贴壁细胞培养步骤及注意事项

贴壁细胞培养步骤

一、复苏

1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。液体都融化

后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。

2.把上述细胞悬液吸到装有10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存

管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。

3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm

培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。

4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后

换培养基。

5.3天换一次培养基（具体看细胞生长状态及培养液情况）。

二、传代

1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。

2.把原有培养基吸掉。

3.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS

4.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。

5.当看到细胞开始脱离培养皿时倒掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终

止消化。

6.用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。

7.把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。

8.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。

9.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传

3个，继续培养。

10.若是只培养一皿，只需吹散后倒剩1/4左右，重新加入培养液继续培养。

三、冻存

1.把原有培养基吸掉。

2.加入2毫升PBs洗两遍，最后吸净培养皿中的PBS

3.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化（消化时长看情况而定）。

4.去掉酶液，加入2毫升左右含血清的培养基终止消化。

5.吹落后把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。

6.加入1毫升冻存液悬浮细胞，装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞

种类，冻存日期。

7.4℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。

配制溶液

一、培养基配制

（1）（DEME培养基）89%基础培养基+10%血清（FBS）+1%双抗

45毫升培养基+5毫升血清+0.5毫升双抗

（2）（1640培养基）89%基础1640培养基+10%血清（FBS）+1%双抗45毫升培养基+5毫升血清+0.5毫升双抗

二、冻存液

90%血清+10%DMSO；DMSO要慢慢滴加，边滴边摇

三、消毒液

75%的酒精

注意事项

（1）进入细胞间必须严格按照下列步骤操作

①确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。

②确定衣服的袖口已经卷起或者白大褂的袖口已经扎紧。

③确定酒精灯内的酒精量，需要的话及时进行补充。

④确定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。为了方便单手开启瓶盖，实验开始前可以把所有瓶盖旋松。

⑤尽量不要直接倾倒溶液，除非瓶口没有被烧坏。如果倾倒失败，溶液粘在瓶口，请用喷过75%酒精的纸巾仔细清洁瓶口周围（不要接触到瓶口）后在火焰上简单烧灼。

⑥操作时如果不能肯定所用的耗材是洁净的，必须及时更换。

⑦实验完毕及时收拾，保持工作区域清洁整齐，最后用75%酒精清洁台面。（2）细胞污染的预防

①实验用品防止污染。细胞培养所用试剂、耗材、器材的清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌要仔细，并在无菌实验检测阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁、消毒、灭菌。

②操作过程防止污染。

③穿着容易起静电或吸附灰尘的衣物必须更换为白大褂后才能进入细胞间。

④实验开始前需要确定戴的手套没有问题，只要接触过生物安全柜之外的物品，必须及时对手套进行消毒。

⑤进入细胞培养间后关好门，坐下来尽量少走动以免影响生物安全柜的风帘。工作开始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶盖。事先要严格检查所用的器材、溶液和细胞，不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，以免造成大规模污染。

⑥细胞操作时动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口放在火焰周围简单转动烧灼，注意不要让火焰把塑料瓶口烧化。

⑦实验操作时生物安全柜的隔板要尽可能放低，尽量减少谈话，打喷嚏或咳嗽时绝对不能对着工作区，以免造成不必要的污染。

⑧瓶盖应当倒放在远离自己的地方，以避免瓶盖被误操作所污染。

⑨不要从敞开的容器口上方经过，以避免衣服上掉落不明物体对细胞的污染。

⑩实验操作时要注意及时更换巴斯德吸管、移液枪枪头和移液管，切勿一根管子做到底。一旦发现接触了非洁净或者无法确定洁净的物品必须直接丢弃。实验完毕应及时收拾，保持实验室清洁整齐，最后用75%酒精清洁台面。

（3）防止细胞交叉污染

①进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好作上标记便于辨别。按顺序进行操作，一次只处理一种细胞，多种细胞多种操作一起进行时易发生混乱。

②在进行换液或传代操作时，粘有细胞的移液枪头和移液管不要触及试剂瓶瓶口，以免把细胞带到培养基中污染其他细胞。

③所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自己建立，必须及时保种冻存，一旦发生污染可重新复苏细胞，继续培养。