第二章 色谱法拆分DL-氨基酸

第二章　色谱法拆分Ｄ／Ｌ－氨基酸

2.1 氨基酸手性拆分概述

早在二十世纪初食品添加剂

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重现性最低检测限等参数值还需要和生物样品中dopa的回收方法有效的衔接考虑到样品量大

光不稳定性化合物)和经济实用等因素

因为D-NNA的体内手性转化现象得到了证实

且相关的CEC手性分析方法也较为成熟[36]±¾Ñо¿ÔÚ¿¼²ì

¶à°Íת°±Ã¸µÄÒÖÖƼÁ¿¨±È¶à°ÍµÄµ×ÎïÑ¡ÔñÐÔʱ

¾ßÌåÊÇÒò´Ë2.2手性配体交换法概述

手性配体交换法(ligand-exchange

´ÓÄÇÒÔºó³ÉΪ·ÖÀëÊÖÐÔ°±»ùËáµÄÓÐÁ¦¹¤¾ß

ËûÓÃ×é°±Ëá-Cu2+以及阿斯巴甜-Cu2+成功的实现了多种丹酰化氨基酸的手性分离[42]

Ëüͨ³£Ö¸Á½À໯ºÏÎï

-环糊精比如L-Pro°¢Ë¾°ÍÌðÇ°Ò»ÀàµÄÖ÷Òª½á¹¹ÊÇÓÉ6-8个呋喃糖通过

因为每个呋喃糖上都有5个手性碳原子

可以和氨基酸的对映异构体进行手性识别从而使对应异构体被拆分不过两者的具体分离机制还是不同的它主要是通过在流动相中添加L-氨基酸和螯合剂比如Cu2+等金属离子

D/L氨基酸衍生物)与之形成螯合化的非对应异构体物

这对形成的非对应异构体因为存在疏水性的差异保留时间)就不同

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动态的解离-螯合过程中实现了氨基酸手性异构体的分离[42, 43]ÊÖÐÔÅäÌå

½»»»·¨µÄ·ÖÀëÔ-ÀíÕýÊÇ»ùÓÚÕâ¶Ô·Ç¶ÔÓ¦Òì

¹¹ÌåµÄÊèË®ÐÔ²îÒì

ÔÚÊÖÐÔÒì¹¹ÌåµÄ²ð·ÖÉϾݲé

¶ÔD/L-Ala D/L-甲硫氨酸实现了手性对照

对D/L-Ser此外

事实上也可以广泛的应用于基于毛细管电泳的分析方法ＬＥ－ＭＥＫＣ

比如手性选择性差异不显著

有了更多的解决途径使用LE-MEKC

p D/L-酪氨酸和o p 氟-D/L-Phe 可以同时对o

共12种单体实现同时分离[45]

³ýÁËÒÇÆ÷Ó²¼þÌõ¼þÒÔ´ïµ½ÀíÏëµÄ·ÖÀëЧ¹û

½ðÊôÀë×ÓÁ÷¶¯ÏàpH值流动相离子强度

1LE-LC 中的常用的金属离子有Cu2+, Ni2+, Co2+等

在色谱柱中有效分离其它离子形成的络合物稳定性相对较差

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2Á÷¶¯Ï಻ͬµÄpH 值会改变金属离子的平衡状态

非极性氨基酸的分离度通常会随着pH 值的升高而升高由于过低的pH 值环境中

而使分离度下降

因而通常是实际情况中选用pH5.0~6.0 之间

洗脱的先后顺序也可能会发生改变

　有机改性剂甲醇

降低有机流动相中的有机溶剂会促进溶质和吸附剂之间的疏水作用

4Àë×ÓÇ¿¶È²»½ö»áÓ°ÏìÒì¹¹ÌåµÄ±£Áôʱ¼ä

5²»Í¬µÄÑ¡ÔñÌåÒòÓëÒì¹¹ÌåÐγÉÂçºÏÎïµÄÎȶ¨ÐÔ²»Í¬

½ÏΪ³£ÓõÄÓÐL-脯氨酸N,N-双甲基-L-苯丙氨酸

在众多基于手性配体交换的分析方法中手性固定相法(CSP)虽然灵敏但是手性柱价格昂贵生命周期短柱前衍生化方法虽然常以荧光检测器提高灵敏度也比CSP便宜操作步骤相对繁琐

不利于热不稳定性化合物的定量分析

结果的重现性更好它本身的优点是

适用范围广操作方便总之

因此

我课题中的dopa手性分离也采用LE-LC

ËüÒ²Óв»¿ÉºöÊÓµÄȱµã1mM-5mM Cu2+介入流动相

导致检测器的检测背景显著升高在分离某些极性的螯合化三重化合物的过程中有机改性

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剂比如甲醇然而

2.3　Ｌ／Ｄ－ｄｏｐａ的手性分离方法

关于D-dopa的动物药效学研究资料显示

而且药效较L-dopa有时滞D-dopa虽然是其药效的源头

而是以D-dopa为底物

我们推测这个物质可能就是由D-dopa转化生成的L-dopa

×îÖ±¹Û×îÎÞи¿É»÷µÄÊֶξÍÊÇ

Èκη½·¨Ñ§µÄ½¨Á¢ÄǾÍÊÇ·ÖÎö·½·¨ÒªÊʺÏÑо¿¶ÔÏóµÄÀí»¯ÐÔÖʽ«¶à°ÍµÄÀí»¯ÐÔÖÊÏêÊöÈçÏÂ

ÔÚ1mM盐酸溶液中的最佳吸收值在280nmË®ÖеÄÈܽâ¶ÈΪ1.5mg/ml ÂÈ·ÂÈÝÒ×±»¿ÕÆøÖеÄÑõÑõ»¯²¢ËæÖ®±äºÚ

其实在体内的代谢也是非常活跃的dopa主要被儿茶酚胺-O-甲基转移酶(COMT)代谢为3-O-甲基多巴

多巴胺进一步迅速的被单胺氧化酶氧化脱氨形成3DOPAC)

HVA)[48]×óÐýdopa的人体药代动力学数据显示脑脊液中的浓度则仅相当于

10-20%相应的

目前常用的分析方法是采用离子对色谱法原理在于被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后从而使流动相中各组分的分离因子改善通常是采用C18反相柱

在磷酸盐或柠檬酸缓冲体系中添加离子对试剂辛基磺

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酸钠乙腈采用电化学检测器进行分离分析[50, 51, 52, 53]±È³£¹æµÄ×ÏÍâ¼ì²âÆ÷ÖÁ

ÉÙÒª¸ß2-3个数量级该方法不仅可以对L-dopa 的体内代谢浓度进行检测４－二羟基苯乙酸(DOPAC)去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)

È»¶øÆä´Î

ʹÓ÷ÑÓðº¹óÑ°ÕÒеķ½·¨ÅäÖÃ×ÏÍâ¼ì²âÆ÷µÄLE-LC方法就是一个可以实现D/L-dopa 分离分析的方案采用LE-LC

ÒÔ3 mM Cu2+为络合金属离子添加到去离子水中

这两个非对映异构体螯合物在疏水性上的差

异即

从而实现手性分离

日本岛津LC-2010C高效液相仪

４．６ｍｍ上海通微分析技术有限公司)

2.3.2药物和主要试剂

L/D-dopa(Sigma乙腈(Fisher, 美国)

其余试剂均为国产优质纯

250 ~300 g

2.3.4大鼠肾匀浆制备

大鼠断头处死取双肾３置于冰预冷的100mM

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