发酵米浆中高发酵性能酵母菌和乳酸菌的筛选和鉴定
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1.2.2 菌种的筛选
1.2.2.1 酵母菌的筛选 初筛：采用毛志群等[4]的方法，将纯化后的菌种接
入放有杜氏小管的 YPD 液体培养基的试管中，30℃培 养，定时观察杜氏小管中的产气情况，筛选出产气量 最快最多的菌株。
二级筛选：参照申彤等[5]的方法，将初筛出的菌株 活化后接入 YPD 培养基中增菌培养(30℃，12h)，然后 取 6mL 接入装有 200mL YPD 液体培养基中，30℃培养， 记录失重情况，对发酵液的可溶性固形物含量、还原 糖含量、pH 值和酒精度进行分析，筛选出发酵特性最 佳的菌株。
而不规则、黏稠、突起、连片或者浅黄色、小而圆、 透明、无黏液两种。通过对其菌落形态的观察，从米
浆发酵液中共分离出 40 株具有上述特征的菌株，将其认 定为酵母菌的疑似菌株。
2.1.1 酵母菌的初级筛选 将疑似菌株进行初级筛选得到产气最快的 8 株菌
株，这些菌株产气量的实验结果见表 1。
表 1 酵母菌产气量的实验结果 Table 1 Experimental results for gas production of yeasts
化后接入 MRS 的液体培养基中，30℃培养，定时取样， 测定发酵液的 pH 值，筛选出产酸最快的菌株。
三级筛选：采用钱存柔的方法[8]，将复筛出的乳酸 菌活化后接入 MRS 的液体培养基中，30℃培养，定时 取样，以不接种的液体 M RS 培养基做空白对照，于 600nm 波长处测定发酵液 OD 值，筛选出繁殖能力最强 的菌株。
产气量越多越快表明菌株的发酵性能越好。由表 1 可知，16、17 和 21 号菌株在培养 18h 后所产气体已经 充满杜氏小管，而其他菌株均在 18h 后所产气体才能充 满杜氏小管。
2.1.2 酵母菌的二级筛选 将初筛出的酵母菌进行二级筛选，测定 CO2 失重，
发酵液中可溶性固形物含量、还原糖含量、pH 值和酒 精度，结果见表 2 。
232 2010, Vol. 31, No. 07
食品科学
※生物工程
发酵米浆中高发酵性能酵母菌和乳酸菌的 筛选和鉴定
刘 贞Байду номын сангаас刘小翠，赵思明 *，熊善柏
(华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070)
摘 要：为了实现传统米发糕的规范化工业生产，从传统米发糕的发酵米浆中筛选发酵性能较好的菌株，并进行 种属鉴定。首先从发酵米浆中分离出 40 株酵母菌的疑似菌和 30 株乳酸菌的疑似菌。经杜氏小管产气、发酵液特 性和生长曲线分析三级筛选，最终得到 1 株高发酵性能的酵母菌。经革兰氏染色等初筛、pH 值和生长曲线分析， 最终得到 1 株高发酵性能的乳酸菌。最后对两株菌株进行菌落形态观察和生理生化种属鉴定，确定分别为卡斯特酒 香酵母和植物乳杆菌。 关键词：米浆；发酵；酵母菌；乳酸菌
1.2.3 菌种的鉴定 菌株是先观察菌落形态和纯菌落的细胞形态进行初
步的鉴定。本实验采用氮源同化、碳源同化及糖发酵 实验来鉴定酵母菌的属种[9]；乳酸菌的鉴定是通过生理 生化实验和糖发酵实验确定其属种[10]。
2 结果与分析
2.1 酵母菌的筛选和鉴定 酵母菌在 PDA 平板培养基的菌落形态为黄色、大
0.042
4.16 0.895
0.15 1.13 1.76 3.06
0.065
4.91 0.252
0.11 1.05 1.55 3.05
0.088
4.83 0.264
0.12 1.04 1.56 3.14
0.081
4.85 0.020
由表 2 可知，16、17 和 21 号菌株 CO2 失重的速度 较快，发酵液中酒精度较高，分别达到 0.863%、0.905% 和 0.895%。同时可溶性固形物含量、还原糖含量较低， 其 pH 值在发酵 72h 后分别降至 4.20、4.16 和 4.16。这 说明这 3 株菌充分利用了液体培养基中的营养物质，将 糖类等可溶性物质降解为 CO2 和乙醇等。由此，确定 16、17 和 21 号菌株为复筛所得到的目标菌株。
Key words：rice slurry；fermentation；yeast；Lactobacillus
中图分类号：TS213.3；TS262.3
文献标识码：A
文章编号：1002-6630(2010)07-0232-04
米发糕是我国传统的大米发酵食品，具有独特的风 味及较高的营养价值。菌株是食品发酵过程中的关键因 素，但目前还没有人研究过米发糕发酵中的优势菌株。 在米发糕的生产中微生物的数量和菌相发生了很大的变 化，酵母菌和乳酸菌逐渐成为优势菌[1]，赋予米发糕独 特的风味和营养。传统生产米发糕常采用自然发酵或接 入老浆进行发酵，但由于发酵过程中菌种的活性和比例 容易发生变化，导致米发糕产品的质量不够稳定。为 了更好地控制米发糕的品质，本实验从传统的米浆发酵 液中筛选高发酵性能的酵母菌和乳酸菌，以期为米发糕
三级筛选：将复筛出的酵母菌活化后接入 YPD 培养 基中，28℃培养，定时称重，以不接种的液体 YPD 培 养基做空白对照，并于 600nm 波长处测定发酵液的 OD 值和 p H 值。
1.2.2.2 乳酸菌的筛选 初筛：参照卢晓莉的方法[6]，将疑似菌株进行革兰
氏染色、葡萄糖产酸、产气实验和过氧化氢酶实验。 二级筛选：采用 Greco 的方法[7]，将初筛的菌株活
※生物工程
食品科学
2010, Vol. 31, No. 07 233
取此发酵米浆进行梯度稀释至适宜浓度后，分别转入 PDA 和 MRS[2]培养基，30℃培养 48h。
挑取平皿表面的菌落较大的酵母菌疑似菌落划线接 种于 PDA 平板培养基中，挑取平皿中溶钙圈较大的乳 酸菌疑似菌落接种于 MRS 平板培养基中，分别于 30℃ 下培养 48h[3]。再分别用 PDA 和 MRS 培养基平板纯化 4 代，镜检后转斜面贮藏，得到的单菌株供下步筛选。
yeast-like strains and 30 lactobacillus-like strains were isolated from fermented rice slurry. One yeast strain with high fermen-
tation performance was finally obtained through 3-step screening process including measurement of gas production in Durham
Screening and Identification of Strains of Yeast and Lactobacillus with High Fermentation Performance from Fermented Rice Slurry
LIU Zhen，LIU Xiao-cui，ZHAO Si-ming*，XIONG Shan-bai (College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)
Abstract：In order to realize the standardization of industrial production of traditional fermented rice cake, the strains with high
fermentation performance were screened and identified from fermented rice slurry for traditional rice cake production. Totally 40
酒精 度 /%
0.16 1.10 1.63 3.11
0.114
4.83 0.325
0.70 1.63 1.84 2.70
0.040
4.20 0.863
0.46 1.66 1.87 2.76
0.042
4.16 0.905
0.11 1.09 1.70 3.07
0.107
4.86 0.205
0.68 1.69 2.13 2.69
菌株
产气量
18h
24h
36h
3
+++
+++++
+++++
16
+++++
+++++
+++++
17
+++++
+++++
+++++
20
++
+++++
+++++
21
+++++
+++++
+++++
29
+++
+++++
+++++
33
++
++++
+++++
36
++
++++
+++++
注：+ 表示 1/5 管气体，以此类推， +++++ 表示气体充满小管。
2.1.4 酵母菌种属鉴定
20kV × 2.500 10μm
图 2 21 号酵母菌的扫描电镜图(× 2500) Fig.2 Scanning electron micrograph of yeast strain No. 21 (× 2500)
由图 2 可见，21 号菌株菌落较大，呈乳白色，边
缘整齐，表面隆起，单细胞呈卵圆形，细胞长约 3 ～ 5μm，宽约 2 ～4μm。对 2 1 号菌株进行糖发酵、碳源 同化、氮源同化实验和产淀粉类物质实验确定此酵母菌 的属种，结果见表 3 。
收稿日期：2008-11-23 作者简介：刘贞(1986 —)，女，硕士研究生，主要从事食品生产过程与工艺研究。E-mail：liuz203@ webmail.hzau.edu.cn * 通信作者：赵思明(1963 —)，女，教授，博士，主要从事食品大分子功能及特性研究。E-mail：zsmjx@mail.hzau.edu.cn
strains were identified as Brettanomyces custersii and Lactobacillus plantarum based on their colonial morphology and
physiological and biochemical experiments.
表 2 酵母菌的发酵液的分析结果 Table 2 Analysis results for fermentation broth of yeasts
菌株号
3 16 17 20 21 29 33 36
CO2 失重 /g 24h 36h 72h
可溶性固形 还原糖含 物含量/% 量 /(g/mL) pH 值 /(72h)
1.8 b
1.5
1.2
0.9
16号
0.6
17号
0.3
21号
0
0
10
20
30
40
时间 /h
OD600nm
pH
4.9 c
4.8
4.7
16号 17号 21号
4.6
4.5
4.4 0
10
20
30
40
时间 /h
图 1 21 号酵母菌的生长曲线 Fig.1 Growth curves of yeasts
由图 1 可知，21 号菌株的 CO2 失重速度、OD 值增 长速度以及 pH 值下降速度最快，表明 21 号菌株的发 酵速度最快，认为 21 号菌株在这 3 株菌株中发酵特性 最佳。
的工业化生产提供实验数据。
1 材料与方法
1.1 材料 早籼米购自华中农业大学集贸市场。
1.2 菌种的分离、筛选及鉴定 1.2.1 菌株和菌种的分离
先将原料大米进行清洗，加水于 30℃浸泡 21h，浸 泡后再多次清洗，加水磨浆，将老浆接入米浆中混匀， 于 30℃恒温发酵 3h，即得米浆发酵液。采用无菌操作
tubes, characteristic analysis of fermentation broth and illustration of growth curve. One Lactobacillus strain with high fermentation
performance was also obtained through initial screening of Gram staining, pH measurement and growth curve analysis. Both
234 2010, Vol. 31, No. 07
食品科学
※生物工程
2.1.3 酵母菌的三级筛选 16、17 和 21 号菌株生长过程的 CO2 失重、OD 值
和 p H 值的变化，结果见图 1 。
CO2 失重 /g
1.8 a
1.5
1.2
0.9
16号
0.6
17号
0.3
21号
0
0
10
20
30
40
时间 /h
1.2.2.1 酵母菌的筛选 初筛：采用毛志群等[4]的方法，将纯化后的菌种接
入放有杜氏小管的 YPD 液体培养基的试管中，30℃培 养，定时观察杜氏小管中的产气情况，筛选出产气量 最快最多的菌株。
二级筛选：参照申彤等[5]的方法，将初筛出的菌株 活化后接入 YPD 培养基中增菌培养(30℃，12h)，然后 取 6mL 接入装有 200mL YPD 液体培养基中，30℃培养， 记录失重情况，对发酵液的可溶性固形物含量、还原 糖含量、pH 值和酒精度进行分析，筛选出发酵特性最 佳的菌株。
而不规则、黏稠、突起、连片或者浅黄色、小而圆、 透明、无黏液两种。通过对其菌落形态的观察，从米
浆发酵液中共分离出 40 株具有上述特征的菌株，将其认 定为酵母菌的疑似菌株。
2.1.1 酵母菌的初级筛选 将疑似菌株进行初级筛选得到产气最快的 8 株菌
株，这些菌株产气量的实验结果见表 1。
表 1 酵母菌产气量的实验结果 Table 1 Experimental results for gas production of yeasts
化后接入 MRS 的液体培养基中，30℃培养，定时取样， 测定发酵液的 pH 值，筛选出产酸最快的菌株。
三级筛选：采用钱存柔的方法[8]，将复筛出的乳酸 菌活化后接入 MRS 的液体培养基中，30℃培养，定时 取样，以不接种的液体 M RS 培养基做空白对照，于 600nm 波长处测定发酵液 OD 值，筛选出繁殖能力最强 的菌株。
产气量越多越快表明菌株的发酵性能越好。由表 1 可知，16、17 和 21 号菌株在培养 18h 后所产气体已经 充满杜氏小管，而其他菌株均在 18h 后所产气体才能充 满杜氏小管。
2.1.2 酵母菌的二级筛选 将初筛出的酵母菌进行二级筛选，测定 CO2 失重，
发酵液中可溶性固形物含量、还原糖含量、pH 值和酒 精度，结果见表 2 。
232 2010, Vol. 31, No. 07
食品科学
※生物工程
发酵米浆中高发酵性能酵母菌和乳酸菌的 筛选和鉴定
刘 贞Байду номын сангаас刘小翠，赵思明 *，熊善柏
(华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070)
摘 要：为了实现传统米发糕的规范化工业生产，从传统米发糕的发酵米浆中筛选发酵性能较好的菌株，并进行 种属鉴定。首先从发酵米浆中分离出 40 株酵母菌的疑似菌和 30 株乳酸菌的疑似菌。经杜氏小管产气、发酵液特 性和生长曲线分析三级筛选，最终得到 1 株高发酵性能的酵母菌。经革兰氏染色等初筛、pH 值和生长曲线分析， 最终得到 1 株高发酵性能的乳酸菌。最后对两株菌株进行菌落形态观察和生理生化种属鉴定，确定分别为卡斯特酒 香酵母和植物乳杆菌。 关键词：米浆；发酵；酵母菌；乳酸菌
1.2.3 菌种的鉴定 菌株是先观察菌落形态和纯菌落的细胞形态进行初
步的鉴定。本实验采用氮源同化、碳源同化及糖发酵 实验来鉴定酵母菌的属种[9]；乳酸菌的鉴定是通过生理 生化实验和糖发酵实验确定其属种[10]。
2 结果与分析
2.1 酵母菌的筛选和鉴定 酵母菌在 PDA 平板培养基的菌落形态为黄色、大
0.042
4.16 0.895
0.15 1.13 1.76 3.06
0.065
4.91 0.252
0.11 1.05 1.55 3.05
0.088
4.83 0.264
0.12 1.04 1.56 3.14
0.081
4.85 0.020
由表 2 可知，16、17 和 21 号菌株 CO2 失重的速度 较快，发酵液中酒精度较高，分别达到 0.863%、0.905% 和 0.895%。同时可溶性固形物含量、还原糖含量较低， 其 pH 值在发酵 72h 后分别降至 4.20、4.16 和 4.16。这 说明这 3 株菌充分利用了液体培养基中的营养物质，将 糖类等可溶性物质降解为 CO2 和乙醇等。由此，确定 16、17 和 21 号菌株为复筛所得到的目标菌株。
Key words：rice slurry；fermentation；yeast；Lactobacillus
中图分类号：TS213.3；TS262.3
文献标识码：A
文章编号：1002-6630(2010)07-0232-04
米发糕是我国传统的大米发酵食品，具有独特的风 味及较高的营养价值。菌株是食品发酵过程中的关键因 素，但目前还没有人研究过米发糕发酵中的优势菌株。 在米发糕的生产中微生物的数量和菌相发生了很大的变 化，酵母菌和乳酸菌逐渐成为优势菌[1]，赋予米发糕独 特的风味和营养。传统生产米发糕常采用自然发酵或接 入老浆进行发酵，但由于发酵过程中菌种的活性和比例 容易发生变化，导致米发糕产品的质量不够稳定。为 了更好地控制米发糕的品质，本实验从传统的米浆发酵 液中筛选高发酵性能的酵母菌和乳酸菌，以期为米发糕
三级筛选：将复筛出的酵母菌活化后接入 YPD 培养 基中，28℃培养，定时称重，以不接种的液体 YPD 培 养基做空白对照，并于 600nm 波长处测定发酵液的 OD 值和 p H 值。
1.2.2.2 乳酸菌的筛选 初筛：参照卢晓莉的方法[6]，将疑似菌株进行革兰
氏染色、葡萄糖产酸、产气实验和过氧化氢酶实验。 二级筛选：采用 Greco 的方法[7]，将初筛的菌株活
※生物工程
食品科学
2010, Vol. 31, No. 07 233
取此发酵米浆进行梯度稀释至适宜浓度后，分别转入 PDA 和 MRS[2]培养基，30℃培养 48h。
挑取平皿表面的菌落较大的酵母菌疑似菌落划线接 种于 PDA 平板培养基中，挑取平皿中溶钙圈较大的乳 酸菌疑似菌落接种于 MRS 平板培养基中，分别于 30℃ 下培养 48h[3]。再分别用 PDA 和 MRS 培养基平板纯化 4 代，镜检后转斜面贮藏，得到的单菌株供下步筛选。
yeast-like strains and 30 lactobacillus-like strains were isolated from fermented rice slurry. One yeast strain with high fermen-
tation performance was finally obtained through 3-step screening process including measurement of gas production in Durham
Screening and Identification of Strains of Yeast and Lactobacillus with High Fermentation Performance from Fermented Rice Slurry
LIU Zhen，LIU Xiao-cui，ZHAO Si-ming*，XIONG Shan-bai (College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)
Abstract：In order to realize the standardization of industrial production of traditional fermented rice cake, the strains with high
fermentation performance were screened and identified from fermented rice slurry for traditional rice cake production. Totally 40
酒精 度 /%
0.16 1.10 1.63 3.11
0.114
4.83 0.325
0.70 1.63 1.84 2.70
0.040
4.20 0.863
0.46 1.66 1.87 2.76
0.042
4.16 0.905
0.11 1.09 1.70 3.07
0.107
4.86 0.205
0.68 1.69 2.13 2.69
菌株
产气量
18h
24h
36h
3
+++
+++++
+++++
16
+++++
+++++
+++++
17
+++++
+++++
+++++
20
++
+++++
+++++
21
+++++
+++++
+++++
29
+++
+++++
+++++
33
++
++++
+++++
36
++
++++
+++++
注：+ 表示 1/5 管气体，以此类推， +++++ 表示气体充满小管。
2.1.4 酵母菌种属鉴定
20kV × 2.500 10μm
图 2 21 号酵母菌的扫描电镜图(× 2500) Fig.2 Scanning electron micrograph of yeast strain No. 21 (× 2500)
由图 2 可见，21 号菌株菌落较大，呈乳白色，边
缘整齐，表面隆起，单细胞呈卵圆形，细胞长约 3 ～ 5μm，宽约 2 ～4μm。对 2 1 号菌株进行糖发酵、碳源 同化、氮源同化实验和产淀粉类物质实验确定此酵母菌 的属种，结果见表 3 。
收稿日期：2008-11-23 作者简介：刘贞(1986 —)，女，硕士研究生，主要从事食品生产过程与工艺研究。E-mail：liuz203@ webmail.hzau.edu.cn * 通信作者：赵思明(1963 —)，女，教授，博士，主要从事食品大分子功能及特性研究。E-mail：zsmjx@mail.hzau.edu.cn
strains were identified as Brettanomyces custersii and Lactobacillus plantarum based on their colonial morphology and
physiological and biochemical experiments.
表 2 酵母菌的发酵液的分析结果 Table 2 Analysis results for fermentation broth of yeasts
菌株号
3 16 17 20 21 29 33 36
CO2 失重 /g 24h 36h 72h
可溶性固形 还原糖含 物含量/% 量 /(g/mL) pH 值 /(72h)
1.8 b
1.5
1.2
0.9
16号
0.6
17号
0.3
21号
0
0
10
20
30
40
时间 /h
OD600nm
pH
4.9 c
4.8
4.7
16号 17号 21号
4.6
4.5
4.4 0
10
20
30
40
时间 /h
图 1 21 号酵母菌的生长曲线 Fig.1 Growth curves of yeasts
由图 1 可知，21 号菌株的 CO2 失重速度、OD 值增 长速度以及 pH 值下降速度最快，表明 21 号菌株的发 酵速度最快，认为 21 号菌株在这 3 株菌株中发酵特性 最佳。
的工业化生产提供实验数据。
1 材料与方法
1.1 材料 早籼米购自华中农业大学集贸市场。
1.2 菌种的分离、筛选及鉴定 1.2.1 菌株和菌种的分离
先将原料大米进行清洗，加水于 30℃浸泡 21h，浸 泡后再多次清洗，加水磨浆，将老浆接入米浆中混匀， 于 30℃恒温发酵 3h，即得米浆发酵液。采用无菌操作
tubes, characteristic analysis of fermentation broth and illustration of growth curve. One Lactobacillus strain with high fermentation
performance was also obtained through initial screening of Gram staining, pH measurement and growth curve analysis. Both
234 2010, Vol. 31, No. 07
食品科学
※生物工程
2.1.3 酵母菌的三级筛选 16、17 和 21 号菌株生长过程的 CO2 失重、OD 值
和 p H 值的变化，结果见图 1 。
CO2 失重 /g
1.8 a
1.5
1.2
0.9
16号
0.6
17号
0.3
21号
0
0
10
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时间 /h