大量提取质粒DNA(CsCl密度梯度离心法)
质粒DNA的人工氯化艳线性梯度分离法
效果更佳。
在紫外灯下，抽提质粒带时要看清界面，
ｐＲ 的 ｏ 带， ｃ Ｂ ３２ ２ ｃ 在 ｃ ｃ带的上部， 小心地抽
图 ４ 由图 ３ 抽出的大质粒和染色体带与碱酚 抽提的质粒的凝胶电泳图的比较
讨
论
取就可分别获得纯的 ｏ ｃ和 ｃ ｃ ｃ质粒；染色体 Ｄ Ａ远离小质粒带， Ｎ 在小的质粒中不易混进染 色体 Ｄ Ａ 而大质粒带上部是染色体带，不 Ｎ 。 小心时，抽出的大质粒中易混进少量 染色体
样品一起电泳 ， 结果见图 ４ 粗制大质粒含有一 ，
ｓ
从 １ 的细菌培养物，得到 ｐＲ ２ ｃ １ Ｂ３ 的 ｃ ２ ｃ 质粒 ３０ｇ 得到 ｏ １０ ０ｐ ， ｃ ，；同样体积的细菌 ５ｐ ｇ
培养物可得大质粒４０ｇ ０１。对ｐＲ 作过转 ｚ Ｂ ３２ ２
化试验。与均一Ｃ Ｃ－ Ｂ离心得到的 ＤＮＡ的 ｓＩ Ｅ 转化率相似。
犯 幼 倡 状
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大质校
配制线性梯度 （Ｃ － ｌ溶液取决于两种不同 ＂ ， 浓度的 Ｃｃ 溶液， ｓｌ 当低浓度的Ｃｃ 小于 ０ Ｍ ｓｌ ． ６ 时， 加人的Ｄ Ａ样品要减少； ６ ＣＣ 浓度 Ｎ 比 Ｍ ｓｌ 更高时， 又会缩短离心后呈现的染色体Ｄ Ａ和 Ｎ 质粒带 Ｄ Ａ带之间的距离， Ｎ 影响分离效果。 若 低于 ６ Ｍ时， ｐＲ ２ 的 ｃ 构形Ｄ Ａ 则 Ｂ ３２ ｃ ｃ Ｎ 更靠近 离心管底部。 象本文用的两种质粒选用 ０ Ｍ ． ６
个大质粒和一个小质粒，还有染色体片段。而
抽 出的大质粒带只有大质粒 Ｄ ＮＡ，染色 体 带 只有染色体片段。
稍上的带是上面提到的 ｏ ｃ质粒。
带 Ｋ ８ａ ８ ｃ抗原质粒经人工线性 ＣＣ－Ｂ ｓＩ Ｅ 离心后， 在紫外灯下呈现 ３条 Ｄ Ａ 带 （ Ｎ 见图 ３， ） 上带是染色体片段带， 稍下是大质粒带。 抽出染色体和大质粒带，再和粗制大质粒
质粒抽提原理
为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I,50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
让我们先来看看溶液I的作用。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl 溶液，是再自然不过的了。
那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
轮到溶液II了。
这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4 N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
用了不新鲜的0.4N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。
(CsCl 密度梯度离心法)
中量提取质粒DNA（CsCl密度梯度离心法）李渊越1.将菌液倒入装有50mL TB的锥形瓶中，或从培养好的平板上挑取单克隆，锥形瓶置于37℃摇床350rpm 培养16-20h,至OD600到10-12。
（OD600到40为用TBS培养基在我们的培养条件下所能达到的最高浓度，在此浓度时，菌处于对数生长期）2.将培养好的菌液到入国产50mL离心管中，每管不超过45mL。
（有实验表明，若往离心管中装入超过45mL的液体，离心后，液体的终体积仍为45mL。
因此，一次不应离超过45mL的液体，否则将污染离心机。
）3.室温离心5,000rpm，5min。
弃上清，控干。
4.加P1-RNase至终体积到7mL，震荡重悬至菌均匀分散。
（按该法最多只能裂解45mL 13OD的细菌，如需裂解更多细菌，请按比例增加。
否则将导致细菌裂解不完全，反而提到更少的菌。
）5.加14mL P2，盖上盖子，上下颠倒混匀2min。
（该步一定要混匀，以达到将细菌完全裂解的目的。
加入P2后可见溶液澄清粘稠，该步反应时间不应过久）6.加7mL P3。
（P2和P3之间反应时间不要超过5min。
混匀后可见絮状沉淀。
该步若置于冰上，沉淀效果更好。
但位于室温的反应以足以达到实验需要。
）用H2O配平至对称管重量差<0.1g。
7.室温（4度更好，但没有必要。
）离心，10,000 rpm, 5min。
8.将上清用滤纸过滤至另一国产的50mL管中。
加0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀后室温（不可置于4度。
若置于4度，将会使部分盐析出）静置10min。
（分子克隆p35）9.室温离心10,000rpm 15min。
10.弃上清，在加1.8mL H2O溶解完全后，平均分至两个1.5mL管中，再分别往每管中加入二分之一体积的PEG8000，4C沉淀2小时。
11.3,000 rcf离心3min，弃上清。
（可以不要非常完全控干）12.加1.55mL CsCl溶液溶解至沉淀完全溶解。
病毒大量制备和CsCl梯度离心纯化-zsd
病毒大量制备和CsCl梯度离心纯化：1. 将293细胞铺于30-40个10cm dish，至细胞长满，每块板加入合适滴度的病毒（约107-108 pfu/ml）10 µl，感染细胞，待细胞全部病变后（4-7天），每块板中加入约500 µl（150ul）10% Nonidet P 40（NP40）以裂解细胞。
收集整个细胞裂解物，如果不是立即做CsCl纯化的话，可放在-80°C 冰箱。
2. 12,000 rpm离心10 min，弃细胞碎片，收集上清。
每100ml上清加入50 ml PEG8000（20% PEG8000，2.5M NaCl），冰上1 hr沉淀病毒。
3. 12,000 rpm离心上述混合物20 min，弃上清，将沉淀物悬浮在10 ml 密度为1.10g/ml的CsCl溶液中（溶剂为20 mM Tris-Hcl，pH 8.0）。
4o C 7,000 rpm离心5 min，收集病毒悬浮液。
4. CsCl梯度的制备，用滴管轻轻加入2.0 ml的CsCl （密度1.40g/ml，溶剂同上）。
再加入3.0 ml 密度为1.30 g/ml 的CsCl 溶液。
再加入5 ml的病毒悬浮液。
20,000 rpm，室温离心2 hr。
收集密度在1.30-1.40g/ml 之间的病毒条带至透析袋中，透析袋用前用10 mM 的EDTA Na2煮沸10 min。
在透析缓冲液（将50g蔗糖，10ml 1M pH为8.0的Tris-HCl液，2ml 1M MgCl2溶液定容至1,000 ml）中，4o C 透析过夜，中间换一次透析液。
收集病毒，测定病毒滴度。
三种密度的CsCl溶液配制（溶于灭菌20 mM Tris中, pH8.0），4℃保存。
欢迎下载，谢谢观看！资料仅供参考学习。
质粒dna的碱法大量制备,实验报告
质粒dna的碱法大量制备,实验报告大量制备质粒DNA方法SDS碱裂解法制备质粒DNA：大量制备用碱和SDS处理可以从大规模（500ml）的细菌培养物中分离质粒DNA，所获得的质粒则可通过柱层析或CsCl-溴化乙锭梯度离心进一步纯化：材料：缓冲液和溶液：碱裂解液I：50mmol/L 葡萄糖25mmol/L Tris-HCl （pH8.0）10mmol/L EDTA （pH8.0）（溶液I一次可配制100ml，在15psi[1.05kg/cm2]压力下蒸汽灭菌15min，保存于4摄氏度。
）碱裂解液II：0.2 N NaOH （从10N贮存液中现用稀释）1% （m/V）SDS（溶液II要现用现配，室温下使用）碱裂解液III：5mol/L 乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml双蒸水（去离子水）28.5ml 所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。
保存于4摄氏度，用时置于冰浴中。
）另需：乙醇异丙醇STETE（pH8.0）溶菌酶（10mg/ml）现在开始实验：细胞的制备：1. 挑取转化细菌的单菌落，接种到30ml含适当抗生素的培养基中。
注：a. 试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大4倍。
b. 试管不宜盖的太紧c. 应在剧烈振摇下温育2. 在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚期（OD600约为0.6）。
3. 在含500mlLB、YT或Terrific培养液（预热到37摄氏度）及适当抗生素的烧瓶（2L）中接种25ml对数生长期晚期的菌液，将此培养液在37摄氏度剧烈振摇（300r/min）培养约2.5小时。
注：最后菌液的OD600值应为0.4。
由于不同菌株的生长速度不同，可稍微延长或缩短培养时间，使最终的OD值为0.4。
4. 若质粒为低或中拷贝数的松弛型质粒，在培养液中添加2.5ml 浓度为34mg/ml的氯霉素，使其终浓度为170微克/ml。
注：对于高拷贝数的质粒不需要添加氯霉素。
DNA提取原理和方法
NaOH ：溶解细胞，DNA变性
SDS ： (1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。 (2)解聚细胞中的核蛋白。 (3)SDS能与蛋白质结合成为复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。 SDS与NaOH联用：增强NaOH的强碱性
SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液的成分及作用
DNA的保存 ：
1. DNA 则多以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解。 2. 基本上，核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度 成正比。
非基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
碱裂解法
密度梯度离心法
煮沸法
质粒DNA的提取--碱裂解法
1、培养细菌使质粒扩增 ---对数生长后期 2、收集和裂解细菌 3、质粒DNA的纯化
12. If there is no pellet, place samples in -80º C for 10 min
and spin at 13,000 rpm for 25 min at 4º C; 13. Wash pellet once with 70% ethanol, air dry; 14. Resuspend DNA in ddH2O.
after 24 hr;
Proteinase K :
作用：广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很 高的活性，降解蛋白质，将DNA游离。
4. Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for
15 min at RT; 5. Spin at 13,000 rpm for 30 min at RT;
dnadna提取的几种方法提取的几种方法质粒dna的提取断裂成为线状共价闭合环状结构dna细胞破碎方法应用机械法1匀浆法机体软组织2捣碎法动物韧性组织3研磨法细菌酵母物理法1超声法细胞混悬液2反复冻融法培养细胞3冷热交替法细菌病毒4低渗裂解红细胞化学法1有机溶剂细菌酵母2去垢剂组织培养细胞3酶解法细菌酵母根据裂解方式的不同有
质粒提取
４、加入３50 μl Solution Ⅲ，上下颠倒10次, 离心 12,000rpm 10min; ５.取上清（不可吸到絮状沉淀）臵于对应编号并带有 收集管的离心柱，离心10，000×g 1min，弃液（可 重复一次，提高DNA量，即集中管液倒回离心柱）； ６.加 500ul HB（深度清洗）离心10，000g 1min，弃 液（可重复一次）； 7.加Wash Buffer（确保已加入无水乙醇） 700ul 离心 10，000g 1min，弃液（可重复一次）； 8.空柱离心12，000g 2min； 9. 加Elution Buffer 50ul ,下接标记好的Ep管，盖上离心 柱的盖子 60℃温育10min,离心13，000g 2min
质粒大于15kb在细胞裂解操作时容易受损， 故应采用温和裂解法从细胞中释放出来。通常 将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，再用溶菌酶和 EDTA（乙二胺四乙酸）进行处理，破坏细胞 壁。然后加入SDS （十二烷基磺酸钠）等去污 剂裂解球形体。
小质粒(小于15KB)的处理可用较剧烈的方法
对小质粒的操作可以用许多无需特殊处理的裂 解方法。典型的方法是让细菌溶解物悬于去污 剂中，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理 能破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体 DNA变性。闭环质粒DNA链则处于拓扑缠绕状 态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒 DNA链迅速得到准确配臵，重新形成完全的天 然超螺旋分子。
通过不连续或者预先形成的氯化铯梯度离心， 可在离心管中获得含有不同浓度ＣｓＣｌ的溶 液分层，样品位于中层（三级梯度法）或者底 层（两级梯度法）。在随后的离心梯度形成过 程中，ＤＮＡ找到其等密度点，从而使离心时 间大大缩短。
因为不连续梯度法不能达到真正的平衡，使其 闭环质粒ＤＮＡ与染色体ＤＮＡ直接的分辨率 不如自身形成的梯度那么高。一般说来，与二 级梯度法相比，三级梯度法能在较短的时间内 给出更好的结果。
（完整版）质粒DNA的提取、纯化与鉴定
（完整版）质粒DNA的提取、纯化与鉴定分子生物学实验报告题目：质粒DNA的提取、纯化与鉴定姓名：学号：班级：时间：一、实验目的：1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。
2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。
3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。
4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。
5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。
二、实验原理：1.质粒DNA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard 法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。
少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。
碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS 复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
优化的密度梯度离心法提取质粒DNA
第16卷 第4期 衡水学院学报 Vol. 16, No. 4 2014年8月 Journal of Hengshui University Aug. 2014收稿日期：2014-01-20作者简介：高英杰(1978-),男,河北饶阳人,河北师范大学生命科学学院实验师;赵红桃(1983-),女,河北行唐人,河北师范大学生命科学学院讲师,理学博士.DOI:10.3969/j.issn.1673-2065.2014.04.013优化的密度梯度离心法提取质粒DNA高英杰，赵红桃(河北师范大学 生命科学学院，河北 石家庄 050024)摘 要：质粒常被用做基因的载体．纯化质粒DNA 的方法可以分为3种：碱裂解法、煮沸裂解法和SDS 碱裂解法．这些方法可以纯化共价闭合环结构质粒DNA ，而大量获得高纯度的闭环结构质粒DNA 最经典方法是氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法．该方法经过我们的实践与优化，减少了质粒中蛋白质和基因组DNA 的污染，提高了质粒的纯度和得率，所得到的质粒用于拟南芥原生质体转化，效率高达60 % ~ 70 %，明显高于普通的质粒小量抽提试剂盒所提取的质粒DNA ． 关键词：质粒DNA ；氯化铯-溴化乙锭；密度梯度离心法；拟南芥原生质体；转化效率中图分类号：Q781 文献标识码：A 文章编号：1673-2065(2014)04-0049-03质粒DNA 是一种基因运载工具，在分子生物学、基因工程中有着极为广泛的应用，作为质粒载体有3个共同的特征：一个复制子、一个选择性标志和一个克隆位点．而质粒DNA 的分离提取是分子生物学实验中最基本的工作．现在已经建立了多种提取纯化质粒DNA 的方法[1]，这些方法都包括3个步骤：培养细菌，收集和裂解细菌，纯化质粒DNA ．由于质粒的大小不同，收集质粒的方法应有所区别，大于15 kb 的质粒要用温和的方法．小于15 kb 的质粒可以用较剧烈的方法，有些大肠杆菌例如：HB101不能用加热的方法裂解．分离纯化质粒的方法各有利弊，根据不同的实验要求对所提纯质粒的纯度也有所不同，通常提出的质粒都存在一定量的RNA 和菌体染色体DNA 的污染[2]．纯化质粒DNA 最经典的方法是氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法[3]，溴化乙锭可以插入DNA 碱基之间，溴化乙锭与线状DNA 和闭环DNA 结合有差别，在饱和溴化乙锭的氯化铯梯度溶液中线状DNA 的浮密度为1.54 g/cm 3，闭环DNA 的浮密度为1.59 g/cm 3，所以离心的结果是线状DNA 和闭环DNA 会停留在离心管的不同区域，从而将闭环DNA 分离纯化出来．氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心具体还可以分为连续梯度和不连续梯度．区别在于氯化铯溶液浓度在离心管中是否连续，如果是一个连续的浓度梯度，例如加入10 mg/mL 溴化乙锭的终浓度1.55 g/mL 的氯化铯溶液，经过超高速离心后会与DNA 、RNA 等形成一个连续的浓度梯度，闭环DNA 会悬浮于某一层，从而可以收集纯化．不连续梯度是将3个不同浓度的氯化铯溶液逐一加至离心瓶中形成3种不同浓度氯化铯，这3种浓度的氯化铯并不混合，而是形成独立的三层进行离心．我们采用连续浓度梯度的方法对质粒DNA 进行分离，最终优化出了一套纯化方法，用氯化铯溴化乙锭连续密度梯度法可以得到理想的DNA ，用于后续的实验．1 仪器与方法1.1 仪器日立超速离心机，型号CP100WX ，转头型号SRP83VT ．1.2 方法1) 配制试剂：溶液I(50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L pH 8.0 Tris-Cl ，10 mmol/L pH 8.0 EDTA)，溶液Ⅱ(0.2 mol/L NaOH, 1 g/L SDS)，溶液Ⅲ(294 g/L 醋酸钾, 115 mL/L 冰醋酸)，EB 溶液(10 mg/mL)，10 × SSC(1.5 mol/L NaCl, 0.15 mol/L 柠檬酸钠)．2) 接菌到试管中，摇到混浊后扩培到1 L 2×YT 培养基中，37 ℃ 摇培过夜；3) 收集菌体，离心条件： 4 000 r/min ，4 ℃，20 min ，弃上清．加入25 mL 溶液Ⅰ，振荡重悬菌体；4) 加入50 mL 溶液Ⅱ并缓慢颠倒，冰上放置2 min ；5) 加入40 mL 溶液Ⅲ颠倒混匀，冰上放置5 ~ 10 min ；50 衡水学院学报投稿平台:/ 第16卷6) 离心：4 000 r/min，25 ℃，20 min．(可用玻璃棒轻轻打碎大块的沉淀，以获得更好的离心效果)．离心后将上清用折叠成漏斗状的miracloth(Millipore公司生产)过滤到新的250 mL离心瓶中(过滤白色不溶物，减少蛋白和基因组DNA污染)，加入等体积的异丙醇，在室温条件下沉淀15 min，静置后可以见到絮状沉淀；7) 离心：12 000 r/min，4 ℃，10 min，弃去上清，沉淀用75 %乙醇洗2次，每次洗后均需离心3 ~ 5 min，离心后弃去上清；8) 尽量吸干净上清，晾干沉淀，加入4 mL超纯水溶解，(可以用吹风机热风吹5 s即可)，加纯水后，若不易溶，可在37 ℃条件下促溶，由于质粒浓度大，溶解后比较粘稠有拉丝现象；9) 将4 mL质粒溶液转移到15 mL离心管中，加入5.05 g氯化铯颠倒混匀，并使其充分溶解(氯化铯溶解过程中会吸热，溶液会变凉，溶解后会产生絮状物浮在液面，溶液为乳白色)；10) 加入100 µL 100 mg/mL溴化乙锭(EB)溶液，混匀后离心：3 000 r/min，25 ℃，10 min，(液面上会有不溶物出现)；11) 将上清转移到超速离心管中，(不建议使用移液器转移，因为会有很多气泡出现．可以改用注射器吸取并将上清转移)．离心：65 000 r/min，25 ℃，16 h；12) 离心结束后，离心管中会出现3个明显的红色条带，最上一层为蛋白质，中间一层为缺口环状和线状DNA，最下一层条带为我们的目的条带闭环质粒DNA，将质粒约2 ~ 3 mL吸到15 mL离心管中(吸前先将超速离心管的顶部扎一小孔进气，方便后续吸取质粒层)．然后加入10 × SSC平衡好的异戊醇，混匀，静置分层后将上层吸出弃去以便抽提溴化乙锭．13) 重复上一步骤直到质粒溶液透明无色，将上层的异丙醇去除干净；14) 将250 µL质粒溶液吸到2 mL离心管中，加4倍体积70 %乙醇，混匀后室温沉淀20 min；15) 离心：1 200 r/min，25 ℃，10 min，弃上清，70 %乙醇洗涤沉淀；16) 离心后将上清吸干，晾干沉淀，每管加入200 µL超纯水溶解．2 结果与分析由图1和图2可以看出，用氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法提取的质粒DNA纯度明显高于普通的质粒小量抽提试剂盒所提取的质粒DNA，通过超微量紫外可见分光光度计测得质粒DNA质量浓度分别为500 ng/µL 和100 ng/µL．图1电泳图所示氯化铯密度梯度离心获得的琼脂糖凝胶电泳亮度明显高于普通的质粒小量提取试剂盒得到的质粒的琼脂糖凝胶电泳．对于后续实验，我们对拟南芥原生质体进行双分子荧光互补实验，图2所示用密度梯度离心法提取的质粒DNA可以达到60 % ~ 70 %的转化率，而普通的质粒小量抽提试剂盒用于拟南芥转化最好只有10 %的转化效率．A BA：密度梯度离心得到质粒DNA电泳图B：普通质粒抽提试剂盒得到质粒DNA电泳图图1 质粒电泳检测图1A为用氯化铯密度梯度离心获得的不同构建的质粒的琼脂糖凝胶电泳．图1B为用普通的质粒小量提取试剂盒得到的质粒的琼脂糖凝胶电泳．图1A一个融合YFP的基因，通过氯化铯密度梯度离心获得的高纯度的质粒，用于拟南芥原生质体的转化，转化效率约为60 % ~ 70 %，效率较高．图1B为用普通的质粒小量提取试剂盒得到的质粒用于拟南芥原生质体转化，转化效率仅为10 %左右．第4期 高英杰，等 优化的密度梯度离心法提取质粒DNA 51A ：激光共聚焦下观察高纯度的质粒用于拟南芥原生质体的转化B ：普通的质粒用于拟南芥原生质体的转化图2 质粒质量鉴定-原生质体转化3 讨论影响氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法提取质粒DNA 因素及应注意的事项如下：1) 实验过程中用到氯化铯及溴化乙锭均为有毒试剂，必须戴手套，减少与皮肤直接接触．2) 离心的次数较多，还需用到超速离心，一定要在专业人员培训后方可操作，以免发生事故．3) 离心结束后，吸取质粒DNA 时一定要注意，吸前先将超速离心管的顶部扎一小孔进气，方便后续吸取质粒层．4) 对质粒DNA 要及时进行抽提，过夜或长时间放置都会导致EB 不容易抽提出来．5) 异丙醇有刺激性气味，进行异丙醇去处操作时最好在通风橱中进行．参考文献：[1] 李亮,蔡志强,赵希岳.细菌质粒DNA 的快速提取及检测[J].江苏工业学院学报,2003,15(3):30-31.[2] 黄南,程熠,连欢,等.改进溶液II 配方可提高质粒DNA 提取的质量及得率[J].华中科技大学学报:医学版,2008,37(6):816-818.[3] J ·萨姆布鲁克, D ·W ·拉塞尔.分子克隆实验指南:上[M].黄培堂,译.北京:科学出版社,2002:53-58.Optimize the Extraction of Plasmid DNA with Method of Density GradientCentrifugationGAO Ying-jie, ZHAO Hong-tao(College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang, Hebei 050024, China)Abstract: Plasmid is often used as gene carrier. Method of purifying plasmid DNA can be divided into three types: the alkaline lysis method, boiling lysis and SDS alkaline lysis method. These methods can be used to purify covalently closed circular plasmid DNA, and the classical method of obtaining high-purity closed circular plasmid DNA is cesium chloride - ethidium bromide density gradient centrifugation. Through practice and optimization, we can reduce the pollution of protein and genomic DNA in plasmid and raise the purity and yield. The obtained plasmid is used for the conversion of arabidopsis thaliana protoplasts, and the conversion efficiency is as high as 60%-70%, which is significantly higher than that extracted with common plasmid extraction test kit.Key words: plasmid DNA; cesium chloride-ethidium bromide; density gradient centrifugation; arabidopsis thaliana protoplast; conversion efficiency(责任编校：李建明 英文校对：李玉玲)。
DNA提取过程中所用试剂的机理
DNA提取过程中所用试剂的机理1.溶菌酶的作用机制是溶菌酶是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基和芳香族氨，酸的比例较高，酶的活动中心是天冬氨酸和谷氨酸。
溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，称包胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它专一地作用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键，从而破坏细菌的细胞壁，使之松驰而失去对细胞的保护作用，最终使细菌溶解死亡。
也可以直接破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，而达到杀菌的作用，这主要是因为革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由胞壁质和磷酸质组成，其中胞壁质是由杂多糖和多肽组成的糖蛋白，这种多糖正是由N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键联结的。
对某些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶的破坏。
溶菌酶是母乳中能保护婴儿免遭病毒感染的一种有效成分，它能通过消化道而保持其活性状态，溶菌酶还可以使婴儿肠道中大肠杆菌减少，促进双歧杆菌的增加，还可以促进蛋白质的消化吸收。
简言之,破坏细菌细胞壁，由于细菌在没有细胞壁时不能生存，从而杀死细菌。
2. 十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）常用于DNA提取过程中使蛋白质变性后与DNA分开。
SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用：a. 溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂；b. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；c. 对RNase、Dnase有一定的抑制作用；d. SDS能够与蛋白质结合形成R1-O-SO3-…R2+-蛋白质复合物，使蛋白质变性沉淀。
质粒提取常见问题1．溶液I—溶菌液：a.溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。
当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。
b.葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
C. EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
质粒DNA的提取
Hale Waihona Puke 理论基础细菌质粒是一类双链闭环的小分子DNA，独 立于细菌染色体之外，能够进行自我复制。 质粒作为载体广泛应用于目的基因的克隆、 测序、表达等工作。
宿主染色体DNA与质粒DNA主要区别：
宿主染色体DNA
质粒DNA
一、质 粒 概 述
❖ 基因工程载体分类： 质粒载体 噬菌体载体（容量大） 病毒载体（导入效率高、低毒）
❖ 概念： 质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的、具有自 主复制能力的环状双链DNA分子。
实验目的
掌握质粒抽提的目的 了解质粒抽提原理 熟悉质粒抽提方法
一、实验原理
理论基础： 宿主染色体DNA与质粒DNA的区别
附层析分离质粒。
三、质粒抽提操作步骤
1. 取 1-5 ml 过夜培养的菌液，加入离心管中，9000 rpm ，30s，尽量吸除 上清。
2. 向留有菌体沉淀的离心管中加入 250 μl 溶液 P1。使用移液器或涡旋振 荡器彻底悬浮细菌沉淀。
3. 向离心管中加入 250 μl 溶液 P2，温和地上下翻转 6－8 次使菌体充分裂 解。
分子大小 抽提结果
分子大 断裂成为线状
分子小 共价闭合环状结构
实验操作原理
分离质粒DNA包括3个基本步骤：
⑴ 培养细菌
在含有相应抗性的液体培养基中培养已转染 质粒的细菌，使细菌快速增殖的同时质粒 DNA得到大量扩增。目前常用的质粒均具 有很高的拷贝数。
37oC
振荡过夜
⑵ 裂解细菌以及质粒的初步分离
（3）获取高纯度质粒DNA的方法
密度梯度离心 CsCl密度梯度离心是最经典的方法，可获得高纯度 质粒DNA，但繁琐费时。
质粒DNA的提取（3）——密度梯度离心法提取质粒DNA
质粒DNA的提取（3）——密度梯度离⼼法提取质粒DNA
质粒DNA⼀般仅占细胞总DNA的1%-2%，⽽且其化学结构与寄主染⾊体DNA之间并没有太⼤差别，所以质粒DNA的纯化须从两者⾼级结构上的差异寻找依据。
在细菌细胞内，共价闭合质粒以超螺旋(即cccDNA分⼦)形式存在，如图4-3所⽰。
在细胞裂解及DNA分离的过程中，如果质粒DNA两条链中有⼀条发⽣⼀处或多处断裂，分⼦就能旋转⽽消除链的张⼒，形成松弛型环状分⼦，称开环DNA (ocDNA)。
如果质粒DNA的两条链在同⼀处断裂，则形成线状DNA (linear DNA. L-DNA)。
当提取的质粒DNA电泳分离时⼀，同⼀质粒DNA其超螺旋构象的泳动速度⽐开环和线状构象分⼦要快。
将含有EtBr(溴化⼄锭)的CsCI溶液加到⼤肠杆菌裂解液中，EtBr分⼦便会通过嵌⼊作⽤⽽结合到DNA链上，导致双螺旋结构发⽣解旋反应。
⼤肠杆菌染⾊体DNA⽚段具有游离的末端⽽易于解旋，从⽽会结合⼤量的EtBr分⼦。
共价闭合环状的DNA分⼦质粒，只能发⽣有限的解旋反应，限制了EtBr分⼦的结合数量，染⾊体DNA⽚段⽐质粒DNA结合更多的EtBr分⼦。
在DNA-EtBr复合物中，结合的EtBr分⼦数量越多，其密度也就越低。
因此，在EtBr达到饱和浓度的条件下，质粒DNA就要⽐线性的染⾊体DNA⽚段具有更⾼的密度。
通过氯化艳密度梯度离⼼之后，它们就会被平衡在不同的位置，从⽽达到纯化质粒DNA的⽬的。
CsCl超速离心法纯化质粒
加入3V H2O，转至50ml离心管中，加入2.5-3V无水乙醇（约30ml），12000rpm X 15min；
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70%乙醇洗涤沉淀，超净台中晾干残液，以3-5ml TE溶解沉淀，分装至1.5/0.6ml tube中备用。最终可得2-5mg质粒（1mg/ml），OD260/OD280=1.8。
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超高速离心（20℃），Ti，垂直转头，65000rpm X 4h；
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在离心管颈部插入一个针头通气，沿质粒环带下沿水平插入注射器，针孔向上，抽出质粒环带，移至15ml离心管中；
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加入2-5V水饱和的正丁醇或异戊醇（水层之上），混匀，2000rpm X 1min，弃上层。重复3-4次，至粉红色完全消失；
去除上清，沉淀以4ml TE溶解，转移至15ml离心管中；
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加入5g CsCl（1.06g/ml），200ulEB（10mg/ml贮存液），颠倒混匀至CsCl完全溶解；
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用注射器转移至5ml超高速离心管中（切勿使液体流至管外），配平，以封口膜封口，避光保存于4℃；
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潘卫（65841）封管。机器预热数分钟，将金属盖置于离心管上，hot button下使瓶口软化，cold button下使管口封闭定型。去掉盖子；
CsCl高速离心法纯化质粒
摇菌500ml，7000rpm X 8min收集菌体；
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Solution I, II, III (10ml, 20ml, 15ml)处理, 7000rpm X 15min；
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纱布过滤上清至新的离心管中，加30ml异丙醇，室温放置10min，7000rpm X 15min；
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DNA提取过程中所用试剂的机理
1.溶菌酶的作用机制是溶菌酶是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基和芳香族氨，酸的比例较高，酶的活动中心是天冬氨酸和谷氨酸。
溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，称包胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它专一地作用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键，从而破坏细菌的细胞壁，使之松驰而失去对细胞的保护作用，最终使细菌溶解死亡。
也可以直接破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，而达到杀菌的作用，这主要是因为革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由胞壁质和磷酸质组成，其中胞壁质是由杂多糖和多肽组成的糖蛋白，这种多糖正是由N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键联结的。
对某些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶的破坏。
溶菌酶是母乳中能保护婴儿免遭病毒感染的一种有效成分，它能通过消化道而保持其活性状态，溶菌酶还可以使婴儿肠道中大肠杆菌减少，促进双歧杆菌的增加，还可以促进蛋白质的消化吸收。
简言之,破坏细菌细胞壁，由于细菌在没有细胞壁时不能生存，从而杀死细菌。
2. 十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）常用于DNA提取过程中使蛋白质变性后与DNA分开。
SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用：a. 溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂；b. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；c. 对RNase、Dnase有一定的抑制作用；d. SDS能够与蛋白质结合形成R1-O-SO3-…R2+-蛋白质复合物，使蛋白质变性沉淀。
质粒提取常见问题1．溶液I—溶菌液：a.溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。
当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。
b.葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
C. EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
DNA提取纯化
提取噬菌体DNA
– 噬菌体的培养、收集、纯化 – 纯化M13 DNA
1.制备总DNA
基本步骤： 1) 培养、收集细菌 细胞 2)打碎细胞，释 放内容物 3)去掉DNA以外 的成分 4)DNA溶液的浓缩
1.1培养、搜集细菌细胞
两种类型的细菌培养基的成分： M9培养基(确定成分培养基)：g/L Na2HPO4(6.0) KH2PO4(3.0) NaCl(0.5) NH4Cl(1.0) MgSO4(0.5) 葡萄糖(2.0) CaCl2(0.015) LB培养基(不确定成分培养基) ：g/L typtone(10) 提供氨基酸以及肽段 Yeast extract(5) 提供氮源、糖类、有机和无机营养 NaCl(10)
3 噬菌体DNA的制备
3.3 从λ噬菌体中纯化DNA
PEG沉淀物中可能含有少量的细菌裂 解物，也可能含有细菌DNA。这些组 成部分可以通过梯度离心去掉。除去 CsCl后可以获得纯净的λ噬菌体。然 后通过酚抽提或者蛋白酶处理蛋白质 外壳。
Purification
of λ phage
Purification of λ phage particles by CsCl density gradient centrifugation.
1.3 DNA的纯化
去掉DNA以外的成分 蛋白酶K/苯酚——蛋白质 RNA酶——RNA
◆ Purification of DNA from a cell extract
Removal of protein contaminants by phenol extraction.
1.4 DNA的浓缩以及浓度、纯度的测定
Lysogenic λ phage
At 30 ℃, cl gene protein works, Keep lysogeny: At 42 ℃, cl gene protein does not work, produce extracellular phage.
大肠杆菌中质粒DNA大量提取条件的优化
大肠杆菌中质粒DNA大量提取条件的优化质粒是细胞中的一种环状DNA分子，其具有独自复制的能力，并且可以携带一些特定的基因信息。
近年来，质粒的应用已经广泛应用于基因操作、基因工程、生物医学等方面，因此对于大肠杆菌中质粒DNA的提取技术进行优化非常重要。
大肠杆菌中质粒DNA的提取方法主要包括两步骤：密度梯度离心和琼脂糖凝胶电泳。
（1）密度梯度离心密度梯度离心是指将菌体裂解后，通过高速离心把不同密度的物质分离开来。
利用该方法可以将质粒DNA从细胞膜和其他细胞组分中分离出来。
具体方法：①取适量大肠杆菌，用PBS洗涤2次。
②将菌体定量后，用TE振荡器将菌体超声打碎。
③将裂解后的样品在低温下进行超高速离心，离心时间及转速依实验需要而定。
④观察离心后样品的沉淀情况，取得质粒DNA的上清液即可。
（2）琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是根据DNA分子的迁移率将不同长度的DNA分子分离开来的方法。
利用该方法可以进一步提纯质粒DNA，并对其进行定量和质检。
②将上清液中的DNA样品加到琼脂糖凝胶中，进行平衡电泳30分钟后，进行垂直电泳4个小时后停止。
③在电泳结束后，用紫外分光光度计检测琼脂糖凝胶中DNA的质量和浓度。
对大肠杆菌中质粒DNA提取条件进行优化，可以提高质粒DNA的提取量和质量。
下面将介绍几个影响提取效果的主要因素以及针对性的优化方法。
（1）菌株：选择合适的大肠杆菌菌株很重要。
优化方法：常用的大肠杆菌菌株有DH5α、BL21、TOP10等，各个菌株的耐受性、复制效率等特征不同，应选择适合的菌株。
（2）液培条件：菌体的培养条件对质粒DNA的提取有很大的影响。
优化方法：培养选用Rich或LB培养基，避免使用了胶原制剂、鸟氨酸、噻唑等抑菌剂。
最好在菌落生长一夜后进行液体培养，以保证菌体增殖到对数期或者平台期。
（3）超声打碎条件：超声打碎可以有效地提高质粒DNA的提取效率和质量。
优化方法：注意超声程序设置合适的打碎强度、打碎时间和打碎间歇，避免样品过热造成DNA降解。
基因工程复习笔记
基因工程复习笔记第一章一、电泳电泳(eletrophorosis) :带电荷的分子在电场中以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动.移动速度称为电泳迁移率。
影响因素：1 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。
2. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。
3当电场强度一定,电泳介质相同,电荷相同的分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状(构型)。
4分子形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。
指示剂：溴酚蓝（Bb）：常用指示剂。
分子量670，分子筛效应小，近似于自由电泳，呈蓝紫色。
二甲苯青(Xc)：分子量554.6，呈蓝色，迁移速度比Bb慢。
染料：溴化乙锭（EB）1、聚丙烯酰胺凝胶电泳优点：比琼脂糖凝胶的分辨率高的多；回收DNA样品纯度高，无色透明，韧性好，银染的凝胶干燥后可长期保存；能装载的DNA量大，达每孔10μgDNA。
2 、SDS-PAGE 原理：SDS是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上相同密度负电荷。
SDS与蛋白质结合使蛋白质构象改变，成为形状近似雪茄状的长椭圆棒，SDS-蛋白质复合物短轴相同，而长轴与蛋白质的分子量成正比。
蛋白质-SDS复合物电泳的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒的长度，即蛋白质分子量有关。
二、PCR技术定义：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，以DNA为模板，在引物、dNTPs、Taq酶的作用下，经变性－退货－延伸反复循环，使某个基因在体外特异性地扩增。
PCR法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过PCR 扩增而获得定点突变的基因或DNA片段。
影响因素：（1）Taq DNA聚合酶（具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但没有3’→5’外切酶活性因此不能修复错误的碱基配对）。
（2）引物（primer）一般引物设计为长15—30bp；位置与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（5‘端相同）的短DNA；引物的碱基组成：尽可能提高G+C含量，避免连续相同碱基排列或内部回文序列，避免形成引物二聚体。
小量、中量、大量提取质粒DNA
大量提取质粒 DNA
1. 准备以下材料： 2 L 锥型瓶（灭菌处理） ，15 ml 及 50 ml 离心管（无菌包装） ，12＃针头、1 ml 及 5 ml 注射器（无菌包装） 。超纯水清洗 800 ml 离心瓶及 50 ml 离心管（高 速离心机配套管） ， 烘干。 溶液配制： 25％sucrose in 50 mM Tris-HCl （pH 8.0） ， lysozyme(10 mg/ml), 0.5M EDTA（pH7.6）, RNase A(10 mg/ml), Triton-lysis, 30% PEG8000, 1× TE（pH8.0）, EB(10 mg/ml), 水饱和正丁醇。 2. 从培养好的平板上挑取单克隆菌落接种到盛有 800 ml LB 培养液的烧瓶中， 置于 37 ℃摇床 （180 rpm） 培养 18 h。 将菌液倒入 800 ml 离心瓶中， 4200 rpm （Beckman J6-MI 离心机）离心 13 min。 3. 4. 5. 6. 弃上清，以 12 ml 25％ sucrose （in 50 mM Tris-HCl，pH8.0）重悬。 加入 3 ml 新配制的 lysozyme(10 mg/ml)，混匀，室温静置 10 min。 加入 2 ml 0.5 M EDTA（pH7.6） ，混匀。 加入 100 μ l RNase A(10 mg/ml)，混匀。
加超纯水调 pH 至 7.5，定容至 500 ml，湿热灭菌，加 500 ml 无水乙醇。 10. 25％ 蔗糖: 蔗糖 1 M Tris-HCl(pH 8.0) 25 g 5 ml
加超纯水定容至 100 ml，置于 4 ℃保存。 11. 0.5 M EDTA: EDTANa2H2O NaOH 186.1 g 约 20 g
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大量提取质粒DNA（CsCl密度梯度离心法）
李渊越
1.预约摇床、超速离心机。
2.配TB培养基（1L锥形瓶中装250 ml培养液），并灭菌。
质粒做好转化，并涂板。
、。
17.超离后，取样品，用5 ml注射器加上12#针头，抽取EB带，（离心完可见两条EB带，上面一条细浅
的带为断裂的质粒DNA,应抽取下面一条粗浓的EB带）放入50ml管中。
18.以灭菌水饱和正丁醇溶液萃取EB，直到溶液澄清无色。
19.加入等体积TE（一定要加。
若不加，在无水乙醇沉淀时，会沉淀下部分CsCl）。
20.加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀（如果不充分混匀，可能会导致离下的DNA是透明的，容易随
上清一起倒掉）。
6,000rpm，20min，（注意方向）去上清（注意沉淀不会贴壁，不要倒掉）。
21.加入450 µl (~900ul)水，把50mL离心管平放（注意方向），溶解，直到溶解完全（约需室温过夜）。
22.用枪小心将液体吸入1.5mL离心管中（如>450ul，可分成两管），加入十分之一体积的3 M NaAc (pH
5.2)，再加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，置于4C或-20C 15-30min。
13,000 rpm 离心10min。
23.用1mL 70%预冷的乙醇洗沉淀一次，13,000rpm 离心10min。
24.去上清，以1mL TE溶解完全，测定浓度。
lysozyme-EDTA-RNase溶液
溶菌酶0.4 g
0.5M EDTA (pH=8.0) 25mL
RNase A (100mg/mL) 120uL
H2O 25mL
25％蔗糖:
蔗糖25 g
1 M Tris-HCl（pH 8.0） 5 ml
过滤，加纯水定容至100 ml，置于4 ℃保存。
0.5 M EDTA（pH 8.0）:
EDTA·Na·2H2O 186.1
g
NaOH 约20 g
加800 ml纯水溶解完全后，调pH至8.0，定容至1 L，湿热灭菌，常温保存。
Triton-lysis:
10% Triton-100 5mL
1 M Tris-HCl（pH 8.0） 15 mL
H2O 100mL
湿热灭菌，常温保存。
PEG8000：
PEG8000 150 g
5 M NaCl 150 ml
加纯水定容至500 ml，湿热灭菌，常温保存。
EB（2mg/ml）：
EB 20mg
加超纯水10ml，溶解，室温保存。