落，但此法 不适用于无糖基的蛋白质和含有糖基但氧化后会影响免 疫学活性的蛋白质。
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AMPDD一侧的芳香基团上的磷酸酯被水解，失去 一个磷酸基而生成一个中等稳定的中间体AMPPD(半衰 期2～30min)，此中间体通过内部电子转移而裂解为 一分子的金刚烷酮和一分子激发态的间氧苯甲酸甲酯 阴离子，当回到基态时发出波长为470 nm的光)
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常用标记物:
A L P
反应特点:
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2．化学发光酶免疫分析
(chemiluminescent enzyme immnunoassay，CLEIA)
原理:
采用参与发光效应的酶作为标记物标记抗体或抗原，免疫反应 后形成酶标记抗原抗体复合物，利用鲁米诺作为发光底物在酶和启 动发光试剂(NaOH-H2O2)的催化下，产生发光反应，发光强度依赖 于酶免疫反应物中酶的浓度。
①可采用竞争法和夹心法,多采用双抗体夹心法 ②采用磁性微粒作为固相载体，以碱性磷酸酶作为标记物， 固相载体的应用扩大了测定的范围,检测水平可茯Pg· mL-1， 重复性好。
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五、相关仪器介绍
ADVIA CENTAUR全自动免疫分析仪
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(一)ADVIA CENTAUR检测原理
利用化学发光和磁性微粒子分离技术相结合 的测定方法，用高敏感性的吖啶酯作为化学发光 标记物，以极细的磁性颗粒(PMP)作为固相载体， 提供最大的包被面积 。
Ag + Ab*
底物
Ag-Ab*
产物 发光
*
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常用标记物: 辣根过氧化物酶(HRP)或ALP 反应特点:
①标记物常标记抗体； ②标记物作为发光反应的催化剂，本身不发光 。
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3．微粒子化学发光免疫分析 (microparticle chemiluminescence immunoassay，MLIA)
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三、标记方法
化学标记
按照标记物的应用:
化学标记:
生物标记
用于化学发光(酶)免疫测定
直接用发光物质(如鲁米诺、吖啶酯类等)标记抗体或抗原 以催化剂(如HRP、GOD等)和／或协同因子(如ATP、NAD等) 标记抗体或抗原
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按照被标记物的结构或性质 :
对小分子物质(如甾体激素、药物等)的标记
原理:
• 以顺磁性微粒作为载体包被抗体，利用磁性微粒能被磁场吸引， 在磁力的作用下发生力学移动的特性，迅速捕捉到被测抗原。
• 加入碱性磷酸酶标记的第二抗体，形成磁性微粒包被抗体-抗原酶标记抗体复合物 • 经洗涤去掉未结合的抗体后，加入ALP的发光底物AMPDD，AMPDD被 复合物上ALP催化发光,发射光所释放的光子能量被光量子阅读系统 记录，通过计算机处理系统将光能量强度在标准曲线上转换为待测 抗原的浓度。
反应特点:
强烈的直接发光在1 s内完成，为快速的闪烁发光。
应用:
CLIA检测小分子抗原采用竞争法；大分子抗原则采用夹心法。与 大分子的结合不会减小所产生的光量，从而增加灵敏度。
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吖啶酯的特点
1)直接化学发光使用吖啶酯(AE)作为标记物，无需附加催化剂。AE 氧化直接发光，氧化反应在430 nm处快速发光并在1s内达到峰值。发光 强度是I125在1min内发光强度的十万倍，因此系统该具有高速度、产光强 等特点。 2)AE有甲基，增加了试剂的稳定性，使试剂的稳定性好，有效期更 长。 3)AE作为化学发光标记物，对温度及pH等外界环境的变化不敏感， 故其具有很高的精密度。 4)AE相对分子质量水常小(MW：481)，使其对结合反应的空间位阻作 用减少，增加扩散率，提高了灵敏度，可达l0-15mol· L-1。 5)AE是以共价键结合抗体而不影响抗体结合抗原的反应，故不影响 发光。 6)AE加碱后，发光是在一暗盒中进行，其光量值与浓度有着良好的 线性关系，且本底较低。
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二、标记物
钌的衍生物，分子结构简单、稳定、相对分子质 量小、水溶性强、空间位阻小等特点，可与待测物质 进行全量反应．使得ECLIA的测定具有高效性与稳定 性且没有噪声干扰。
三联吡啶钌
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第三节
一、基本原理
原理：
抗原抗体反应
时间分辨荧光免疫分析法
+
荧光物质标记
+
时间分辨技术
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用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物(代替荧光物质、放射核 素或酶)，通过双功能基团的螯合剂与蛋白质、多肽、激素、抗体、 核酸探针或生物活性细胞以共轭双键结合进行标记，待反应体系(如 抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细 胞与效应细胞的杀伤反应等)发生后，三价稀土离子螫合物可以在紫 外光激发下，发出强度高(波长为613nm左右)、持续时间长(10～l 000μs)的荧光，利用延缓测量时间，待样品中蛋白质等背景荧光完 全淬灭后，再测量三价稀土离子螯合物的特异荧光，根据荧光强度 和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量 分析的目的
是将ECL和免疫反应(抗原抗体反应)融为一体的标记免疫 分析技术,是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光 反应.
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一、基本原理
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技术特点
1．ECLIA为非核素方法，可避免核素的放射性污染 2．为均相免疫测定技术，检测中不需要分离结合相和游离相 ，操作简便 3．磁性微珠包被技术的应用使检测的灵敏度更高、线性范围 更宽、反应时间更短。 (byp) 4．标记物Ru 稳定性好，室温下半衰期大于1年，所标记的 蛋白活性在2～4℃也可保持1年：以上。 5．标记物可进行化学修饰，以形成易于和蛋自、半抗原及核 酸等分子结合的活性NHS酯或磷酰胺基团，可用于各种分析物的 检测。 6．标记物相对分子质量小，在一个抗体分子上可同时标记许 多标记物分子而不影响抗体的免疫学活性，也可用于核酸的标记 而不影响探针的杂交活性。 7．标记物的再循环利用使发光反应的时间更长、发光强度更 高，更易于测定。 8．仪器的没计使操作较为简便，更易于实现自动化。
A + B
C* + D , C* + F
F* + E,
F*
F + h
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二、反应的底物(发光剂或发光底物)
在化学发光反应中，参与能量转移并最终以发射光子的 形式释放能量的化合物 发光免疫技术中常用的化学发光底物:
１．氨基苯二酰肼类 主要有鲁米诺(3-氨基苯二甲酰肼，luminol)和 异鲁米诺(5-氨基苯二甲酰肼，iso lumino1)及其衍生物。 2．眯唑类化合物 较常用的是2，4，6-三苯基咪唑，即洛粉碱 (lophine)。 3．吖啶酯类 典型代表是N，N-二甲基二吖啶硝酸酯，即光泽精 (1ucigenin)。 4．苯酚类化合物 其中主要有邻苯三酚，即焦性没食子酸。 5．芳香草酸酯类 主要有双-(2，4，6，-三氯苯基)-草酸酯(TCPO)和 双-(2，4-二硝基苯基)-草酸酯(DNPO)。 6．(金刚烷)-1，2-二氧乙烷及其衍生物 11