基因敲除技术

第23卷武 夷 科 学V o.l23

2007年12月WUY I SCIENCE J OURNA L D ec.2007

文章编号:1001 4276 (2007)01 0187 04

几种常用的基因敲除技术

李今煜,陈健铭,彭振坤

(福建农林大学生命科学学院,福建福州350002)

摘要: 摘要:随着功能基因组学研究的深入发展,基因敲除技术逐渐成为基因功能研究的重要手段,本文就常用的三种基因敲除技术,即同源重组、插入突变、RNA干扰各自的原理、适用的范围和优缺点作简要介绍。关键词: 基因敲除;同源重组;插入突变;RNA干扰

中图分类号: Q343.1 文献标识码: A

随着越来越多生物的全基因组被测序,功能基因组学成为时下研究的热点。研究基因功能的方法主要有两种思路,一是通过增强其表达,取得表达产物进行研究,二是减弱或者终止其表达,观察整体功能的变化,进而推测相应的基因功能。前者因为不能反映基因产物的真实表达情况,而逐渐被抛弃。后者将基因与生物的整体功能联系起来考察,并能为基因的功能提供直接证据,因而其技术不断得到发展和完善,其中最常用的就是基因敲除(gene knockou t)技术。

基因敲除技术除最早的同源重组技术外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和RNA,i它们同样可以达到基因敲除的目的。下面就这几种基因敲除技术简要进行介绍。

1 利用同源重组进行基因敲除

基因敲除是在同源重组技术及胚胎干细胞(e mbryon i c ste m cel,l ES细胞)技术的基础上逐步完善发展起来,主要是利用DNA转化技术,将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞,通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组,将外源基因整合入内源基因组内,使外源基因得以表达。通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变,达到研究基因功能的目的[1]。

基因敲除技术已从最初简单的完全敲除发展到条件敲除阶段,现正朝着特定组织基因敲除、特定时间基因敲除的可调控敲除方向发展。完全基因敲除是通过同源重组直接将靶基因在细胞或者动物个体中的活性完全消除;而条件基因敲除则是将某个基因的修饰限制于特定类型的细胞或个体发育特定的阶段,即通过位点特异的重组系统实现特定基因敲除[2],现阶段以噬菌体的C re/Loxp系统和酿酒质粒的FLP/FRT系统应用得最为广泛[3]。

虽然基因敲除技术的广泛使用使其成为研究基因功能重要的技术手段,但目前仍然存在

收稿日期:2007-09-26

基金项目:福建省自然科学基金计划资助项目(项目编号:2006J0052)。

作者简介:李金煜(1976-),女,硕士,研究方向:主要从事生物化学与分子生物学领域的研究。

一定的不足:(1)操作复杂,实验周期长,费用偏高;(2)在敲除过程中,被破坏的常常只是靶基因的部分外显子而并不是整个编码区,残留的编码序列有可能组合出新的未知的功能,这将给表型分析带来麻烦;(3)对于某些必需基因,敲除后会造成细胞死亡,也就无法研究这些必需基因的功能;(4)由于基因功能上的冗余,敲掉一个基因并并不能造成容易识别的表型,基因家族的其他成员可以提供同样的功能;(5)同一个打靶载体在不同遗传背景下进行基因敲除,获得的表型差异很大。

总的来说,基因敲除小鼠模型的建立周期长、技术含量高、风险性大。至今国内外仍没有在基因打靶方面取得突破性进展使得此技术能够满足快速化、高通量研究基因功能的要求。2 利用随机插入突变进行基因敲除

基因定点敲除虽然是最直接的研究基因功能的方法,但是对开花植物而言,缺乏高效实用的定点突变技术。目前较为有效的方法是大规模的随机插入突变,它为在基因组范围内敲除掉任何一个基因提供了可能。这项技术具有效率高、基因完全失活、容易分离鉴定被插入引起失活的目的基因等优点。随机插入突变可以分为T -DNA 插入突变和转座子插入突变。

以农杆菌介导的T-DNA 插入突变适用于多种植物,可以直接在植物基因组DNA 中产生稳定的插入突变,而且插入位点的随机性较强,但是它只适用于那些容易被T-DNA 转化的植物,且常常会引起的染色体重排现象,使突变体表型与T-DNA 插入无关而难以进行遗传学分析。尽管如此,近年来将T-DNA 插入突变应用于拟南芥还是获得了广泛的成功。[4]

转座子插入突变是利用了转座子在染色体上可移动的特点,当它跳跃插入到某个功能基因时,就会引起该基因的失活,并诱导产生突变型。因此可以利用某些能随机插入基因序列的转座子,在目标细胞基因组中进行随机插入突变,建立一个携带随机插入突变的细胞库,然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。

目前研究报道,能用于任何物种的转座子打靶载体是以两种噬菌体M u 为基础的m ini-M u 转座子(每个转座子上都携带标记基因),它们可以在拟删除基因两侧各插入一个m ini-M u 转座子,然后在两个插入位点之间的制造缺失。这种缺失可以使两个转座子加上靶区之间的部分基因转移,留下一个带有选择性标记在两侧的与靶基因同源的臂。利用m i n i-M u 转座子进行基因敲除具有极大的方便性,它不需要知道基因组序列,仅已知外显子即可,且载体构建迅速,技术简单,载体可以携带多种不同抗性基因,可以同时处理多基因。但是转座子的应用也有一定限制,比如要求转座子本身较短,容易操作,且对任何拟敲除区域有较高转座效率等[5]。

3 RNA 干扰引起的基因敲除

现在普遍认为转录后基因沉默是生物保持基因的完整性,抵御外来核酸入侵,抑制转座因

子诱导DNA 突变的手段,广泛存在于真菌、植物、线虫、脊椎动物和大肠杆菌中[6]。RNA 干扰

(RNA i n terference ,RNA i)是一种普遍的转录后基因沉默的机制,由si R NA (s m all i n tereference RNA )引起,si R NA 是外源基因产生的dsRNA 在D icer 酶的作用下所产生的长度为21-22nt 的一系列片段的总称,具有很强的关闭基因的功能,能够介导RNA 干涉现象,诱导出一种由si R NA 分子、核酸酶以及螺旋酶等结合在一起的RNA 诱导沉默复合物(RNA -i n duced silencing co m p l e x ,R I SC)。RISC 能够解开si R NA 并精确的指导特异的mRNA 降解,使细胞抵抗外来基 188 武夷科学第23卷