心血管实验病理学方法简介

H.E
Masson 三色染色
Elastica-van Gieson 染色
天狼星红染色
天狼星红染色
• 一种敏感的胶原显 示方法
• 利用胶原的折光特 性不同而区分不同 组分 I型胶原（黄红色） III型胶原（绿色） IV型胶原（无折光）
• 偏振光显微镜 线性偏振（暗背景） 环形偏振（亮背景）
PTAH
2.1 常规组织学技术
1. 固定与包埋类别 2. 冰冻切片要点 3. 常用染色方法
2.1.1 常用固定剂
• 交联性固定剂（甲醛、戊二醛，多聚甲醛） • 非交联性固定剂（酒精、甲醇、丙酮、锇酸）
• 单一固定剂（ 10% 福尔马林） • 复方固定剂（P-L-P 固定剂）
• 常规固定（一般形态） • 特殊固定剂（糖原、脂质、嗜铬固定） • 有利抗原保存固定（短时固定、PLP固定）
心血管实验病理学方法简介
主要内容
1. 实验病理学的特点 2. 常用病理学技术与方法 3. 模式动物的病理学评价
1.0 实验病理学的特点
1. 实验病理的多样性 2. 实验动物与人的差异 3. 病理学评价的特点
1.1 实验病理的多样性
• 疾病机制研究 • 治疗药物研究 • 植入器械研究
• 动物种属不一样 • 动物数量不一样 • 研究重点不一样
1. OCT包埋（冰冻切片） 抗原、GFP的保存，冰晶与组织形态
2. 石蜡包埋（常规切片） 抗原性包被、GFP破坏、组织形态保存
3. 树脂包埋（电镜超薄切片） 超薄切片、亚细胞分辨、抗原性包被
4. 塑料包埋（超硬切片或磨片） 特殊材料制片、细胞形态与抗原性破坏
2.1.2 冰冻切片
• 优点：脂质和抗原性得到良好保存 不需抗原修复 某些抗原会因固定包埋失活
• 用途：快速病理诊断 脂肪染色 一抗试剂的要求 多重免疫染色（荧光共定位） 精确定位和定量
2.1.2 脂肪染色
H.E.
Oil Red O
Mouse model of Atherosclerosis
C3d Heart transplant
免疫荧光与共定位
Vincunin
三维重建
Three-dimensional structure of the t-tubular system in a living rat ventricular myocyte, reconstructed from a stack of images of dextran-linked fluorescein fluorescence within the t-tubules. Bar5 m. Circ Res. 1999;84:266–275
1.2 实验动物与人的差异
• 解剖结构差异 • 动物自发疾病 • 病理反应差异 • 疾病易感性的差异
1.3 病理学评价的特点
• 不同于检验医学 • 需要研究者参与实验过程 • 病理学是描述性的、解释性的科学 • 主观性较强、必须有科学的评价方法
2.0 常用病理学技术与方法
1. 常规组织学技术 2. 免疫组织化学 3. 电子显微镜 4. 形态定量与图像分析
2. 梯度蔗糖替代 10％蔗糖/0.01M PBS 4hrs〜overnight
（15％蔗糖/0.01M PBS 4hrs〜overnight） 20％蔗糖/0.01M PBS 4hrs〜overnight
3. 吸干水分、OCT包埋、液氮冻结 4. 塑料袋或盒包装，－80℃保存 5. 冰冻切片（5～10um） 6. 风干过夜（电风扇，室温） 7. 常规染色、或密封后−30℃冰箱保存
2.1.2 冰冻切片的应用限制
• 缺点：切片质量不及石蜡切片 抗原易移位、扩散 自发荧光 特殊的切片和保存要求
• 冰晶：细胞内、外水份冻融所产生的对 细胞膜和组织结构破坏。
• 冰晶的多少与组织的水分含量和冻融的 次数成正比。
冰冻切片制作程序 1（常规研究用）
1. 小块新鲜组织（5 mm)，直接液氮冻结、或 OCT包埋后液氮冻结
实验原则 选择合适的方法、获得最好的结果
2.2.1 酶标免疫组化的优势与注意点
1. 明视野显微镜，便于形态学分析 2. 适合低倍率的组织学分析 3. 无荧光衰减，可永久保存 4. 显色底物致癌性和毒性
2.1.1 固定时间
• 固定时间（2-3mm厚、4-6h） • 灌注固定（10-20min）+后固定（4-6h）
• 固定液10倍于组织或器官大小（容器问Hale Waihona Puke Baidu）
• “固定不足”问题（自溶、切片透明染色不良， 脑及脂肪组织固定中易出现）
• “过固定”问题（抗原修复困难、福尔马林结 晶）
2.1.1 包埋方法
Movat五色套染
黑色=弹力纤维 细胞核
黄色=胶原纤维 砖红=肌纤维 蓝色=粘液 鲜红=纤维素、
红细胞、
2.2 免疫组织化学技术
1. 免疫组织化学染色的特点 2. 抗体稀释度计算 3. 鼠对鼠（MOM） 方法 4. BrdU标记与染色 5. 质控与标准化
2.2.1 免疫组织化学的特点
1. 较敏感的方法，且敏感度逐步提高 2. 定位优势，可达亚细胞水平 3. 共定位反映分子的空间关系 4. 追踪分子的动态变化（功能免疫组化）
2. 塑料袋或盒包装，－80℃保存 3. 冰冻切片（5～10um） 4. 风干过夜，或至少1小时（电风扇，室温） 5. 冷丙酮或甲醇固定10～15分钟 6. 再风干（电风扇，室温） 7. 常规染色、或密封后−30℃冰箱保存
冰冻切片制作程序 2（优化研究用）
1. 小块新鲜组织（5 mm)，4%多聚甲醛或PLP固定液 固定4小时
2.2.2 冰冻包埋的注意事项
1. 尽早冻存，避免自溶和抗原移位。 2. 组织宜小、薄，保证冻存效果。 3. 滤纸吸去水份，清除脂肪 4. 自制包埋盒（铝箔）、冰冻专用塑料盒 5. 排除气泡，抚正组织 6. 激光打印标签或记号笔标记 7. 扶正组织，确定包埋面，快速冻结
冰冻切片流程和用具
2.1.3 常用的组织学染色
• H.E • van Gieson • Elastica van Gieson (ETVG) • Masson trichrome • Elastic Masson Goldner modified • Picrosirius red • Movat pentachrome • PTAH • Oil Red O