第7章 种质离体保存

种质库：又称基因库（GenBank），是以种为单位的群体中 的全部遗传物质，它由许多不同基因型的个体所组成。 种质资源（germplasm resource）或遗传资源（genetic resource）：具有种质并能繁殖的生物体。
种质资源保存：为避免种质资源的流失，利用自然或人工创
造的适宜环境，实现种质材料生活力的长期保持。
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根据Luyet的冻结理论（1937），细胞内游离水的冻结
温度（-30℃）可认为是细胞冻存的安全温度，因而细
胞冻存的两步冻结法一般以-30℃为基础的。
也就是说，控制细胞内外水的冻结状态，是细胞冻存技
术的关键。
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超低温保存的原理
为什么在超低温条件下材料不会冻死。关键原因是进
行了“防冻处理”，具体如下：
本植物的冬芽，在超低温保存后，必须在0℃低温下进行慢速化冻
才能达到良好的效果。
保存方法：玻璃化冻存的材料在保存终止后，要求快速化冻，
以防止次生结冰对组织细胞造成伤害。
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五、培养及再生
1. 冷冻保存后细胞和器官活力的检测
再培养法
测定存活率
存活细胞(或器官)数目
存活率=
解冻(或器官)数目
×100%
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一、材料的基本特性
材料的基本特性包括植物的基因型、抗冻性、器官、组 织或细胞的年龄以及生理状态等（特别是基因型）。 植物细胞培养物的生长年龄，也是决定冻后细胞成活率 的最重要因素之一。指数生长期和滞后期的幼龄细胞抗冻 力强，存活率高。
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二、预处理和低温锻炼
预处理对于调整植物材料的生理状态非常有效，可以减少细胞内
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超低温保存的优点:
在超低温条件下，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎
完全停止，呈现“假死”状态。因此，细胞、组织和器
官在此过程中不会发生遗传性状的改变，也不会丢失形
态发生的潜能。
在超低温条件下，生命的代谢和衰老过程也基本停止，
故能够实现长时期的保存。
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超低温保存的意义:
可以在有限空间内保存大量种质材料；
行了超低温保存研究，其中：
种子、胚、胚轴和胚的保存一般采用干冻法； 茎尖和分生组织多采用玻璃化法或包埋脱水法； 愈伤组织和悬浮细胞大多采用两步法。
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第二节 植物材料超低温冻存的细胞学基础
一、细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键
植物细胞中含有大量的水分，约占细胞总重量的60-90％。细
也有不同，如甘油适用于慢速冷却，DMSO容易渗入细胞，但有轻微
毒性。
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非渗透型冰冻保护剂
特点：能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，
在特定温度下能够降低溶质（电解质）浓度，从而起到保护
作用。 聚乙二醇(PEG)、白蛋白(Albumin)、羟乙基淀粉(HES)等。
种类：主要有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖(Dextrane)、
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三、冰冻保护剂的应用
冰冻保护剂（Cryoprotective agent，CPA）也称抗冻剂，为 植物低温保存必不可少。 特点：易溶于水，对细胞无毒害，容易从组织或细胞中清除。 作用：增加膜透性，加速细胞内水流到细胞外结冰；稳定细胞膜
结构，阻止低温伤害；降低冰点，提高溶液的粘滞性，阻止冰晶的
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种质资源保存方法
就地保存（自然保护区）
迁地保存（种质圃保存）
按材料和方式 种子保存 离体培养保存
基因文库保存
常温限制生长保存 中低温调控生长保存 低温干燥保存 按保存条件 （温度、含氧量等） 减压保存 低温保存（低于-80 ℃） 超低温保存（-196 ℃）
难以长期保持种质寿 命，对种质保存的作
用不是很大。
水冻结产生的冰晶体积非常小，呈现为一种玻璃状的冻结现象，避
免细胞受到伤害，达到细胞冷冻保存的目的。
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2.低温下细胞的致死损伤
超低温保存的一般过程： 预冻 超低温长期保存 解冻
超低温保存是建立在生物细胞冻害和抗冻机理的基础之上的。
超低温保存成功的关键，在于降温过程中避免细胞内溶液结冰。为
此，对于不同的植物种类或材料，应筛选相应的冰冻保护剂，采用 适当的降温速度及化冻方式，才能使细胞不受损伤或损伤最小。
在冰冻保保护剂的作用下，既可避免在细胞脱水时细胞内产生冰 晶，又能防止因溶质含量增加引起的“溶液效应”。因此，对于原生 质 体、悬浮培养细胞等细胞类型一致的培养物，这种方法效果最好。
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2．快冻法：将材料用玻璃瓶或锡箔纸袋保护后直接投入 液氮或液氮的蒸气相中，该方法对高度脱水的材料如种 子、花粉及抗寒性很强的休眠枝条或冬芽比较适宜，对 含水量高的细胞培养物则不适合。
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第一节
概 述
一、植物种质资源低温保存的意义
防止物种或品种灭绝 节省人力物力 便于种质资源的国内外交流
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二、超低温保存的概念
低温保存（cryopreservation）是由cryo和preservation组成，在
英语中cryo为一前缀，被解释为低温、冷、冰、霜之意。从词义
看，低温所涉及的温度范围是不确定的。 超低温:≤-80℃ 极低温:≤-70℃ (干冰温度) 低温:≤4℃
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3．分步冰冻法：是慢冻法和快冻法的结合，先用较慢的
速度(0.5 ～ 4℃/min)降至-30～-40 ℃，停留0.5～1h，然
后直接投入液氮中保存。停留的目的是诱导细胞外水分 结冰，对细胞进行保护性脱水，避免细胞内产生非均一 性冰晶。
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4. 干冻法：将样品在高浓度(0.5-1.5M)渗透性化合物培养基
上培养数小时至数天，再经过硅胶、无菌空气干燥脱水数
小时(使含水量降至17～40％)或用藻酸盐包埋后投入液氮 保存。该法特别适合于愈伤组织、体细胞胚、胚轴、胚、 茎尖、生根苗保存，但不适用于脱水敏感的材料。
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二、玻璃化保存方法
玻璃化（vitrification）是指液体转变为非晶体玻璃态的固化 过程。 使溶液玻璃化有两条途径：一是大幅度提高冷却速率；二是增加 溶液浓度。
自由水含量，减轻冷冻伤害，提高抗冻能力。
预处理措施:包括提高培养基的糖浓度、提高渗透压以减少细胞 如0.3-1.0Ｍ蔗糖、甘露醇、山梨醇等渗透压调节剂，5-10％DMSO 等冰冻保护剂。 低温预培养：将材料于0℃以上低温、黑暗或弱光下离体培养几 周，可明显增强其忍耐冷冻能力。
内自由水含量；在预培养基中添加诱导抗寒力的物质或冰冻保护剂，
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第三节 超低温保存的方法
超低温保存的程序包括培养材料的准备、预处理、冰 冻及保存、化冻处理、细胞活力测定、植株再生和变异评 价等步骤。 降温冰冻方法 超低温保存的方法 玻璃化保存方法
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一、传统的降温冰冻方法
1．慢冻法：以0.5-2℃/min速度降温至-100℃后投入液氮，或以该速度
一直降温至-196℃后投入液氮。
生长。 依据渗透性的有无，可将CPA分为两类：
渗透型
&
非渗透型
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渗透型冰冻保护剂
特点：多为中性低分子物质，在溶液中易与水分子结合发生水合作
用，增加溶液的粘稠度，降低溶液的冰点，从而弱化了水结晶的过
程，达到保护材料的目的。 种类：常用的有甘油、二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、乙 酰胺、丙二醇（PG）。 不同渗透型冰冻保护剂渗入细胞的能力及其对水分子活性的影响
(b) 用海藻酸钙包埋茎尖。
(c) 将包埋体臵于超净工作台上吹风干燥。 (d) 将包埋体在含0.75 M蔗糖的培养基上预培养，进一步脱水。 (e) 将包埋体臵于冷藏管中，投入液氮中保存。 (f) 快速化冻。 (g) 植株再生。
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第四节 影响超低温保存效果的因素
材料的基本特性 预培养与低温锻炼 冰冻保护剂的应用 解冻方法 再生技术
胞中的水由游离水和束缚水组成，其中游离水约占90％，很容易
冻结，由于细胞内含有许多化合物，因此细胞内溶液并不象纯水 那样在0℃就结冰。
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1.细胞内外水分的冻结特性
理论上讲，细胞外水的冻结温度为-5～-15℃，细胞内 游离水的冻结温度为-25℃，故在-30℃时，细胞内的游离 水全部被冻结，而结合水则在-100℃温度下也不发生冻结。
置于0℃下一段时间，再于室温下缓慢解冻效果较好。
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另外，不同材料或方法采用的化冻方式也有不同：
材料含水量：液泡小、含水量少的细胞（如茎尖分生组织），
可采用快速化冻的方法；液泡大、含水量高的细胞则一般需要采用 慢速化冻法。
材料的生理状态：生长季节中的材料，一般在37～45℃温水
浴中快速化冻（500-700℃/min）比在室温下慢速化冻要好，而木
与种子保存相比，可以不受时间和种子含水量的制约；
与试管苗相比，可以避免频繁继代培养造成的变异，并 大幅度减少工作量。
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常用的超低温保存方法：
冷冻诱导保护性脱水的超低温保存法
玻璃化处理的超低温保存法
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三、超低温保存的研究概况
1．超低温保存技术的发展
2．用于超低温保存的植物材料
3．超低温保存的植物种类 据王君晖等1998年统计，有40多个属60多个种的木本植物已进
使用冷冻防护剂可以降低培养基和培养材料的冰点。
使用冷冻防护剂可以提高培养基的渗透压，导致细胞发
生轻微质壁分离，从而提高了组织和细胞的抗寒能力。
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根据细胞内外水分的冻结特性，冻存方法有：
分步冷冻：在细胞内游离水冻结之前，先使细胞外水分冻结，从 而使细胞内游离水向胞外渗溢，导致细胞适度脱水，利于细胞的冷 冻保存。 快速冷冻：也称玻璃化冷冻保存技术，通过迅速降温，使细胞内
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2.包埋玻璃化法 包埋玻璃化法是包埋脱水法和玻璃化法的结合。
先把保存材料用藻酸钙包埋，再经蔗糖浓度梯度脱水和玻 璃化溶液处理后投入液氮保存，其存活率比包埋脱水法要高， 可能是因为藻酸钙的包埋减轻了玻璃化溶液的毒性。
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包埋玻璃化的实例
(a) 将离体培养诱导的茎尖在黑暗和低温（4℃）条件下进行锻炼。
保持原有种质的遗传稳定性，是种质保存的基本要求。 超低温保存的遗传变异属于体细胞变异。 变异与起始细胞的生理状态和培养基、预处理方式、解冻方式等 有关（变异基本上都是在非超低温下产生的）。
在保证保存材料活性的同时，应尽量采用减少变异的方法技术。
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为了掌握超低温保存材料的遗传变异情况，有必要 在保存材料的恢复和再生阶段建立有效的检测体系。目 前，形态学观察、细胞学方法、同功酶、分子标记（如 RFLP和RAPD）等检测方法常常单独或结合起来用于 遗传变异分析。
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2. 培养及再生
经冻存的材料，不可避免地受到一些伤害，需要小心 维护：
培养:一般将材料培养在黑暗或弱光下培养1-2周，再转入正常
光照下培养。
培养基:一般是保存前使用的培养基，但有时需将大量元素或琼
脂含量减半，或在培养基中附加一定量的PVP、水解酪蛋白等，以
来自百度文库
利于材料的恢复生长。
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六、超低温保存中变异及其检测
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四、解冻方法
根据解冻速度分为快速解冻和慢速解冻两种方式：
快速解冻：能使材料迅速通过冰融点的危险温度区(-50～10 ℃)，防止降温过程中形成晶核对细胞造成损伤。通常的做
法是把样品放入37～45℃温水浴中，待冰完全溶化后（约90s） 立即移开。
慢速解冻：对于脱水处理后干冻保存的材料，一般认为应先
第七章 种质离体保存
低温 保存的 细胞学 基础
概 述
超低温 保存的 方法
影响 保存 效果的 因素
保存中 遗传变异 的检测 与利用
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几个相关概念（见《园艺植物育种学》）
种质（germplasm）：决定生物的遗传性状，并将遗传信息 从亲代传递给子代的遗传物质。种质资源包括动植物的个体、
器官、组织、细胞甚至控制生物遗传性状的基因。
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1.玻璃化法
玻璃化法是指将生物材料经高浓度玻璃化溶液快速脱
水
后，直接投入液氮，使材料连同玻璃化溶液同时转变成玻璃
态。在此过程中，水分子没有发生重排，不形成冰晶，不发
生结构和体积的改变，因而不会对材料造成机械损伤。当保
存终止后，通过快速化冻防止去玻璃化的发生。如果材料能 够安全度过冷却和化冻两个关口，冻存即告成功。
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但对植物而言，低温常常是指那些比常温稍低一些的温度。如
果低温超过细胞原生质所能忍受的临界温度，就会致使植物细胞遭
受冻害而死亡。如甜橙树发生冻害的临界温度通常在-6.5℃，枳壳 通常在-20℃左右（沈德绪等，1986）。
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低温保存（Cryopreservation），是指将植物的组织或 细胞经过防冻处理后，在低于-80℃条件下保存的方法。 超低温保存：将植物的组织或细胞经过防冻处理后，在 -196℃的极端低温下保存的方法。