网织红细胞计数
《临床检验基础》课件——第九讲：网织红细胞计数实验
不允许以血红 蛋白浓度来折 算红细胞数
充池要均匀， 不能有气泡混 入、溢出或不
满
请认真书写实 验报告
谢谢 大家
数板等
试剂
红细胞稀释液
改良牛鲍氏计数板
操作步骤
01
02
03
04
取中号试管1支 ，加红细胞稀 释液20ml。用清洁干燥微量吸管 取末梢血10μl ，擦去 管外余血后加至红细 胞稀释液底部，再轻 吸上层清洗吸管2-3次
立即混匀。
混匀后，用干净 微量吸管将红细 胞悬液充人计数 池，不得有空泡 或外溢，充池后 静置2-3 min后计
参考区间
男：
（4.09～5.74）×1012/L
女：
（3.68～5.13）×1012/L
新生儿：（5.2～6.4）×1012/L
注意事项
1
2
3
4
5
采血时不能 挤压过甚， 因此针刺深 度必须适
当。。
稀释液要过滤， 试管、计数板 均须清洁，以 免杂质、微粒 等被误认为红
细胞
参考范围数 值内，两次 红细胞计数 相差不得超
临床检验基础
第九讲 网织红细胞计数
目录
CONTENTS
实验原理 实验器材 实验试剂 操作步骤
计算 参考值 注意事项 思考题
实验原理
用等渗稀释液将血液按一定倍 数稀释，充人计数池后显微镜下 计数一定体积内红细胞数，换算 求出每升血液中红细胞的数量
试验器材、试剂
试验器材
显微镜、改良 Neubauer血细胞计
数。
高倍镜下依次计 数中央大方格内 四角和正中共5 个中方格内的红 细胞。对压线细 胞按"数上不数下 、数左不数右"的
10-网织红细胞计数
10-网织红细胞计数B D I S R e t i c-C O U N T（T h i a z o l e O r a n g e）Catalog No. 349204简介早期红细胞细胞核丢失后，胞浆内仍残留有细胞器（如核糖体、线粒体），这样的早期红细胞就是网织红细胞，它有别于不含细胞器的成熟红细胞。
这些细胞器富含核酸物质（RNA和DNA），而在成熟红细胞中不含有此种物质。
正常人（非贫血者）中，网织红细胞在骨髓中三天成熟，第四天出现在外周循环血中。
网织红细胞计数可以评估红细胞造血系统活性，但是如果网织红细胞的骨髓成熟时间缩短而循环血成熟时间延长，这种评估方法就会有误差。
这时，外周血相中一至三天的网织红细胞（“漂移”网织红细胞）也会被当做第四天网织红细胞而计算在内。
如遇此种情况，应当对“漂移”网织红细胞做修正（修正公式见流式细胞仪分析一节）。
BD公司生产的Retic-COUNT试剂主要成分为噻唑橙（TO），与丫啶橙（AO）的作用类似。
TO 与DNA碱基对以1:2的比例结合，分解常数、正电荷数和膜通透性与AO相近。
Retic-COUNT试剂既可与DNA结合，也可与RAN结合，形成的荧光-核酸复合物，吸收光谱为475nm，荧光发射光谱为530nm，因此，适合在安装了488nm激光的流式细胞仪上使用，如FACSCalibur，FACSort，FACScan等。
网织红细胞计数的传统方法是使用新亚甲基蓝染料，染色涂片后，光镜下计数。
但此方法费时，且由于只计数1000个细胞，因而存在固有的取样误差。
使用Retic-COUNT流式细胞术方法进行网织红细胞计数，与传统的新亚甲基蓝方法相比，存在很多优势。
使用流式细胞术，可以检测上万个细胞，具有很好的取样精确性。
由于使用的是细胞悬液，可以消除涂片时的分布误差。
同时，它还具有省时、操作简便等优点。
另外，由于可以使用配套的Retic-COUNT自动软件，不需要做阴性对照，还可以减少操作的变异性。
临检--网织红细胞计数(Ret)
网织红细胞计数（Ret）【定义】网织红细胞是晚幼红细胞脱核后到完全成熟红细胞间的过渡细胞，属于尚未完全成熟的红细胞，其胞质中残存嗜碱性物质核糖核酸（RNA），经活体染色后，嗜碱性物质凝聚成蓝黑色颗粒，颗粒与颗粒连缀成线，线连接成网，故而得名。
【分型】根据网织红细胞发育阶段分为4型，分别是：Ⅰ型（丝球型）：红细胞充满网状物，见于骨髓。
Ⅱ型（网型）：红细胞网状物结构松散，见于骨髓。
Ⅲ型（破网型）：红细胞网状物结构稀少，呈不规则枝点状排列，见于外周血。
Ⅳ型（点粒型）：红细胞内为分散的细颗粒、短丝状网状物，见于外周血。
【检测原理】1.普通光学显微镜法2.网织细胞计数仪法和血液分析仪法【操作方法】1.显微镜试管法操作（1）加染液：于试管中加入10g/L煌焦油蓝生理盐水溶液2滴，再加新鲜血2滴，立即混匀，置37℃下15～20min。
（2）制片：取1小滴制成薄血涂片，自然干燥。
（3）观察：在低倍镜下选择红细胞分布均匀的部位进行观察。
（4）计数：在油镜下计数至少1000个红细胞中网织红细胞数。
（5）计算：网织红细胞分数=（计数的网织红细胞数）/1O00，网织红细胞绝对值（×109/L）=红细胞数×1012/L×网织红细胞分数。
2.显微镜法注意事项（1）网织红细胞必须活体染色，WH0推荐使用新亚甲蓝染液，其染色力强且稳定。
煌焦油蓝染液操作简单、费用低廉，但易产生沉淀、工作效率不高、精度差。
染液与血液比例以1:1为宜，严重贫血时，可适量增加血量。
（2）为提高网织红细胞计数精度和速度，ICSH推荐使用Miller窥盘，方法是将Miller 窥盘置于目镜内，选择红细胞散在且分布均匀的部位（3）用小方格（A）计数红细胞，大方格（B）计数网织红细胞，按下式计算：（4）注意鉴别网织红细胞与HbH包涵体。
Ret为蓝绿色网状或点粒状物质，分布不均，HbH包涵体为蓝绿色圆形小体，均匀散布于整个红细胞内。
网织红细胞计数
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3．作为病情观察的指标
溶血性贫血及失血性贫血，治疗过程中 连续观察网织红细胞计数，可作为判断 病情变化的参考指标。 如治疗后网织红细胞逐渐降低，表示溶 血或出血已得到控制。 如网织红细胞持续不减低，甚至更增高， 表示病情未得以控制，甚至加重。
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四、红细胞沉降率测定
红细胞沉降率（ESR），简称血沉率 指红细胞在一定条件下沉降的速率。 正常情况下，红细胞在血浆中具有相对 的悬浮稳定性，沉降极其缓慢。 在病理情况下，血沉率可明显增快。
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临床意义
2．血细胞比容减低 见于各种贫血。 不同类型的贫血，红细胞体积大小不同， 故血细胞比容的减少与红细胞数量减少 并不—定成正比。 因此必须将红细胞数、血红蛋白量和血 细胞比容三者结合起来，计算红细胞各 项平均值才有参考意义。
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(二)红细胞平均值的计算
1．平均红细胞容积(MCV) 指每个红细胞的平均体积，以飞升（ fl ）为单 位。
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参考值
魏氏(Westergoen)法： 成年男性0~15mm/1小时末
成年女性0~20mm/1小时末
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临床意义
(一)生理性变化 12岁以下的儿童血沉略快。 妇女月经期血沉略增快，可能与子宫内膜破损 及出血有关。 妊娠3个月以后至分娩后3周血沉快，与生理性 贫血及纤维蛋白原含量增加等有关。 老年人血浆纤维蛋白原含量增加血沉加快。 高原地区居民红细胞增多，血沉低于平原地区。
网织红细胞计数操作规程
网织红细胞计数操作规程目的：本实验旨在规范网织红细胞计数的标准操作，以确保实验数据的准确性。
原理：网织红细胞是未完全成熟的红细胞，其包体较一般红细胞稍大，胞浆中尚有嗜碱性残留物质，可被煌焦油蓝等染成蓝色颗粒状、线状及网状结构物。
网织红细胞的数量可用百分率或每立方毫米血液中的绝对值数来表示。
材料：煌焦油蓝（灿烂甲酚蓝）、枸橼酸钠、生理盐水、香柏油、载物片（玻璃片）、推片（磨去边的玻璃片）、试管（2ml）、毛细吸管或枪头（200微升）、光学显微镜。
操作规程：染色液配制：将煌焦油蓝0.4g和3.5%枸橼酸钠20ml研磨溶解后加入生理盐水至100ml，过滤备用。
室温下可保存6个月。
血膜片制备：1.染色：取试管一支，用毛细管或枪头于其中加入染液2～5滴，然后再加入新鲜血液1滴轻摇混合，染色10～15min。
2.制片：取载物片一片，用毛细管或枪头吸取血液染色液1小滴于载物片上，并用推片约45度角推制成舌型血膜片，自然干燥备用。
3.观察：用显微镜观察，取血膜片滴入香柏油1滴，将血膜片置于显微镜载物台，用油镜观察网织红细胞。
4.计数：取计数器在油镜下检查计数红细胞，即计数红细胞中网织红细胞的数量，检查计数1000个红细胞中网织红细胞的数量，并得出千分率再除以10即为百分率。
计算公式：百分率=1000个红细胞中网织红细胞的数量/1000注意事项：1.载物片使用前必须经过酸或碱液浸泡脱脂处理后方可使用。
2.血膜片制备需要反复练推片，熟练推制血膜片的技巧。
3.血膜片的厚薄要适中，过厚或过薄均无法进行观察。
4.室温过低时，血液染色时间要适当延长，以确保细胞着色更充分。
5.血膜片需在3天内检查计数，否则其网状结构会褪色，不易观察清晰。
实验三网织红细胞计数血沉测定专家讲座
实验三网织红细胞计数血沉测定
第2页
▪ 器材 显微镜、试管、吸管、玻片、推片、 香柏油、擦镜纸、擦镜液
▪ 试剂 新亚甲蓝 ▪ 标本 新鲜全血
实验三网织红细胞计数血沉测定
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操作步骤
▪ 1.加染液 将Ret染液2滴加至小试管中，做好标识。
▪ 2.加血 在已加入染液小试管内注入新鲜全血2滴， 马上混匀。
实验三网织红细胞计数血沉测定
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注意事项
▪ 1.试剂准备 推荐使用新亚甲蓝染液, 试剂应定 时配制, 用前过滤。
▪ 2.染色 染液与血液比以1:1为宜,染色时间不能 过短。试剂用后及时盖好盖子, 以免挥发。
▪ 3.标本 应及时染色, 及时测定。 ▪ 4.计数 选择红细胞分布均匀, 网织红细胞着色
实验三网织红细胞计数血沉测定
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二、血液沉降率测定（魏氏法）
参考值 ＜50岁: 男性 < 15mm/h 女性 <20mm/h
＞50岁: 男性 < 20mm/h 女性 <30mm/h
实验三网织红细胞计数血沉测定
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注意事项
1.严格控制采血量，使抗凝剂与血液百分比为 1: 4。
2.血沉管应垂直放置，不得倾斜。
实验三网织红细胞计数血沉测定
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白细胞计数
一、目标
掌握显微镜白细胞计数方法。
二、原理
用白细胞稀释液将血液稀释
一定倍数, 同时破坏溶解红细胞。 将稀释血液冲入计数池后, 在显微 镜下计数一定体积内白细胞数, 经 换算求出每升血液中白细胞数。
实验三网织红细胞计数血沉测定
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三、器材
显微镜、改良计数板、血盖片、试管、微量 吸管、加样枪、乳胶吸头、纱布
10-网织红细胞计数
10-网织红细胞计数B D I S R et i c-C O U N T（Thi azol e O r ange）Catalog No. 349204简介早期红细胞细胞核丢失后，胞浆内仍残留有细胞器（如核糖体、线粒体），这样的早期红细胞就是网织红细胞，它有别于不含细胞器的成熟红细胞。
这些细胞器富含核酸物质（RNA和DNA），而在成熟红细胞中不含有此种物质。
正常人（非贫血者）中，网织红细胞在骨髓中三天成熟，第四天出现在外周循环血中。
网织红细胞计数可以评估红细胞造血系统活性，但是如果网织红细胞的骨髓成熟时间缩短而循环血成熟时间延长，这种评估方法就会有误差。
这时，外周血相中一至三天的网织红细胞（“漂移”网织红细胞）也会被当做第四天网织红细胞而计算在内。
如遇此种情况，应当对“漂移”网织红细胞做修正（修正公式见流式细胞仪分析一节）。
BD公司生产的Retic-COUNT试剂主要成分为噻唑橙（TO），与丫啶橙（AO）的作用类似。
TO 与DNA碱基对以1:2的比例结合，分解常数、正电荷数和膜通透性与AO相近。
Retic-COUNT试剂既可与DNA结合，也可与RAN结合，形成的荧光-核酸复合物，吸收光谱为475nm，荧光发射光谱为530nm，因此，适合在安装了488nm激光的流式细胞仪上使用，如FACSCalibur，FACSort，FACScan等。
网织红细胞计数的传统方法是使用新亚甲基蓝染料，染色涂片后，光镜下计数。
但此方法费时，且由于只计数1000个细胞，因而存在固有的取样误差。
使用Retic-COUNT流式细胞术方法进行网织红细胞计数，与传统的新亚甲基蓝方法相比，存在很多优势。
使用流式细胞术，可以检测上万个细胞，具有很好的取样精确性。
由于使用的是细胞悬液，可以消除涂片时的分布误差。
同时，它还具有省时、操作简便等优点。
另外，由于可以使用配套的Retic-COUNT自动软件，不需要做阴性对照，还可以减少操作的变异性。
(三)网织红细胞计数
（2）评价疗效
网织红细胞反应： 网织红细胞反应：IDA或巨幼细胞贫血分别 或巨幼细胞贫血分别 给予铁剂、维生素B 或叶酸治疗2~3d后，网织 给予铁剂、维生素 12或叶酸治疗 后 红细胞计数值开始上升， 达到最高(10% 红细胞计数值开始上升，7~10d达到最高 达到最高 左右)；两周以后逐渐降至正常水平，红细胞、 左右 ；两周以后逐渐降至正常水平，红细胞、 血红蛋白开始升高。 血红蛋白开始升高。 骨髓移植、 治疗后： 骨髓移植、EPO治疗后：若骨髓开始恢复造 治疗后 血功能， 升高， 血功能，RMI升高，网织红细胞计数值上升。 升高 网织红细胞计数值上升。
六、参考值
成人： 成人：0.005-0.015（0.5%-1.5%） （ ） 新生儿： 新生儿：0.02-0.06（2%-6%） （ ） 儿童： 儿童：0.005-0.075（0.5%-7.5%） （ ） 成人绝对值（ 成人绝对值（24-84） ×109/L ）
七、临床意义
（1）评价骨髓增生能力，判断贫血类型 ）评价骨髓增生能力， 再障时 明显降低。绝对值低于 × 再障时，明显降低。绝对值低于5×109/L可 可 做为急性再障的辅助诊断指标。 做为急性再障的辅助诊断指标。 失血、多数溶血性贫血患者网织红细胞可明 失血、多数溶血性贫血患者网织红细胞可明 溶血性贫血 显高于正常。 显高于正常。 营养不良性贫血在治疗前网织红细胞可保持 营养不良性贫血在治疗前网织红细胞可保持 正常、轻度升高或降低。 正常、轻度升高或降低。
（3）放、化疗监测 机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制， 机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制， 早期HFR和MFR降低，然后才检测到网织 降低， 早期 和 降低 红细胞的降低。而停止放、化疗， 红细胞的降低。而停止放、化疗，骨髓功 能恢复后，又见上述指标依次上升。 能恢复后，又见上述指标依次上升。可指 导临床医师适时调整治疗方案， 导临床医师适时调整治疗方案，避免造成 严重的骨髓抑制。 严重的骨髓抑制。
医学检验科新项目临床应用课件(网织红细胞计数(RET)等项目)
FT3
与TT3基本相同，但比TT3更为灵敏，且测定值不受TBG的影响；在亚临床甲亢患者，病人甲亢症状不明显， TT3可在正常范围，但FT3多已升高
FT4
与TT3基本相同，但比TT3更为灵敏，且测定值不受TBG的影响
TG-Ab
升高：慢性淋巴细胞性甲状腺炎、Graves病、甲减
anti-TPOAb 一种自身抗体，IgG型抗TPO抗体常见于桥本甲状腺炎，其水平与疾病活动期相关
6.孕产妇贫血的 诊断
当溶血性贫血溶血时大量网织红细胞进入血循环，Ret可达6%～8%，急性溶 血，可达约20%，甚至50%以上，绝对值超过100×10^9／L。急性失血后 ，5～10d网织红细胞达高峰，2周后恢复正常。
RET和IRF（ 未 成 熟 网 织 红 细 胞 ） ：血容量增加以满足胎儿生长的需要，势 必刺激骨髓造血功能的增强，因此网织红细胞明显增高，尤其是未成熟网织 红细胞增高。
医嘱：甲状旁腺激素 采样管:黄管
治疗骨质疏松
骨质疏松患者血清PTH水平异常升高，血清骨钙 素、25-羟基维生素D3水平异常降低，临床上， 可以将PTH作为骨质疏松诊断的主要参考指标。
甲状旁腺功能减退症
甲状旁腺功能减退症(HP)简称甲旁 减，是指PTH分泌过少或效应不足 引起的一组临床综合征。
甲状旁腺功能亢进
CT降低： 1. 甲状腺发育不全或甲状腺全切除者，血清降钙素水平降低。 2. 重度甲状腺功能亢进时，血清降钙素水平降低。 3. 妇女停经以后、低血钙、老年性骨质疏松等。
降钙素（CT）
降钙素 （CT）
与
降钙素原 （PCT）
一字之差，降钙素（CT）和降钙素原（PCT）意义大不同！
降钙素（CT）
CT
降钙素（CT）是人体内分 泌系统分泌的一种调节钙 磷代谢的激素，可以降低
一、网织红细胞(Ret)计数
优点：操作简单、快速，同时可获得多项血细胞参数。 缺点： ①不同的仪器使用的溶血素不同，形成不同的Hb 衍生物，某些溶血剂形成的衍生物稳定性差，故应严 格控制溶血剂的加入量及溶血时间。 ②有些溶血剂虽加入KCN,但衍生物并不是HiCN,而 是氰化血红蛋白仪器需经过校正后才能进行Hb测定。 ③ 低色素性贫血、某些肝病等，由于RBC具有抵 抗溶血剂的作用，导致RBC溶血不完全而影响Hb测定。
本试剂中含有少量KCN，废液必须无害化处理。
废液处理：用水按1:1稀释,再按每升液体加35ml次氯 酸钠，充分混匀，敞开容器口，过夜，使CN-氧化成N2 和CO2 ↑，或水解成CO32-和NH4+，然后倒入下水道。
【方法学评价】
1.氰化高铁血红蛋白（ HiCN ）法：
特点： ①WHO和ICSH推荐的标准方法，
5.Hb功能 运输O2和CO2,结合可逆。1分子Hb结合1分子O2 ，在标准 状况下，每克Hb能结合1.39 ml O2 。
。
血红蛋白测定
• 测定血液中各种血红蛋白的总浓度。 • 方法有多种
血红蛋白计法 氰化高铁血红蛋白法（HiCN） 十二烷基硫酸钠血红蛋白测定法（SLS-Hb） 其他方法
血红蛋白计法
【正常参考值】
成人男： 120～160 g/L 成人女: 110～150 g/L 新生儿: 170～200 g/L
【临床意义】
贫血诊断优于RBC. Hb<120 g/L, （女，110 ）轻度， Hb<90 g/L, 中度 Hb<60 g/L, 重度 Hb<30 g/L, 极重度
【质量控制】
1.技术误差：稀释倍数尽量准确，分光光度计波、比色杯 光径要经常校正，以减少技术误差。 2.HiCN转化液：应置棕色瓶中，不得使用塑料容器，以防 CN-丢失。 3. HiCN参考液：是制备标准曲线、计算K值、校正仪器及 其他测定方法的关键物质，ICSH公布严格的 规格和制备方法。国产标准品已有供应
网织红细胞计数
一、教学目的：熟练掌握网织红细胞计数的原理、方法、参考值及临床
意义
二、实验内容
1、网织红细胞计数
（1）原理：网织红细胞胞是介于晚幼红细胞与成熟红细胞之间的的过渡阶段细胞质 内残存的少量嗜碱性核糖体和核糖核酸在活体染色时可被煌焦油草蓝染成蓝色网状 或颗粒状，可与完全成熟红细胞区别。 （2）器材与试剂：采血用具、显微镜、10g/L煌焦油蓝生理盐水液、试管、玻片等 （3）操作方法： ①于小试管中加入10g/L煌焦油蓝生理盐水液2滴，再加入新鲜全血2滴，混匀，于 室温下染色15-20分钟 ②取1小滴混合液制成血涂片，待干。 ③低倍镜下选择红细胞分布均匀的部位，转至油镜下进行观察网织红细胞并计数 1000个红细胞中的网织红细胞数
网织红细胞分型及特征
分型
Ⅰ型 （丝球型）
Ⅱ型（网型）
形态特征
红细胞几乎被肉织红充满 位于外周血少见
Ⅲ型（破网型）
Ⅳ（点粒型）
网状结构少，呈不规刚点状
分散的细颗粒、短丝状
少量存在于外周血
主要存在于外周血中
④计算：网织红细胞数=计数网织红细胞数/1000 （4）结果报告： Ret:0.0** （5）注意事项 （6）参考值 成人：0.005-0.025 新生儿 0.02-0.06 绝对值（24－84）×109/L（红细胞数/L ×网织红细胞数) （7）临床意义 A：评价骨髓增生能力（判断贫血类型） 增高：表示骨髓造血功能旺盛。各种增贫可增多，尤于溶 贫显著。 减低：表示骨髓造血功能减退，常见于再障 B：观察疗效：网织红细胞反应（治疗后2－3天网织红开始上升，
7－10达最高峰（约0.10），2周后渐隆至正常水平）
网织红细胞计数及临床意义
网织红细胞计数及临床意义一、概述1、网织红细胞（reticulocyte，Ret，RET）是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间的过渡细胞略大于成熟红细胞(直径8.0～9.5μm)，其胞质中残存的嗜碱性物质RNA经碱性染料（如煌焦油蓝、新亚甲蓝等）活体染色后，形成蓝色或紫色的点粒状或丝网状沉淀物。
2、网织红细胞自骨髓释放到外周血液后仍具有合成血红蛋白的能力，约1～2天后，过渡为成熟红细胞ICSH将网织红细胞分为4型（网织红细胞分型及特征）。
二、检测方法与原理1、普通显微镜法：网织红细胞是尚未完全成熟的红细胞，其胞质内尚有嗜碱性的RNA物质，经新亚甲蓝或煌焦油蓝活体染色后呈浅蓝或深蓝色网状结构。
2、血液分析仪法：特殊染料与网织红细胞中RNA结合后进行RNA定量，可精确计数网织红细胞占红细胞的百分数(Ret%)，并可根据RNA含量将网织红细胞分类及计算网织红细胞其他参数。
（一）普通显微镜法1、染色液①新亚甲蓝枸橼酸氯化钠染色液：新亚甲蓝0.1g溶于100ml枸橼酸氯化钠溶液内(1体积30g/L枸橼酸钠溶液与4 体积9.0g/L氯化钠溶液混合)，充分混匀，待染料溶解后过滤。
②煌焦油蓝生理盐水染色液：煌焦油蓝1.0g、枸橼酸钠0.4g、氯化钠0.85g，溶于双蒸馏水100ml中，过滤后备用。
2、操作①在小试管中加入染色液2滴；再加人静脉血（或末梢血)2滴，混后放置37℃恒温水箱中。
②10分钟后取1滴混悬液制成涂片③在油镜下直接观察1000个红细胞中Ret数。
或以Miller 窥盘计数法计数：Miler窥盘为一个厚为1mm、直径为19mm 的圆形玻片，玻片上用微细刻线画出两个正方形格子，大方格B面积为小方格A的9倍。
置于目镜内，计数小方格内红细胞数(将小方格内数得红细胞数乘以9，折算成一个大方格内的红细胞数)和大方格内的Ret数。
（窥盘结构）3、结果计算①直接观察法：网织红细胞比例=计数1000个红细胞中的网织红细胞数/1000②窥盘计数法：网织红细胞比例=大方格内网织红细胞数/（小方格内红细胞数×9）③网织红细胞绝对数(个/L)=网织红细胞百分数x红细胞数/L④网织红细胞生成指数(RPI)：RPI=（网织红细胞百分数/2）×(患者血细胞比容/0.45)三、参考区间1、网织红细胞比例：成年人：0.005～0.015新生儿：0.03～0.06；儿童：0.005～0.0152、网织红细胞绝对数成年人：（24～84）×10%/L四、注意事项1、标本应在4小时内进行处理。
网织红细胞计数
３、临床意义
（3）放、化疗监测
机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制， 早期HFR和MFR降低，然后才检测到网织 红细胞的降低。而停止放、化疗，骨髓功 能恢复后，又见上述指标依次上升。
网织红生成指数
• （Reticulocyte production index,RPI） • 病人网织红细胞/d * 病人PCV/正常人
网织红细胞的形态特点和分型
Ret通常较成熟红细胞稍大，直径8.0～9.5微米。
HeiLmyer分型 （五型）
NCCLS和ICSH分型 （四型）
外周血 哪型多 HeiLmyer分型
点粒型
(二)染色原理
网织红细胞内RNA的磷酸基（带负电荷）能与 灿烂甲酚蓝、新亚甲蓝等碱性染料的有色反应基 团（带正电荷） 结合，形成核酸与碱性染料复合 物的多聚体，凝成颗粒，其颗粒又联缀成线，而 构成浅蓝或深蓝的网织状结构。
网织红细胞计数
主要内容
1、网织红细胞计数原理、参考值
2、RET计数临床意义 3、质量控制
教学重点与难点
重点： 网织红细胞计数概念、临床意义 难点： 1、显微镜下特点 2、临床意义
网织红细胞 （reticulocyte）计数
界于晚幼红细胞和成 熟红细胞之间的过渡 阶段细胞。因其胞质 中残存的核糖核酸经 碱性染料活体染色后， 呈现点状或线网状结 构，故名网织红细胞。
２、参考值
• 成人：0.005～0.015（0.5%～ 1.5%)
• 新生儿：0.03～0.06
• 绝对值：(24～84) ×109/L
３、临床意义
（1）评价骨髓增生能力，判断贫血类型
再障时，明显降低。绝对值低于15×109/L可 做为急性再障的辅助诊断指标。
实验三网织红细胞计数血沉测定优秀课件
▪ 4. 计数 用低倍镜依次计数四角4个大方格内的 白细胞数。
▪ 5. 计算 白细胞 /L=N/4×10×20×106=N/20×109/L
▪ 6. 报告方式 X.X×109/L。
▪ 试剂 新亚甲蓝 ▪ 标本 新鲜全血
操作步骤
▪ 1.加染液 将Ret染液2滴加至小试管中，做好标记。 ▪ 2.加血 在已加入染液的小试管内注入新鲜全血2滴，立
即混匀。
▪ 3.染色 室温下染色10-15min。 ▪ 4.涂片制备 取染色血1小滴推制成薄血涂片，自然干燥 ▪ 5.观察 低倍镜下选择红细胞分布均匀、着色好、背景
操作步骤
1.采血 采静脉血1.6ml加入含0.4ml 109mmol/L枸 橼酸钠溶液抗凝剂的采血管中（即采血量到采血管 2ml刻度线处） ，混匀。 2.吸血 混匀血吸入血沉管内至刻度“0”处，拭去 管外残余血。 3.立血沉管 将血沉管直立于血沉架上。 4.读数 1h末准确读取红细胞下沉后露出的血浆高 度。 5.报告方式 XX板、血盖片、试管、微量 吸管、加样枪、乳胶吸头、纱布
四、试剂
白细胞稀释液
五、标本
EDTA盐抗凝血
六、操作
▪ 1. 加稀释液 用加样枪吸取白细胞稀释液0.38ml 于小试管中。
▪ 2. 加血 用清洁干燥微量吸管吸取抗凝血20μl， 擦去管外余血，轻轻加至白细胞稀释液底部， 再轻吸上清液清洗吸管2～3次，混匀。
2h内完成。
▪ 5.红细胞沉降率在1h沉降过程中，并不是均衡等速 度的沉降，绝不可以只观察30min沉降率，将结果乘 以2作为1h血沉结果。
二、血液沉降率测定（自动血沉仪法）
一、网织红细胞(Ret)计数
血红蛋白结构图
血红蛋白特点
3. 亚铁血红素无种族特异性，由2价铁离子和原卟啉组成呈扁平型。 4. Hb状态 氧合Hb(HbO2 ）
--与O2结合，
还原Hb(Hbred）-脱氧 高铁Hb(Hi)-被氧化成。
碳氧Hb（HbCO）-与CO结合， 硫化Hb（SHb）-病理情况
Hb及衍生物因结构不同具有不同的吸收光谱。
费用低廉，国内目前使用的主要方法；但易产生沉淀。
四、操作 1. 取小试管一支，加染液和血液各2滴，混匀。 2. 置37℃水浴箱15min，取出后微振2min，推片。 3. 将Miller 窥盘放入目镜，选择合适部位计数，油镜下 Miller 窥盘的小格A内计数所有无核红细胞，大格B （含小格面积）内计数网织红细胞。或计数1000个红 细胞中的网织红细胞数。 五、计算 大格网织红细胞总数 1. Ret% = ×100 小格红细胞总数×9 B 2. 绝对值计算:RBC×Ret%（ × 109/L）
【临床意义】
（1） 评价骨髓造血功能： ① RET↑是红系造血功能活跃的反映。表示骨髓造血功能旺
盛，见于增生性贫血，以溶贫最为显著（6～8%，急性溶血 可达20%，严重者可达40～50%）；急性失血可明显↑ ；缺 铁和巨贫RET正常或轻度↑ 。
② RET↓表示骨髓造血功能减低，多见于再障，尤以急性再
染色后，使含有RNA的RBC被计数，自动计算出RET的%及绝对数。优点：
测量细胞多，避免主观因素、方法易于标准化。国外已广泛使用，国 内逐步推广使用。但成本高。
近年来，新型多参数血细胞分析仪具有Ret计数功能。
【质量控制】
1.抗凝血最好在4h内处理，保存在4º C，可延长至8h. 2.染色温度控制在37º C为宜，无论何种染液，室温（25º C） 以下染色时，RET检出率明显减低，故要求37º C恒温染 色。 3. 玻片法容易使血液中的水分蒸发，造成涂片困难，受染料沉 淀的干扰，故已少用。 4. 试管法为手工RET计数的首选方法，染液与血液的比例以 1:1为宜，严重贫血时可适当增加血液比例。 5. 推制血膜不宜太薄或太厚，否则会造成RET分布不均。 6. ICSH推荐使用Miller窥盘作Ret计数，其CV=10%±
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计数方法
1、普通光学显微镜法：活 体染色后推片镜检
2、网织细胞计数仪法：荧 光染色后用流式细胞术计数
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二、试剂器材
1、试剂 10g/L煌焦油蓝酒精（水）溶 液
2、器材 毛细血管采血用具、小试管、 载玻片、推片、显微镜、香柏油、二甲 苯及擦镜纸、Miller窥盘或直径约20 mm （较目镜内径稍小）的圆形硬纸片（正 中央开一边长为3mm的菱形或正方形小孔， 置目镜光阑处，用于缩视野法计数）
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网织红细胞（Ret）
是晚幼红细胞脱核后到成熟红细胞间 的过渡细胞，是尚未完全成熟的红细胞， 其胞浆内残存有嗜碱性的RNA物质。嗜碱 性物质与染料凝聚成蓝色颗粒，颗粒与颗 粒连缀成线，线连接成网，故而得名。 分型：丝球型、网型、破网型、点粒型。 （Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型）
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网织红细胞
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（2）评价疗效
网织红细胞反应：IDA或巨幼细胞贫血分别 给予铁剂、维生素B12或叶酸治疗2~3d后，网织 红细胞计数值开始上升，7~10d达到最高(10%左 右)；两周以后逐渐降至正常水平，红细胞、血 红蛋白开始升高。
骨髓移植、EPO治疗后：若骨髓开始恢复造 血功能，RMI升高，网织红细胞计数值上升。
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三、操作步骤
1. 染色：于载玻片的一端加煌焦油蓝酒精溶液1滴， 任其自然凉干后备用，取末梢血或抗凝血一滴，于 已干燥的染料上，用推片角混匀后，将两玻片盖合 （玻片法）；试管法取染液2滴入试管，加血2滴混 匀，封闭好，待15分钟以上时间，
2. 推片：取混合液1小滴于载玻片的一端，推制成薄 而均匀的血膜，
实验三 网织红细胞计数
一、实验原理
网织红细胞胞浆内残存有嗜碱性的 RNA物质，经煌焦油蓝或新亚甲蓝活体染色后 RNA中负电荷基团与带正电荷的有色基团结合， 凝聚成颗粒呈浅蓝或蓝黑色的点状、丝状或网 状结构，可在显微镜下识别。计数1000个红细 胞中所有的网织红细胞数直接报告其百分比， 或×红细胞计数结果报告其绝对值。
• RPI=病人网织红细胞（%）/2 * 病人HCT/正常
人HCT（男0.45，女0.40）
• 临床应用： • ＞3提示溶血性贫血或急性失血性贫血；
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八、思考题
一溶血性贫血患者，红细胞计数 2.6x1012/L，血细胞比容0.29，网织红细 胞计数相对值为35%，如何报告网织红细 胞检测结果？
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六、参考值
成人：0.005-0.015（0.5%-1.5%） 新生儿：0.02-0.06（2%-6%） 儿童：0.005-0.075（0.5%-7.5%） 成人绝对值（24-84） 109/L
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七、临床意义
（1）评价骨髓增生能力，判断贫血类型 再障时，明显降低。绝对值低于5×109/L可 做为急性再障的辅助诊断指标。 失血、多数溶血性贫血患者网织红细胞可明 显高于正常。 营养不良性贫血在治疗前网织红细胞可保持 正常、轻度升高或降低。
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（3）放、化疗监测 机体接受放、化疗后，如出现骨髓
抑制，早期HFR和MFR降低，然后才检测到 网织红细胞的降低。而停止放、化疗，骨髓 功能恢复后，又见上述指标依次上升。可指 导临床医师适时调整治疗方案，避免造成严 重的骨髓抑制。
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网织红生成指数（Reticulocyte production index,RPI）
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1.用五酒、精染注液意时，事应项待玻璃片上的酒精挥发干燥 后，才能加血液，染色时应用推片角不停搅动， 使染料和血液混合，防止凝固。 2.染色时间一定要充足，混合后不能立即推片，
室温低时染色时间应适当延长，应覆以另一玻 片防止蒸发。 3.染液与血液比例以1：1为宜，贫血适当加血量。 4.涂片厚薄均匀适宜，弓形移动，多个区域计数 5.试剂应定期重配，以免变质沉淀。 6.与变性珠蛋白小体鉴别
将Miller窥盘放在显 微镜目镜中,通过窥盘 中大小方格间的9比1 比例关系计算RBC数和 Ret数。
B1
3
A
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四、计算
ler 窥 盘 法 ： 网 织 红 细 胞 （ Retic） 百分率(%)= （大方格内Retic总数）/ （小方格内RBC总数×9）×100% 2. 直 接 计 数 法 ： 网 织 红 细 胞 （ Retic） 百分率(%)= 多个视野内Retic总数/多 个视野内RBC总数×100%
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3. 低倍镜浏览，选取红细胞分布均匀网织红细胞染 色较好的部分（体尾交界处），滴香柏油转换至油 镜，在Miller窥盘下计数小方格中的RBC数和大方 格中的网织红细胞数（或数出整个视野中的RBC总 数和其中的网织红细胞数，换一视野同法计数至几 个视野RBC总数>1000为止）。
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er窥盘